정제 된 야생형과 돌연변이 체 CFTR 단백질의 기능의 재구성 및 채널 활동 측정
Summary
여기서 설명하는 낭포 성 섬유증에 결함이 클로라이드 채널에 대한 활성을 유지 정제 야생형 및 돌연변이 CFTR 단백질의 기능적 재구성을위한 신속하고 효율적인 절차이다. CFTR 의해 매개 재구성 테오에서 요오드화 유출 채널 활성의 연구 및 작은 분자의 효과를 허용한다.
Abstract
낭포 성 섬유증 막 횡단 전도력 레귤레이터 (CFTR)는 수송의 카세트 (ABC) 상과 바인딩 ATP의 고유 채널 형성 부재이다. CFTR의 인산화 및 뉴클레오티드 종속 클로라이드 채널 활성은 전 세포 자주 시스템 및 절제된 막 패치에서 단일 채널로 검토되고있다. 많은 낭포 성 섬유증을 유발하는 돌연변이 활성이 변화하는 것으로 나타났다. 정제 프로토콜 소수 게시되었지만, 채널 활성을 유지 빠른 재구성 방법 및 정화 시스템에 인구 채널 활동을 연구하기위한 적절한 방법이 결여되어있다. 여기서 빠른 방법 규제 할라이드 채널로서의 활성을 보유 정의 지질 조성물의 테오로 정제 및 전장 CFTR 단백질의 기능적 재구성을 위해 설명된다. 함께 채널 활성의 신규 한 플럭스 계 분석법이 재구성 방법에 적합한 시스템이다야생형 CFTR의 인구 채널 특성 및 질병을 일으키는 돌연변이 F508del- 및 G551D-CFTR 공부. 구체적으로, 상기 방법은 인산화, 뉴클레오티드 및 CFTR 채널 활동에 강화제와 같은 작은 분자 억제제의 직접적인 영향을 연구하는 유틸리티를 갖는다. 방법은 또한 음이온 기판 다른 막 채널 / 수송의 연구 의무가 있습니다.
Introduction
폐, 대장, 췌장 및 땀 분비 등의 조직에서 상피 세포의 세포막에 걸쳐 염화 수송은 주로 ABC의 낭포 성 섬유증 막 횡단 전도력 레귤레이터 (CFTR), ATP- 인산화 조절 부재 (ATP-에 의해 매개된다 검토 한 막 단백질의 카세트) C 아과 ()를 바인딩. ABCC 서브 패밀리의 다른 구성원과 마찬가지로, CFTR는 뉴클레오티드 결합 도메인은 단일에 적당한 ATP 아제 활성을 갖는다 (NBDs)의 계면에서 형성된 2 개의 뉴클레오티드 결합 부위에서 ATP 결합 큰, 멀티 – 스패닝 막 관통 단백질 인 사이트. 그러나 다른 ABCC 아과 멤버는 달리, CFTR는 고유의 규제 CL 채널로보다는 활성 용질 수송로 진화하고있다.
morbi로 이어지는 CFTR 원인 낭포 성 섬유증, 폐, 위장관, 췌장 및 생식 기관을 포함한 여러 장기에 영향을 미치는 질병의 돌연변이,젊은 성인에서 dity과 사망률. 폐 질환은 일반적으로 전도성의기도 상피 표면에 CFTR 기능의 손실에 의해 발생 낭포 성 섬유증의 조기 사망에 대해 대부분의 경우에 차지한다. 호흡 섬모 상피의 선 단면 상에 유체 층을 수정 상피 표면을 가로 질러 물 운동 – CFTR 클로라이드 채널 활동의 부족 모두 CL의 감소를 야기한다. 이는 호흡 섬모 상피 세포의 기능을 손상 점성기도 표면 액체 초래기도 밖으로 효과적으로 병원체 클리어. 결과적으로, 대부분의 환자는 CF 폐 염증 및 감염으로 인한 폐 손상의 재발 발작 겪는다.
