Summary
Описанный здесь быстрое и эффективная процедура для функционального восстановления очищенного дикого типа и мутантного белка CFTR, который сохраняет активность в течение этого хлорида канала, который с дефектами муковисцидозом. Йодид отток из восстановленных протеолипосомах посредничестве CFTR позволяет исследования активности канала и эффекты малых молекул.
Abstract
Муковисцидоз трансмембранной проводимости регулятора (CFTR) является уникальный канал формирования член СПС связывающего кассетного (ABC) суперсемейство перевозчиков. Фосфорилирования и нуклеотидов хлорид зависит канал активности CFTR неоднократно изучается в целом клеточных системах и в качестве отдельных каналов в отделенных мембранных участков. Многие муковисцидоза, вызывающих мутации, как было показано, чтобы изменить эту деятельность. Хотя были опубликованы небольшое количество протоколов очистки, быстрый метод восстановление, который сохраняет активность канала и подходящий метод исследования активности канала населения в очищенной системе не хватало. Здесь быстрые способы описаны для очистки и функциональной восстановления в CFTR белка полной длины в протеолипосом определенного состава липидов, который сохраняет активность в регулируемом галогенида канала. Этот метод восстановление вместе с новым потока на основе анализа активности канала является подходящим для системыизучения свойств каналов населения дикого типа гена CFTR и болезнетворные мутантов F508del- и G551D-CFTR. В частности, способ имеет применение в изучении прямое воздействие фосфорилирования, нуклеотидов и малых молекул, таких как усилителей и ингибиторов на активность канала CFTR. Эти методы также поддаются изучению других мембранных каналов / транспортеры для анионных субстратов.
Introduction
Хлорид транспорта через апикальные мембраны эпителиальных клеток в таких тканях, как легких, кишечника, поджелудочной железы и потовых желез, в первую очередь при посредничестве муковисцидоза трансмембранной проводимости регулятора (CFTR), в АТФ и фосфорилирования регулируется члена ABC (АТФ связывающего кассетного) C подсемейство мембранных белков (обзор в 1). Как и другие члены подсемейства ЦКА, CFTR является большой, мульти-охватывающей интегральный мембранный белок, который связывается АТФ при двух нуклеотидных участков связывания образующихся на границе своих нуклеотидных-связывающих доменов (NBDs), где он имеет более скромные АТФазы в единый сайт. Однако, в отличие от других членов ЦКА подсемейства, CFTR превратилась в уникальный регулируемого канала Cl, а не в качестве активного растворенного транспортера.
Мутации в CFTR вызывают муковисцидоз, заболевание, поражающее многие органы, включая легкие, желудочно-кишечного тракта, поджелудочной железы и половых путей, ведущих к МорбиДЕТИ и смертности в молодых взрослых. Заболевание легких, как правило, составляет ранней смертности в кистозного фиброза и в большинстве случаев вызвано потерей функции CFTR на поверхности эпителия проводящих дыхательных путей. Отсутствие канала хлорида активности CFTR вызывает снижение как Cl - и движение воды по поверхности эпителия, чтобы изменить слой жидкости на апикальной поверхности мерцательного эпителия дыхательных путей. Это приводит к поверхности жидких, вязких дыхательных путей, что ухудшает способность ресничками дыхательных эпителиальных клеток эффективно очистить патогены из дыхательных путей. Как следствие, большинство пациентов с МВ страдают от периодических приступов инфекции легких и повреждения легких из-за воспаления.
Как и ожидалось, исследования механизма действия нормального белка CFTR сосредоточены главным образом на детальных электрофизиологических исследований его канал литниковой деятельности. Холост исследования каналов показали прямо сказать, что CFTR функции, как ПВА-зависимой Cl- Канал, который обладает регулируемой ворота АТФ 2. Подробные электрофизиологические исследования дают много информации о единичных CFTR каналов 1,3, однако могут быть беспокойство, поскольку от того, характеристики какого-либо конкретного одного канала, которая была изучена отражает всего населения CFTR каналов и, следовательно, одноканальный Результаты всегда следует рассматривать вместе с методами изучения макроскопических населения. Прямой анализ канала активности населения очищенного CFTR имеет потенциал, чтобы обеспечить понимание молекулярной дефекта, связанного с болезнетворными мутациями и управлять открытие химических модуляторов которые ремонт мутант CFTR белков. На сегодняшний день, существует свыше 1900 различных мутаций в CFTR считают причиной кистозного фиброза 4. Основным мутация, F508del-CFTR, найденный, по крайней мере одного аллеля примерно у 90% пациентов в Северной Америке и Европе приводит к белок неправильного сворачиванияУдержание й в эндоплазматический ретикулум 5. F508del-CFTR также имеет и другие последствия, в том числе деятельности 6-9 неисправен канала. Полученный отсутствие CFTR с поверхности клеток связано с тяжелого заболевания. G551D-CFTR, менее распространенной мутацией, как полагают, пока должным образом сложены дисфункциональна качестве канала хлорида в клеточной поверхности 6. Разработка малых молекул корректоров и усилителей имеет целью коррекции складывание и / или оборота мутантов, таких как F508del-CFTR на клеточной поверхности, и потенцирования или увеличение активности канала мутаций, таких как G551D, когда он присутствует на поверхности клеток, соответственно , В то время как корректоры VX-809 и VX-661 (еще не утверждены для использования в пациентов, в потенцирующее Kalydeco (ivacaftor; VX-770) используется в 150 мг каждые 12 ч у пациентов с МВ> 6 лет, по крайней мере, один G551D -CFTR мутация, а в последнее время для пациентов с одним из G178R, S549N, S549R, G551S, G1244E, S1251N, S1255Pи G1349D. Kalydeco является безопасным и приводит к улучшению клинических показателей заболевания CF 10, однако механизм действия этой маленькой молекулы плохо понимал в момент утверждения FDA для применения у пациентов.
Горстка CFTR методов очистки были описаны ранее 2,11-18, многие из которых требуется значительное время, чтобы закончить. В недавней публикации 19, уникальный быстрое очищение и восстановление метод был описан CFTR сверхэкспрессируется в S F системы 9-ячеечной экспрессии, и это очищенный белок в определенных липидных системах была использована для разработки CFTR галогенида активности канала анализа для населения CFTR Молекулы. Анализ повторяет известные эффекты фосфорилирования, нуклеотидов и ингибиторов на функцию CFTR. Система была использована, чтобы допросить эффекты потенцирующее VX-770 / Kalydeco на вес (дикого типа), F508del- и G551D-CFTR и было показано, для первогоВремя, препарат взаимодействует непосредственно с белком CFTR, чтобы усиливать свой канал активности в АТР-независимым образом, демонстрируя полезность и применимость этих методов к изучению взаимодействия CFTR и мутантов с нуклеотидов и малых молекул с точки зрения населения к ответить клинически значимых вопросы белка. Методы были также использованы для изучения других молекул потенцирующее и их производные 20, а также эффекты корректора небольшой молекулы на активность белка 21.
Отток анализы были использованы во многих исследованиях ранее для расследования деятельности CFTR мутантов и эффекты CFTR-модуляторных соединений о своей деятельности, в том числе целых клеточных анализов с использованием электродов, радиоактивные индикаторы и флуорофоры 22,23, мембранных везикул с ионоселективных электродов 24 и очищали восстановленного CFTR с помощью радиоактивной метки 25. Однако йе использование ионоселективных электродов для изучения очищенный восстановленный CFTR был первым сообщил недавно 19. Адаптация текущего метода был использован для восстановления и функциональной характеристике двух мембранных белков в синегнойной палочки, общий CF возбудителя. Восстановление очищенного Alge белком наружной мембраны в сочетании с измерениями йодида оттока были использованы для поддержки модель анионного секреции альгината через этот транспортер 26. Восстановление и измерения йодида оттока были применены к очищенной Wzx белка, что позволило модели, которые будут предложены, что предполагает H + -зависимую механизм антипорта для липидов-связаны олигосахаридов транслокации через бактериальную внутреннюю мембрану этим белком 27. В обоих случаях йодид был использован в качестве заменителя для анионного субстрата, хотя и при более низкой пропускной способности, чем можно было бы ожидать для нативным субстратом. Способ может быть пригодным для адаптации к другим белкам с Cationic транспортные или проводимости пути для анионных субстратов.
Здесь быстрая процедура очистки описан белок CFTR и его восстановления в протеолипосом с определенным липидов. Быстрое восстановление процедура может быть легко адаптированы для использования с CFTR очищенной другими способами, при условии, что тип моющего средства использовали дл очистки поддается удалению с помощью методов, используемых здесь, или может быть обменен на подходящего моющего средства перед процедурой восстановления. Йодида методом отток для измерения канала активности очищенной и восстановленного белка CFTR подробно описано и некоторые типичные результаты, которые могут быть получены из этого метода.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Очистка CFTR
ПРИМЕЧАНИЕ: Пожалуйста, табл материалов и оборудования для перечнем оборудования и материалов, используемых в этом протоколе. Подробный протокол существует для избыточной экспрессии человеческого WT-CFTR и мутантов в S F системы 9-Бакуловирусный выражения 17,28. Сверхэкспрессируют CFTR и получения гранул из S F 9 клеток в соответствии с этим протоколом.
- Сырая мембранный препарат
- Получить свежие или оттаивают замороженную S F 9 осадок клеток из культуры с 500 мл клеток, экспрессирующих более wildtype-, F508del- или G551D CFTR-белок с С-концевой Его 10 в тег, выращенных с помощью стандартных методов культуры клеток, как описано выше 17,28. Клеточные осадки будут иметь объем около 5 мл и влажную массу приблизительно 5 г.
- Ресуспендируют S F 9 клеток в 20 мл фосфатно-солевого буфера (PBS), рН 7,4, с коктейлем ингибиторов протеаз (1 таблетка на 50 мл) при 4 ° С, что обеспечиваетобразец отображено однородным и не скопления клеток не останется.
- LYSE клеток с использованием дизраптор камеру высокого давления (таблица материалов и оборудования), достигая минимума в 10 000 фунтов на квадратный дюйм (предпочтительно 15000-20000 фунтов на квадратный дюйм) в течение 2 мин за один проход. Хранить образца при 4 ° С в течение лизиса.
- Сбор образца в пробирку на льду после периода лизиса затем немедленно перезагрузить образца в клеточной нарушающими. Повторите процедуру лизиса 3 раза. Изучение под микроскопом, чтобы обеспечить менее 10% остаются нетронутыми.
Примечание: другие методы, чтобы лизировать клетки, такие как стеклянные бусы, и т.д., не были тщательно исследованы на этой системе, однако, пользователь может найти такой альтернативный способ подходит.
- Сбор образца в пробирку на льду после периода лизиса затем немедленно перезагрузить образца в клеточной нарушающими. Повторите процедуру лизиса 3 раза. Изучение под микроскопом, чтобы обеспечить менее 10% остаются нетронутыми.
- Центрифуга лизис клеток материал при 4 ° С в высокоскоростной центрифуге при 2000 мкг в течение 20 мин. Соберите супернатант и распоряжаться таблетки. Разделить супернатант из 20 трубок и центрифугировать образцы в течение 1 ч при 4 ° С в 125000 мкг в верхней части таблицы ultracentrifuge.
- Снимите и выбросьте супернатант, стараясь не потревожить осадок, и хранить пеллеты в тех же труб при температуре -80 ° С в течение менее чем за 2 месяца до использования, или сохранить на льду и продолжить очистки немедленно.
- CFTR растворение
- Получение 1-4 свежих или замороженных S F 9 сырой мембраны гранул и ресуспендируют каждый в 1 мл буфера 1 (2% ФОС -choline; таблица 1 для полного рецепта) при 4 ° С на льду, с использованием 25 G иглу и 1 мл шприц, пока раствор однородна на глаз без видимых комков клеточных мембран. Если более одного осадок будучи солюбилизированный, продолжают рассматривать каждый образец в соответствии с инструкциями для одной гранулы ниже параллельно, объединения образцов на этапе 1.3.2.
- Растворить 1 мини ингибитор протеазы таблетку в 1 мл буфера 2 (10 мМ имидазола; таблица 1), которые отсутствуют FOS -choline 14 моющее средство (ингибиторы протеазы могут 10x более гармонияпо рейтингу, чем их рекомендуемых систем разрежения в этой точке) и добавить 100 мкл до ресуспензированной сырой осадок мембран (ингибиторы протеазы находятся в рекомендуемом разведении в этой точке). Расположенный на льду в течение 45-60 мин при перемешивании инверсией 5 раз в 5 мин.
- Центрифуга ресуспендировали сырой осадок мембран в столешнице ультрацентрифуге в течение 25 мин при 125000 х г и 4 ° С. Сохранить супернатант, содержащий растворимый CFTR и отбросить гранул.
- Колонка связывания, фосфорилирование и элюирование
- Промыть 400 мкл никель-NTA (нитрилотриуксусна кислота) агарозном суспензии или эквивалент смолы 1 мл буфера 2 (10 мМ имидазола; таблица 1), которые отсутствуют моющее средство, чтобы удалить растворитель, и буфер при 4 ° С. Повторите промывку еще два раза.
- Зерноуборочный солюбилизированного CFTR, оставшийся ингибитор протеазы (900 мкл) и никеля смолы (от 400 мкл суспензии) в общей сложности 10 мл буфера с 2 (10 мМ имидазола; таблица 1) WHICH не хватает каких-либо дополнительных моющих средств. ФОС -choline 14 Концентрация эффективно разбавляют до 0,2% (вес / объем) на этом шаге. Если имеется несколько трубок, бассейн все образцы, содержащие растворенный CFTR, ингибиторы протеаз, никель-NTA смолы и 0,2% (вес / объем) ФОС -choline-14 в этой точке. Инкубировать в течение 60 мин при 4 ° С при осторожном встряхивании.