예상 한 바와 같이, 통상 CFTR 단백질의 작용 기전에 대한 연구는 주로 그 채널 게이팅 전기 생리 활성의 상세한 연구에 초점을 맞추었다. 단일 채널 연구 PKA 의존 CL 직접적 CFTR 그 기능을 보여 주었다– ATP 규제 게이트 2를 보유 채널. 연구되었다 특정 단일 채널의 특성 때문에 전체 CFTR 채널들의 모집단과 단일 채널의 반사 있는가에 대해 상세한 전기 생리학 연구 단일 CFTR 채널 1,3에 많은 정보를 제공하지만 우려가있을 수있다 결과는 항상 거시적 인구를 공부하는 방법과 함께 고려되어야한다. 정제 CFTR의 인구 채널 활동을 직접 분석은 질병 유발 돌연변이와 연관된 분자 결함에 대한 통찰을 제공하는 화학 조절제 수리 CFTR 돌연변이 단백질의 발견을 구동 할 수있는 잠재력을 갖는다. 현재까지, 낭포 성 섬유증 (4)을 야기하는 것으로 생각 CFTR 1,900 상이한 돌연변이 초과있다. 북미와 유럽에서 환자의 약 90 %에서 적어도 하나의 대립 유전자에서 발견 된 주요 돌연변이, F508del-CFTR은 단백질을 미스 폴딩 리드소포체 5 차 보유. F508del-CFTR은 결함이 채널 활동 6-9를 포함하여 다른 결과를 가지고 있습니다. 세포 표면에서 CFTR의 생성 부재 중증 질환과 연관된다. G551D-CFTR, 덜 일반적인 돌연변이가 제대로 아직 접힌 세포 표면 (6)에 염화 채널로 기능 장애하다 생각된다. 소분자 보정기 및 강화제의 개발은 각각 세포 표면 상에 존재하는 폴딩 및 / 또는 세포 표면에 F508del-CFTR 같은 돌연변이 매매 및 – 증대 보정이나 G551D 같은 돌연변이 채널 활성을 증가시키는 목적을 갖는다 . 150 mg의 CF 환자> 육년 적어도 하나의 G551D와의 모든 12 시간에서 사용되는 VX-770) 보정기 VX-809과 VX-661 (아직 환자에 사용하기 위해, 강화제 Kalydeco (ivacaftor을 승인하지 않은 상태 -CFTR 돌연변이, 그리고 최근 환자 G178R, S549N, S549R, G551S, G1244E, S1251N, S1255P 중 하나및 G1349D. Kalydeco CF는 질환의 임상 열 대책이 작은 분자의 작용하지만 저조한기구에 사용하기위한 환자의 FDA 승인시의 이해되었다 안전하고 개선 결과 모두이다.
CFTR 정제 방법 중 소수의 완료 이전에 상당한 시간을 필요로하는 많은 어느 2,11-18을 설명되었다. 최근 출판 (19), 고유 신속한 정제 및 재구성 방법은 S의 F 9 세포 발현 시스템에서 과발현 CFTR에 기술하고, 정의 된 지질 시스템에서 정제 된 단백질은 CFTR의 인구 CFTR 할라이드 채널 활성 분석법을 개발하는 데 사용 된 분자. 분석은 CFTR 기능에 인산화, 뉴클레오티드 억제제의 알려진 효과를 되풀이. 시스템의 강화제의 효과 심문을 사용 하였다 VX-770 / Kalydeco는 중량 (야생형)에, 그리고 F508del- G551D-CFTR 그리고 제 보여주는 바와약물에 인구의 관점에서 CFTR 및 뉴클레오티드와 작은 분자와 돌연변이의 상호 작용의 연구에 이러한 방법의 유용성과 적용 가능성을 입증, ATP 독립적 인 방식으로 자사의 채널 활동을 강화시키는 데 CFTR 단백질과 직접 상호 작용 시간 단백질에 대한 임상 적 질문에 대한 답변. 방법은 또한 다른 분자 강화제 및 이들의 유도체 (20)뿐만 아니라, 단백질의 활성 (21)에 작은 분자 보정기의 효과를 연구하기 위해 사용되었다.
유출 분석은 이전에 전극, 방사성 트레이서 형광체 (22, 23)를 사용하여 전체 세포 분석법, 이온 선택성 전극 (24)과 막 소체 포함 CFTR 돌연변이 활성 및 그 활성에 CFTR – 조절 성 화합물의 효과를 조사하기 위해 많은 연구에서 사용되어왔다 , 방사성 추적자 (25) 재구성 CFTR을 정제 하였다. 그러나 토륨정제 재구성 CFTR을 연구하는 이온 선택성 전극의 전자 사용은 먼저 최근 19보고되었다. 현재의 방법은 적응 재구성 녹농균, 공통 CF 병원균 두 막 단백질의 기능적 특성화를 위해 사용되어왔다. 요오드화 유출 측정과 결합 그래피 ALGE 외막 단백질의 재구성이 음이온 수송 체 (26)를 통해 알긴 분비 모델을 지원하기 위해 사용되었다. 재구성 요오드 유출 측정 모델 (27)에 의해 단백질이 세균 내막 걸쳐 지질 결합 당사슬 전좌에 대한 H + antiport 의존적 메카니즘을 제시한다고 제안 될 수 Wzx 단백질 정제에 적용 하였다. 하나는 기본 기판 예상보다 두 경우 요오드화 낮은 스루풋이라도 음이온 기판 용 대용으로 사용 하였다. 이 방법은 C와 다른 단백질에 대한 적응에 적합 할 수있다음이온 기판에 대한 ationic 전송 또는 전도 경로.