- Pass CFTR-ингибитор протеазы-никелевого раствора NTA на небольшой колонке скрининга (таблица 1) или эквивалентную пустой столбец.
- Промыть никеля NTA смолы, которая удерживается в колонке, с 4 мл на начальном осадке буфера 3 (10 мМ имидазола + DDM; таблица 1), в которой отсутствует FOS -choline 14, но содержит 1 мМ DDM (додецилмальтозид моющее средство), при 4 ° С. Добавление DDM моющего средства существенно не изменяет рН этого буфера.
- Получают раствор ПКА-MgATP добавлением 25 мкл (5 мМ, конечная концентрация) MgATP, 2500 ед цАМФ-зависимой протеинкиназы, каталитической субъединицей (РК.) с 475 мкл буфера 3 (10 мМ имидазола + DDM; таблица 1) в колонне. Фосфорилируют белки по герметизации нижнего конца колонны с колпачком или парафильмом и добавление 500 мкл раствора ПКА-MgATP для каждого начального гранул используется.
- Инкубируют при комнатной температуре (20 ° C) в течение 20 мин при осторожном перемешивании и ресуспендирования смолы с использованием 1 мл пипетки каждые 2 мин, чтобы обеспечить ПКА пришел в соприкосновение со всей поверхности никелевого NTA смолы.
- Удалить крышку и элюции раствора ПКА / MgATP из колонки. Промывают колонку 2 мл буфера 3 (10 мМ имидазола + DDM; таблица 1) при 4 ° С.
- Умножить количество гранул, используемых в эксперименте 4. Промыть колонку с таким количеством мл буфера 4 (50 мМ имидазола + DDM; таблица 1) при 4 ° С, добавлением 4 мл буфера на колонке, позволяя ей течь через и немедленно добавлением следующего 4 мл аликвоты в колонну.
- Концентрат образца белка, чтобы удалить имидазола и деградации низкого молекулярного веса продуктов с использованием устройства центрифуги фильтра (100000 молекулярная масса отсечки), как описано в таблице материалов и оборудования или других подобных устройств, в общей сложности 10 мл буфера 6 (75 мМ КИ + DDM; таблица 1) или другой буфер выбора, содержащего 1 мМ DDM (например, буфер 7 для не-йодида экспериментов оттока, 25 мМ HEPES + DDM; таблица 1), центрифугированием при 2000 х г и 4 ° С в течение около 20 мин до пробы концентратов к 200 мкл. Развести пробы до 10 мл и повторить стадии концентрирования.
ПРИМЕЧАНИЕ: В нашем опыте (не опубликовано), имидазола значительно inhiбиты с АТФ-азной активности CFTR и должны быть удалены на этой стадии путем разбавления и концентрации, по меньшей мере в два раза, если образец будет использоваться для функциональных измерений. - Сбор концентрированный очищенный CFTR. Хранить при 4 ° С в присутствии ДДС буфера до использования в течение 1-2 дней или продолжить непосредственно к стадии восстановления. Не замораживать очищенного белка, как в нашем опыте мы наблюдаем снижение активности.
2. Восстановление CFTR
- Липидный препарат
ПРИМЕЧАНИЕ: CFTR успешно восстановлен в яйцеклетку ПК, РОРС, 2: 1 (вес / вес) Яйцо ПК: РОРС (1: 1 вес / вес) смеси или смеси PE: PS: ПК: эргостерола, 5: 2 : 2: 1 (вес / вес).- Для йодида отток экспериментов, сухой 5 мг яичного PC (200 мкл 25 мг / мл наличии, смотрите таблицу материалов и оборудования) в потоке газа аргона в течение 20 мин при комнатной температуре в Pyrex или другой крепкий (без боросиликатного ) стеклянная трубка.
- Используя оптическую плотность при длине волны 280 нм, ИФАssay или другой способ, оценить концентрацию очищенного образца CFTR белка. Для йодида оттока экспериментов с дикого типа CFTR, использовать белок: липидный соотношении 1: 300-1: 3000 (вес / вес), чтобы получить устойчивый сигнал. Для G551D- и F508del-CFTR, используйте белок: липидный соотношение примерно 1: 200-1: 1200 (Вт / Вт) с целью выявления отток деятельность.
- Оптимизация белка: соотношение липид для каждой конкретной системы. Рассчитать объем очищенного белка, необходимого. Рассчитайте объем буфера с 1 мМ DDM, необходимое для конечного объема 1 мл, то есть 1 мл - (объем раствора белка требуется) = объем буфера.
- Добавить расчетный объем требуемой буферной системы с 1 мМ DDM в высушенного липида (но не добавить CFTR белка в это время) и закрыть стеклянную трубку с парафильмом. Для йодида оттока экспериментов, ресуспендируют в буфере липиды 6 (75 мМ KI + DDM; таблица 1). Для других экспериментов ресуспендируйте в буфере 8 (25 мм HEPES + DDM, смТаблица 1) или другой требуемый внутренний буфер, содержащий 1 мМ DDM.
- Вихревые в течение 2 мин при комнатной температуре, чтобы помочь в суспензии липида в буфере DDM. С другой стороны, нагрева образца до 37 ° С в течение 1-2 мин до вортексе.
- Приостановка липидов раз при комнатной температуре с помощью шприца 1 мл и иглы 25 G, пока не липидную пленку не видно на сторонах трубы. Избегайте подачи воздуха в раствор, который будет производить мелкие пузырьки и помочь в окислении йодида и липидов.
- Разрушать ультразвуком приостановлено липидов в парафильмом покрыты трубку для 20 сек взрыв в бане Sonicator, содержащей лед, а затем передать сразу на лед на 1 мин. Повторите 3 раза.
ПРИМЕЧАНИЕ: Интенсивный ультразвуком превращается йодид решения желтые из-за окисления. Поэтому во избежание чрезмерного ультразвуком. Следить за образец для изменения цвета. Если изменение цвета отмечалось, отказаться от пробы и подготовить снова. Изменение цвета в результате окисления некоторыхиодид приведет к окислению липидов в тех же условиях. Вытесняя воздух из трубки с газом аргоном до ультразвуком раствора поможет предотвратить окисление липидов и иодида. Интенсивный ультразвуком может сломать плохое качество или поцарапанные стеклянные трубки приводит к потере образца. - Добавить объем очищенной CFTR, рассчитанного на шаге 2.1.3 к ультразвуком липидной образца, чтобы достичь конечный объем 1 мл. Смешать белок с липидной и моющего раствора путем ресуспендирования в 10 раз с 25 г иглы и шприца на 1 мл.
- Набор липидов и белков образца на льду в течение 30 мин с закрученной трубки для смешивания 5 раз каждые 5 минут.
- Моющее средство связывания Подготовку колонки
- Получить одноразового использования моющим средством связывания колонку спина (табл материалов и оборудования) мощностью объема 1 мл и сломать нижней вкладки, чтобы начать колонка течет.
- Центрифуга колонку в течение 2 мин при 2000 х г дл удалени хранения бuffer, и выбросьте этот буфер.
- Добавить 5 мл буфера 7 (75 мМ KI, таблица 1) в колонну, а затем центрифуге при 200 х г в течение 4 мин, чтобы элюировать промывочный буфер. Повторите этот шаг еще 2 раза в общей сложности 3 стирок, чтобы удалить все следы буфера для хранения. Отменить все проточные.
ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно, чтобы буфер, используемый для промывки колонки не содержит DDM или любой другой моющее средство. Колонка имеет конечное связывающую способность для моющего средства и, если буфер, содержащий детергент используется колонка будет неэффективным при удалении моющего средства из образца белка липидов моющего средства. - Осторожно аликвоту все 1 мл образца липидов моющего средства белка на верхней части колонны смолы и инкубировать образец в верхней части колонны в течение 2 мин при комнатной температуре.
- Центрифуга образца при комнатной температуре в течение 4 мин при 2000 мкг и собирать облачно образец proteoliposome в чистом 1,5 или 2 мл пробирке или стеклянную трубку и поместите СэмPLE на льду.
- Собирают оставшиеся Протеолипосомы в столбце добавлением 200 мкл буфера 7 (75 мМ KI, таблица 1) или другой буфер (без моющего средства) в верхней части колонны и повторить шаг центрифугированием в течение 2 мин.
- Добавьте второй элюата образца proteoliposome, если она выглядит мутным.
- Хранить образца при 4 ° С в течение ночи или использовать непосредственно для измерения йодида оттока.
3. йодид отток Измерения для очищенной, восстановленная CFTR
- Генерация йодида градиента через мембрану proteoliposomal
- Гранулы предварительно набухают Сефадекс G50 в буфере 9 (75 мМ К-Glu; глутамата кали, таблица 1), (приблизительно 5 г сухих шарики в 50 мл буфера) или требуемый внешний буфере при комнатной температуре в течение по меньшей мере 2 ч или при 4 ° С в течение ночи.
- Подготовка 4 Sephadex G50 колонок насыщенных в буфере 9 (75 мМ K-Glu, табл 1) или другиеБуфер в маленькие колонки скрининга путем загрузки полимера, по меньшей мере, три четверти полного в колонке.
- Центрифуга в течение 4 мин при 2000 х г чтобы удалить избыточный буфер из смолы. Там должно быть примерно 2,25 мл, заполненную гидратированного полимера в колонне в конце стадии центрифугирования.
Примечание: Смола должна быть слегка увлажненной, но не погружен в жидкость и последующее краткое спина не должны элюировать значительные объемы буфера. Это имеет решающее значение для успешного элюирования proteoliposome образца, колонку со смолой не является ни слишком влажной, ни слишком сухой и пользователю может понадобиться, чтобы экспериментировать с колоннами, с тем чтобы ознакомиться с наиболее успешными условиях буфер обмена. - Осторожно добавить 125-150 мкл proteoliposome образца до верхней части каждого столбца и центрифуги в течение 4 мин при 2000 х г.
- Бассейн proteoliposome Элюаты вместе для немедленного использования в йодид оттока или других экспериментов.
ПРИМЕЧАНИЕ: элюировали объем из каждого столбца должно быть примерно150 мкл и образец должен быть несколько мутным, но меньше облачно, чем исходного образца. Большие объемы или очистить элюаты предположить, что эти поля не были в достаточной степени сушили, или были сушат слишком много, соответственно, и не приведет к успешному эксперимента йодида оттока.
- Йодид отток анализ
- Вымойте йодида селективный микро электрод (табл материалов и оборудования) широко деионизированной водой, а затем выдержать в течение 20 мин до начала эксперимента в буфере 10 (15 мкМ KI, см таблицу 1). Вымойте электрод снова широко деионизированной воды.
- Добавить 150 мкл препарата (20 мкм Типичная концентрация для получения конечной концентрации 10 мкМ в анализе) в буфере 9 (75 мМ К-Glu, таблица 1) или транспортное средство в буфере 9 к одному лунку 96-луночного планшета с небольшой бар блошиный перемешать.
- Убедитесь, что нет никаких пузырей настоящее время. Используйте наконечник пипетки, чтобы удалить бродячихпузыри. Если лекарственный раствор используется, обеспечить, чтобы конечная концентрация ДМСО в лунку составляет менее 1% (об / об) (обычно 0,1-0,2% (об / об)).
- Добавить 150 мкл восстановленного CFTR белка, который был произведен в разделе 3.1 в буфере 9 (75 мМ K-Glu, таблица 1), чтобы наилучшим образом с лекарством или буфер, чтобы получить общий объем 300 мкл в лунку планшета.
- Поместите 96-луночного планшета на мешалке и перемешивают при 130 оборотах в минуту (или при умеренной скоростью приблизительно четверть от максимальной скорости).
- Вставьте кончик йодида селективного электрода тщательно в колодец с образцом, так что чаевые не касаясь дна колодца или попадания в него мешалкой. Убедитесь, что электрод, если отдельный, также находится в контакте с раствором в скважине.
- Запись обводка с использованием самодельного или коммерческой компьютерной программы, которая взаимодействует с электродом (табл материалов и оборудования для деталей).Использование частоту дискретизации 2 Гц, с фильтрации сигнала через фильтр нижних частот.
- Разрешить образец для уравновешивания в течение 5 мин, чтобы получить устойчивое плоским или вблизи плоскую базовую во время записи.
- Добавить 3 мкл MgATP (100 мМ маточного полученного в дН 2 O и доводили до рН 7 с помощью КОН; 1 мМ конечной концентрации), в образце, чтобы активировать белок. Разрешить ~ 5 мин до достижения нового стабильный базовый уровень. Всегда регулировать рН мМ MgATP наличии 100 в нейтральное положение перед использованием, чтобы избежать изменений в рН внешнего буфера.
- Добавить 3 мкл валиномицин наличии (2 мкМ; 20 нМ конечная концентрация) для образца, чтобы шунтировать изменения в разности потенциалов, генерируемого йодида селективного проводимости через CFTR. Запишите убывающая наклон (уменьшение в мВ) из-за CFTR-опосредованного йодид оттока деятельности, по крайней мере, 5 мин.
- Чтобы гарантировать, что захват йодида в proteoliposome просвета было достаточно, добавить 3 мкл 10% (об / об) Тритон Х-100 в образце. Significanт и немедленное освобождение йодид означает, что достаточно иодида в ловушке пузырьков, так что пленение не ограничивающим фактором для изменения наклона, определенных в 3.2.9, а скорее CFTR-опосредованного деятельности.
- Вымойте электрод и мешалки тщательно деионизированной воды после обработки образцов с наркотиками или с Triton X-100, чтобы убедиться, что все следы этих реагентов были удалены, чтобы избежать загрязнения следующей пробы.