여기서 빠른 정제 절차 CFTR 단백질 및 지질의 정의 테오으로의 재구성을 위해 설명된다. 신속한 재구성 절차를 용이하게 정제에 사용되는 세제의 종류 여기에서 사용 된 방법에 의해 제거 의무 또는 재구성 절차 전에 적합한 세제 교환 될 수 있음을 제공하는 다른 방법으로 정제 CFTR 함께 사용하도록 맞추어 질 수있다. 정제 및 재구성 CFTR 단백질의 채널 활성을 측정하는 요오드화 유출 방법은 상세하게 설명되고,이 방법으로부터 얻을 수있는 몇 가지 전형적인 결과가 제시된다.
Protocol
Representative Results
Discussion
셀룰러 과발현 다양한 시스템에서, 전체 길이, 작용 성 CFTR 분리 정제를위한 프로토콜의 수가 제한되어왔다. 이 ATP 아제와 평면 이중층 단일 채널 측정을 포함한 채널 기능의 직접 측정을 포함하여 분석에 매우 기능적인 WT-CFTR 또는 적당한 양의 F508del- 및 G551D-CFTR의 높은 농축의 신속한 정화이 허용 여기에 설명 된 방법이 유리하다 작은 분자 19-21의 연구 관련성이 높은 시스템과 CFTR 인구 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 그들이 더 경쟁 금융 이익이 없다는 것을 선언합니다.
Materials
| fos-choline 14 detergent | Anatrace Affymetrix (www.anatrace.affymetrix.com) | F312 | Affymetrix: Anatrace Products; CAS# :77733-28-9 |
| cOmplete EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets | Roche (www.roche-applied-science.com) | 04 693 132 001 | EDTA-free Protease inhibitor cocktail tablets (1 in 50 ml or mini:1 in 10 mL) (Roche Diagnostics GmbH; Ref: 11873 580 001 |
| cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EDTA-free, EASYpack | Roche (www.roche-applied-science.com) | 05 892 791 001 | |
| Ni-NTA Agarose | Qaigen GmbH | 1018240 | |
| Fisherbrand Screening columns | Fisher Healthcare | 11-387-50 | |
| Amicon Ultra Centrifugal filters, Ultracel-100K | Millipore (www.millipore.com) | UFC910008 | |
| cAMP-Dependent Protein Kinase A (PKA), Catalytic Subunit | New England Biolabs (www.neb.com/products/p6000-camp-dependent-protein-kinase-pka-catalytic-subunit) | Peirce PKA is also suitable | |
| PC, Chicken Egg | Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) | 840051C | |
| POPC | Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) | 850457C | |
| PS, Porcine Brain | Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) | 840032C | (CFTR has been successfully reconstituted into Egg PC, POPC, 2:1 (w/w) Egg PC:POPC, or a mixture of PE:PS:PC:ergosterol, 5:2:2:1 (w/w)) |
| PE, Chicken Egg | Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) | 841118C | |
| Ergosterol | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | 45480 | |
| Pierce Detergent removal spin column | Thermo Scientific | 87779 | 1 ml capacity columns |
| valinomycin | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | V-0627 | |
| VX-770 (ivacaftor) | Selleck Chemicals | S1144 | |
| iodide selective microelectrode | Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/microionn.tam) | LIS-146ICM | |
| Clampex 8.1 software | Axon Instruments (www.axon.com) | we use components of the ClampX system with a home made filter to monitor and record the response to our electrode | |
| Alternate Software: ArrowLabb System | Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/ionsystems.tam) | LIS-146LICM-XS | Lazar Research sells a meter that can interface with a computer and software to record the probe response. This software should serve a similar function to our setup |
| small stir bars | Big Science Inc (www.stirbars.com) | SBM-0502-CMB | choose a stir bar small enough to easily fit into a well of a 96-well plate |
| Sephadex G50, fine | GE Health Care (www.gelifesciences.com) | 17-0042-01 | |
| Sonicator | Laboratory Supplies Co, Inc. | G112SP1G | Bath sonicators from other manufacturers should also be suitable |
References
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