- Приготовьте серию разбавленных концентраций KI в микромолей на наномолярной диапазоне в буфере 9 (К-Glu буфера, таблица 1). Запишите ответ мВ электрода к каждой концентрации от 0 до самой высокой концентрацией подготовлены. Построить стандартную кривую, где отклик датчика (мВ) в графике против логарифма мол рной концентрации йодида. С помощью стандартной кривой, чтобы преобразовать ответ мВ зонда в течение эксперимента оттока к концентрации йодида освобожден.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте калибровочный ублюдкиве на еженедельной основе, пока пользователь не уверен в том, как быстро реакция изменений зонда. Там будет дрейф в ответ и чувствительности датчика в течение долгого времени. В качестве зонда возрастов, ответ будет деградировать. Это может быть частично отменены периодически меняя внутренние решения и обширный промывка зонда в воде после использования, что, вероятно, ограничивает сцепление молекул к поверхности зонда. - Определить средний наклон линии от концентрации в зависимости от времени для каждого участка образца proteoliposome в течение последних 30 секунд перед добавлением MgATP, и после добавления валиномицин но перед добавлением тритона Х-100. Вычтите базовый наклон от валиномицина определить CFTR-опосредованного йодид отток деятельности этого образца.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Описанные в данном письменном документе, являются методы, чтобы очистить, воссоздать и измерения регулируемого канала активность белка CFTR. Рисунок 1а показывает процесс работы для очистки, восстановления и йодида процедур отток. Методы разведения и активности канала измерений йодистым потока также показаны более подробно в соответствующем видео.
Очистка и восстановление CFTR в протеолипосомах
CFTR могут быть функционально выражены в высоких уровней в S F 9 клеток с помощью рекомбинантного бакуловируса, содержащие Вт или мутант CFTR кДНК 2. Хотя это и не млекопитающих система экспрессии, было высказано CFTR с помощью бакуловирусной систему S F 9 клеток, чтобы обеспечить высокий уровень экспрессии. Производство CFTR может быть выше, чем 1% от общего клеточного белка 17,28. S F 9- бакуловируса системы имеет то преимущество, что белок является основой гликозилированного иКачество техники управления в этой системе является относительно разрешающего таким образом, что CFTR и мутанты могут быть получены на поверхности клетки. Десять гистидин тег был разработан на карбоксиконце, чтобы очищение благодаря близости этого тега для никель-NTA. C-концевой метки помогает предотвратить взаимодействие очистки усеченных CFTR белков и доходности функциональный CFTR белка в АТФ-азы, одноканальных и йодида отток экспериментов 17,19,24,28,29. Однако протокол очистки, описанный здесь, должны быть пригодны для N-концу с тегами CFTR, а также.
Ранее было показано, что CFTR белка может быть эффективно извлечен из S F 9 плазменных мембранных препаратов с помощью NaPFO (натрия pentadecafluoro-октановой кислоты) при комнатной температуре 15. Тем не менее, восприимчивость NaPFO для осаждения при 4 ° С, температура способствует сохранению правильной уложенного белка и длительный диализ, необходимое для удаления овальное отверстие не поддается рэпID очистки и преобразование способы предназначены, чтобы максимизировать активность белка в последующих анализах функции CFTR. Оценка панели моющих средств (в том числе додецил-β-D-maltoside (DDM), 3 - [(3-холамидопропил) диметиламмонио] -1-пропансульфонат (CHAPS), FOS -choline 12 и FOS -choline 14, показали, что FOS -choline 14 был наиболее эффективными в растворении человека CFTR-His 10 из S F 9 мембран, а DDM была эффективной в поддержании АТФазы активность CFTR в растворе моющего средства (данные не показаны). Таким образом, Fos -choline 14 моющее стадию экстракции выполняется, с последующим обменом с DDM моющее средство для поддержания активности белка.
После очистки и концентрации, белковые фракции получают в DDM моющего средства, содержащего ~ 150 кДа в качестве своего основного компонента (фиг.2; серебром). Такая молекулярная масса соответствует человеческой CFTR, выраженного в S <EM> F 9cells и анализировали с помощью SDS-PAGE, где он испытывает недостаток типы комплексной гликозилирования характеристикой CFTR в клетках млекопитающих. 150 видов кДа-видимому, около 90% чистым после анализа SDS-PAGE и окрашиванием серебром. Вестерн-блоттинг с использованием M3A7 анти-CFTR антител подтверждает, что это мышиное моноклональное направлены против NBD2 реагирует с 150 кДа (фиг 2; блот). В некоторых исследованиях, следовые количества более низких рных компонентов присутствуют в незначительных полос, видимых на геле, при ~ 60 и ~ 80 кДа (данные не показаны). M3A7 анти-CFTR антитело реагирует с 60 и 80 кДа-полосы, но не реагирует с другими, не CFTR белка (данные не показаны). Это говорит о том, что нижние рные компоненты являются продукты деградации CFTR совместно очищают с помощью CFTR их С-концевой Его тега. Очистка происходит в присутствии ингибиторов протеазы и кажется, что эти компоненты присутствуют в клетках перед процедурой I очисткис выполняется. Концентрация шаг процедуры удаляет практически все загр зн ющих фрагментов низкой молекулярной массой. CFTR может быть восстановлен в этой точке, или белок из другой процедуры очистки может быть использован в протоколе восстановления.
Поток липосомальный основе анализа сообщает функциональную воссоздание населения очищенных и восстановленных молекул CFTR, как регулируется, анионоселективные каналы
Для того, чтобы определить, если значительная часть очищенного CFTR был преобразован в регулируемом канале хлорида с помощью вышеперечисленных способов, анализ потока proteoliposomal галогенид была разработана, который сообщает о деятельности населением восстановленных молекул CFTR (схематически изображенных на рисунке 1b). Если в худшем случае, большинство восстановленных молекул CFTR которые неправильно свернутых, эти молекулы не сможет придать проводимость, не различать катионов и анионови / или ворот будет не хватать регулирования со стороны РКА фосфорилирования и нуклеотидов. Ли и др. Опубликовали методы, которые позволяют оценить процент функционального восстановления мембранного белка 30.
Пустые липосомы (CFTR отсутствует) или протеолипосомы (несущие восстановленного CFTR) загружаются с KI (75 мм) и экстра-липосомной иодида обмену с глутамата кали (75 мм) путем пропускания липосом через колонку для гель-фильтрации. К. загружен протеолипосомы добавляют к хорошо содержащей К-Glu (глутамата кали), чтобы создать внешний градиент иодида и отток контролируется как увеличение extraliposomal йодида во времени с использованием иодида чувствительный микроэлектрода 24. Отток из отрицательно заряженных результатов йодида к уменьшению сигнала мВ (сигнал становится более отрицательным). Когда концентрация иодид выпущен с течением времени график, наклон инвертируется (как показано на рисунке 3), чтобы показать увеличение иодида в эксвнешнее решение с течением времени.
К-Glu был выбран в качестве противоиона impermeant как он является одним из примеров аниона, который не проходит через белка CFTR, как представляется, не вызывают значительного блокирование поры в условиях, используемых, и не вызывает помех с иодидом селективный Электрод. Анализ может быть оптимизирован вокруг другой анион, при условии, что он отвечает этим критериям. Семьдесят пять концентрации анионов мМ были выбраны опытным путем, как концентрации, которые дали хорошую захвата и достаточные сигналы для измерения в анализе в условиях, описанных. Там не будет по существу не йодид освобождение от йодо-нагруженных липосом, не имеющих функционально восстановленного CFTR, пока пузырьки не проницаемыми с моющим средством (рис 3, контроль следы), в то время как CFTR-восстановленный, йодо-загружен протеолипосомы посредником йодид выпустить в наружный раствор после добавления MgATP (1 мМ), чтобы открыть канал CFTR и валиномицин(20 нМ), чтобы предотвратить развитие мембранный потенциал (фиг.3А; см след за белка: липидный массовое соотношение 1: 3000 (вес / вес)).
Валиномицина является ионофор, что челноки калий специально через мембрану, вниз его градиента концентрации и концентрации 20 нМ было выбрано эмпирическим путем, как в высокой концентрации, которая не возмутить целостность пустой липосомы в настоящей системе. Это возможно, должны быть оптимизированы для каждой конкретной системы. Без добавления валиномицина, существует сокращенно йодида выпуск нескольких нм, который быстро достигает плато (данные не показаны). Хотя эти условия, как известно, в противном случае максимально активировать анион канала активность CFTR (как показано на рисунке 3, а), очевидно, что отсутствие значительного ответ отражает мгновенное увеличение положительного заряда intraliposomal опосредованного йодида проводимости через анионоселективную поры CFTR , сразу ограничивая ContinuПодразделения йодид отток где валиномицина не входит. Этот ответ валиномицина-опосредованной подтверждает, что иодид отток был ограничен в предыдущих экспериментах из-за накопления заряда, поддерживая анионов селективность восстановленного CFTR. Если CFTR не хватило этой селективности, как калий и йодид бы смогли отток из протеолипосомах тем самым отменяя необходимость валиномицин инициировать поток.
Концентрации йодида измеренные на этих начальных точек время были эмпирической падать в оптимальном диапазоне чувствительности для йодида чувствительного электрода, используемого. Использование других йодида электродов может потребовать оптимизации этих факторов. После достижения плато, Тритон Х-100 добавляется к проницаемыми Протеолипосомы и освободить оставшуюся в ловушке иодид. В отличие от первоначальных измерений йодида (полученных между 1 и 2 мин после валиномицин дополнение), показания на этих конечных точек не в линейном диапазоне электродных Калирасслоением кривой (данные не показаны), тем самым препятствуя точную оценку фракции липосом, из которых CFTR белка способен опосредовать иодида оттока по отношению к общему количеству липосом в исследовании, или его функционального восстановления процентов.
Скорость йодида потока отражает количество белковых молекул CFTR, вероятность открытия и унитарных проводимость каждого CFTR канала. Следовательно, скорости истечения иодида должно зависеть от количества и открытой вероятности каждой молекулы CFTR. Предсказание был протестирован в этой системе за счет увеличения числа молекул CFTR в липосомы. Отношение Активированный (фосфорилированный и MgATP обработанной) CFTR белка в липида варьируют, с отношени х от 1: 300-1: 3000 (вес / вес) (фиг.3А). Чем больше количество восстановленного CFTR присутствует в протеолипосом, тем больше скорость истечения (измеряется между 1-2 мин после валиномицин дополнение), поддерживая предсказания тшлема показатели оттока зависит от числа молекул CFTR в каждой липосомы. Скорость отток получены с использованием специфический белок: липидные показатели являются воспроизводимыми между экспериментальными дней и белковых очищения, что свидетельствует о строгости этого метода.
Скорость истечения йодида по-видимому, связана с открытой вероятности CFTR канала в этом реконструированной системе. Как PKA фосфорилирование требуется для активации CFTR 31 (и рассмотрения 32), ожидается, что будет низкий уровень йодида оттока в пузырьках, содержащих CFTR, который не был фосфорилируется экзогенного лечения PKA, где открыт вероятность низка , В протеолипосом, которые были ПКА обработанных, открытый вероятность будет значительно выше, что приводит к гораздо большей предполагаемой скорости оттока. На практике, для ПКА обработанных CFTR в присутствии 1 мМ MgATP в этой системе, скорость истечения йодида измеряется от 1:59 минут после добавления valinomycв примерно в четыре раза скорость CFTR белка подвергается MgATP но не ПКА (рис 3б). Эти данные подтверждают гипотезу о том, что ставка отток относятся к открытым канал вероятность. На практике это может быть трудно сравнивать активность в данном анализе напрямую, чтобы открыть вероятность учитывая, что другие факторы, такие как время зависимых изменений в электрохимической движущей силы будут влиять на наблюдаемую активность оттока. Читатель предупрежден, что этот анализ не является заменой для подробных отдельных записей активности канала.
Интересно, что, как правило, наблюдается низкий уровень йодида оттока по "нефосфорилированной" белка в присутствии MgATP что значительно больше, чем отток из липосом, лишенных CFTR (рис 3б, в). Такой низкий показатель может отражать базальной фосфорилирования CFTR в S F системы 9-ячеечной выражения перед очисткой 33. CFTR очищен от другого выражения противовирусныеMS может иметь различные уровни базальной фосфорилирования и, следовательно, различную остаточную активность.
Это быстрое дает протокола очистки Wt-CFTR от S F 9 клеток в ближайшем однородности, однако для F508del- и G551D-CFTR, метод лучше описать как процедуры по обогащению урана. Некоторые загрязняющие полосы наблюдаются с помощью SDS-PAGE 19, многие из которых отражают CFTR продукты распада, которые реагируют на CFTR антител и, кажется, присутствует до разрушения клеток. Воссоздание и иодид потока методы пригодны для этих обогащенных образцов клинически значимых мутантов. Как показано на фиг 3D, значительное истечение йодида измеряется как для F508del- (белка: липидов массовом соотношении примерно 1: 600) и G551D-CFTR (белка: липидов соотношении приблизительно 1: 300). В то время как оба мутанты имеют меньшее абсолютное активность, чем WT-CFTR белка (липидов: массовое соотношение 1: 1200), трудно сравнивать образцы непосредственно в качестве количественногоне может быть точным на мутантов, загрязненных деградации CFTR продукции. Однако и F508del-CFTR и G551D очищают с помощью этих методов, восстановленная и подвергали отток измерения реагировать так, как ожидается, небольших усилителей молекул (рис 4), и показать подобную функцию канала в белка, очищенного от более строгого метода очистки ПФО 19.
Канал активность очищенного и восстановленного CFTR можно модулировать, низкомолекулярные ингибиторы и усилителей
CFTR чел -172 34 является наиболее подходящим CFTR ингибитора доступна, что было показано, ингибируют вероятность открытия CFTR хлорида каналов в отдельных измерений проводимости канала 35 и ингибируют активность CFTR в других исследованиях 22,36. Как показано на рисунке 3C, скорость истечения после валиномицин дополнение значительно снижается за счет предварительной обработки с CFTR Inh UB> -172. Таким образом, этот анализ канала активности популяции очищенных и восстановленных молекул CFTR является эффективным в отчетный активности модуляторов, таких как ингибирующего лиганда CFTR INH -172.
Анализ является чувствительным и весьма применима к рассмотрению последствий малого лечения потенцирующее молекула, а также. Как показано на фиг.4, все три CFTR генотипы проверены значительно усилено активных малых усилителей молекул, таких как Kalydeco / VX-770 или VRT-532 (фиг.4С; показано G551D), в то время как неактивный аналогового не имеет никакого эффекта на иодида оттока Деятельность CFTR (только для F508del-CFTR, рисунок 4B). Анализ применим к исследованию концентрации потенцирующее зависимости, а также роли АТФ и фосфорилирования на потенцирующее-опосредованной CFTR деятельности.
27fig1highres.jpg "ширина =" 700px "/>
Рисунок 1:. Анализ конструкции и рабочего процесса (А) Рабочий процесс для работы описаны в данной публикации (В) Схематическое представление йодида эксперимента оттока.. Модифицированная версия панели В первоначально была опубликована в журнале Biological Chemistry. Экфорд, PDW; Li, C .; Ramjeesingh, M .; и Медведь, CE Муковисцидоз трансмембранной проводимости регулятора (CFTR) потенцирующее VX-770 (Ivacaftor) Открывает неполноценный канала Ворота Mutant CFTR в фосфорилирования зависит, но АТФ-независимым способом. 2012; 287: 36639-36649. © Американское общество биохимии и молекулярной биологии.
Рисунок 2:. CFTR быструю очистку дает процедура очищают Wt-CFTR белка окрашенных серебром SDS-ПААГ и ЗападERN пятном с использованием антитела M3A7 CFTR для очищенного человеческого белка Wt-CFTR в DDM моющим средством (1 мкг и 0,1 мкг для геля и промокните, соответственно), изолированных от S F 9 клеток сверхэкспресирующим в (его) 10 -tagged версию белок. Вт-CFTR (> 90% чистоты) обнаружен на 150 кДа, подходит для этого белка не хватает сложный гликозилирование. Это исследование было первоначально опубликовано в журнале Biological Chemistry. Экфорд, PDW; Li, C .; Ramjeesingh, M .; и Медведь, CE Муковисцидоз трансмембранной проводимости регулятора (CFTR) потенцирующее VX-770 (Ivacaftor) Открывает неполноценный канала Ворота Mutant CFTR в фосфорилирования зависит, но АТФ-независимым способом. 2012; 287: 36639-36649. © Американское общество биохимии и молекулярной биологии.
Рисунок 3: яodide отчеты отток анализов регулируется деятельность канала для очищенной и восстановленного белка CFTR. (А) Очищенный и фосфорилированный Вт-CFTR белка в восстановленный: липидов соотношении 1: 300 (вес / вес), 1: 1200 (вес / вес) и 1: 3000 (вес / вес) опосредует иодида отток из полости пузырька в Основная ванна с течением времени после добавлени 1 мМ MgATP и 20 нМ валиномицина. Добавление 0,1% (вес / объем) Тритон Х-100 с проницаемыми выбросов Протеолипосомы захваченных йодид в везикулы просвета в конце эксперимента. (Б) Исходное йодида отток время курс для восстановленного белка Вт-CFTR, что не было предварительно фосфорилированные. (C) Начальные скорости истечения йодида продемонстрировать зависимость наблюдаемого деятельности на функциональный белок CFTR. ПКА фосфорилирование белка требуется для значительной активности канала, который ингибируетс добавлением ингибитора CFTR, CTTR чел -172 (20 мкМ). Данные средства ± SEM; * Р <0,05, *** р <0,0001. (D) Несколько генотипы производить регулируемые сигналы CFTR в йодид оттока анализа, в том числе вес, F508del- и G551D-CFTR по сравнению с контролем. Данные средства ± SEM; * Р <0,05; *** Р <0,0004 управления против. Это исследование (части данных в панелях, C и D), была впервые опубликована в журнале Biological Chemistry. Экфорд, PDW; Li, C .; Ramjeesingh, M .; и Медведь, CE Муковисцидоз трансмембранной проводимости регулятора (CFTR) потенцирующее VX-770 (Ivacaftor) Открывает неполноценный канала Ворота Mutant CFTR в фосфорилирования зависит, но АТФ-независимым способом. 2012; 287: 36639-36649. © Американское общество биохимии и молекулярной биологии.
Рисунок 4: фосфорилирования зависит потенцирование CFTR небольшими молекулами могут быть считаны, используяйодид система отток за вес, F508del- и G551D-CFTR. (А) Вт-CFTR значительно усилено в потенцирующее VX-770 (10 мкМ), только в ПКА-фосфорилированного состояния. Данные средства ± SEM, * р <0,01 по сравнению с + ПКА-VX-770. (Б) VX-770 (10 мкМ), но не неактивным аналогом, V-09-1188 (10 мкМ), что значительно усиливает отток йодида Деятельность фосфорилированному F508del-CFTR. Данные средства ± SEM, п = 3 *** р <0,001 по сравнению с -VX-770 контроль. (С) Потенцирование G551D-CFTR по 10 мкМ VRT-532 или VX-770. Данные средства ± SEM, п = 5, ** р <0,001, *** р <0,0001 по сравнению с -VX-770 контроль. Это исследование (панели переменного тока), была впервые опубликована в журнале Biological Chemistry. Экфорд, PDW; Li, C .; Ramjeesingh, M .; и Медведь, CE Муковисцидоз трансмембранной проводимости регулятора (CFTR) потенцирующее VX-770 (Ivacaftor) Открывает неполноценный канала Ворота Mutant CFTR в фосфорилирования зависит, но ATР-независимым способом. 2012; 287: 36639-36649. © Американское общество биохимии и молекулярной биологии.
| Буфер | Имя | Содержание | pH | Отрегулируйте рН с помощью |
| Буфер 1 | 2% ФОС -choline | 2% (вес / объем) Fos -choline 14 моющее средство в 10 мМ имидазола, 25 мМ HEPES | 7,4 | Имидазол / HEPES |
| Буфер 2 | 10 мМ имидазола | 10 мМ имидазола, 25 мМ HEPES (без моющего средства) | 7,4 | Имидазол / HEPES |
| Буфер 3 | 10 мМ имидазола + DDM | 10 мМ имидазола, 25 мМ HEPES, 1 мМ додецил-β-D-maltoside | 7,4 | Имидазол / HEPES | Буфер 4 | 50 мМ имидазола + DDM | 50 мМ имидазола, 25 мМ HEPES, 1 мМ додецил-β-D-maltoside | 7,4 | Имидазол / HEPES |
| Буфер 5 | 600 мМ имидазола + DDM | 600 мМ имидазола, 25 мМ HEPES, 1 мМ додецил-β-D-maltoside | 7,4 | Имидазол / HEPES |
| Буфер 6 | 75 мм KI + DDM | 75 мМ KI, 20 мМ MOPS, 1 мМ додецил-β-D-maltoside | 7,4 | КОН |
| Буфер 7 | 75 мм KI | 75 мм KI 20 мм MOPS | 7,4 | КОН |
| Буфер 8 | 25 мМ HEPES + DDM | 25 мМ HEPES, 25 мМ NaCl, 1 мМ додецил-β-D-maltoside | 7,4 | HCl / NaOH |
| Буфер 9 | 75 мм K-Glu | 75 мм K-глутамат, 20 мМ MOPS | IGHT "> 7,4КОН / глутаминовая кислота | |
| Буфер 10 | 15 мМ KI | 15 мМ KI 20 мм MOPS | 7,4 | КОН |
В таблице 1: Таблица буферов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Там было ограниченное количество протоколов очистки на всю длину, изоляции функциональной CFTR, из множества сотовых систем избыточной экспрессии. Способ, описанный здесь, является предпочтительным, так как позволяет быстрое очищение WT-CFTR или высокой обогащения F508del- и G551D-CFTR в умеренных количествах, что является очень функциональным в анализах, включая АТФазы и прямых измерений функции канала, в том числе измерений одному каналу в плоской двухслойной системы и продемонстрировали меры функции канала население CFTR, которые весьма актуальны для исследования малых молекул 19-21. Способ очистки интегрирован в быстром и эффективном протокола восстанавливающей, однако очищенный белок от других методов может быть соединен с этим протоколом восстанавливающей, а также, при условии, что очистка моющее средство поддаются удалению аналогично.
В отличие от сложных и кропотливых отдельных экспериментов канала от возбПУРЭ мембранные участки, методы, описанные здесь, позволяют надежное и простой оценки функции канала CFTR, и однозначно эта мера сообщает функцию увеличения населения CFTR каналов вместо одного или нескольких молекул. В отличие от методов, включающих мембранные участки, этот метод позволяет непосредственно оценить эффекты малых молекул модуляторов на канале в ближайшем или полном отсутствии ассоциированных белков, в зависимости от эффективности процедуры очистки в сочетании.
Основные этапы в протоколе
Хотя есть несколько важных шагов в функциональной воссоздания CFTR для анализа потока анионов, как указано нот в Протоколе, оптимизация белка: липидный соотношение во CFTR восстановления является ключевым фактором. Такая оптимизация необходима для каждого генотипа МВТР.
Изменения и устранение проблем с техникой
Исходные разрешением мВПонсэ для зонда, используемого здесь в йодида оттока анализа с образцов, полученных, как описано, как правило, от -20 до -50 мВ. Значительные отклонения от этого диапазона свидетельствуют там могут быть проблемы с образцом. Другие датчики продаются разных производителей могут отличаться от принципов, представленную здесь. Если стабильна базовой не может быть достигнута, остаточное моющее средство или неактивным, денатурированным, плохое качество белка может быть permeabilizing пузырьки с иодидом.
Невозможность обнаружения существенного изменения в скорости валиномицин в зависимости йодида отток из липосом, содержащих фосфорилированную CFTR в присутствии MgATP может отражать несколько вопросов, все из которых должны быть расследованы. Эти вопросы включают в себя: низкое качество, частично денатурированный CFTR, или нечистый CFTR; Неполное удаление моющего средства во время восстановления; неоптимальное белок: липид соотношение в протеолипосомах; или недостаточно валиномицина добавил, что делает рассеивание заряда неполным.
Яodide отток анализы предлагает гибкость в использовании предварительно фосфорилированный CFTR белка (как описано в протоколе), или фосфорилированного CFTR во время теста. Если восстановленный белок не фосфорилируется во время процедуры очистки, образец может быть фосфорилируется в течение йодида оттока эксперимента на этапе 3.2.7, с добавлением ПВА с MgATP. В этом случае обеспечить, чтобы базовый записывается, по меньшей мере 5 мин, чтобы гарантировать, что белок был недостаточно фосфорилирован фермента РКА перед измерением функцию с добавлением валиномицина. Аналогичные результаты получены с помощью любого из этих методов.
В протоколе, молекула модулятор могут взаимодействовать с белком CFTR в течение 5 мин перед измерением активности при добавлении MgATP а затем валиномицина. Поскольку большинство CFTR модуляторы очень липофильных, это может занять время между дополнение к ванной и равновесной ассоциации с белком CFTR. Анализ не может происходить без гое добавление валиномицина, и, таким образом, нет информации теряется выполнением анализа в данном порядке. В ситуациях, когда пользователь не обеспокоен тем, что может быть временная задержка перед взаимодействием малой молекулы с белком, анализ может быть выполнен под острым добавлением модулятора после того валиномицина, в то время как еще в начальной фазе курса на измерение.
Ограничения метода
Как указывалось ранее, этот поток proteoliposomal основе анализа регулируемой деятельности канальным населением очищенных и восстановленных молекул CFTR полнометражных обеспечивает уникальный метод допроса лигандов, которые напрямую изменять активность. Тем не менее, этот способ ограничен в том, что он не обеспечивает понимание механизма, с помощью которого лиганды изменить скорость потока через CFTR. В идеале, proteoliposomal поток анализа очищенного и восстановленного CFTR должны быть использованы в сочетании с плоской кромкойID двухслойные исследования деятельности одного канала. Такое сочетание может дать представление о состоянии белка, который связывает лиганды, т.е. под открытым небом и / или закрытом состоянии.
Значение по отношению к существующим методам
Существует в настоящее время нехватка методов оценки непосредственного взаимодействия малых молекул с CFTR канала в сравнении с небольшими модуляторов молекул, которые взаимодействуют с другим клеточным компонентом косвенно изменить деятельность канал, например, через управляющую или сигнального пути или нарушение важного белок-белок взаимодействий. Способ йодида отток демонстрирует непосредственное взаимодействие с белком-либо небольшой молекулы, которая модулирует активность канала CFTR. Несмотря на низкую пропускную образом измерений, по-прежнему существуют значение в этих уникальных методов для изучения непосредственного взаимодействия CFTR с небольшими усилителей молекулы и корректоров. Многие малые moleculе модуляторы находятся в стадии разработки обеими академических групп и фармацевтической промышленности для лечения пациентов с МВ клинически, так как это основной упор текущих исследований CF. Предполагается, что методы, описанные здесь, поможет в разработке и проверке механизма действия наиболее перспективным из этих молекул.
Будущие применения техники
Методы, используемые здесь, также весьма пригодны для адаптации к другим белкам, представляющим интерес. В самом деле модификации описанных способов был использован для изучения два P. палочки мембранные белки участвуют в перемещении анионных субстратов через мембрану 26,27, что свидетельствует о полезности и универсальность этих методов. Их использование в исследовании дополнительных анионных каналов и транспортеров ожидается в будущем.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы признают, советы доктора Mohabir Ramjeesingh при разработке методов очистки, описанных здесь. Эти исследования были поддержаны Текущие гранты КСР от Канадского института исследований в области здравоохранения (CIHR) и кистозный фиброз Канады (CFC). PDWE был частично поддержана стипендий через CIHR и CFC. Авторы признают, предоставление корректора, потенцирующему и ингибитора соединений из д-р Р. Мосты (Розалинд университета медицины и науки) и распределения Муковисцидоз Фонда Therapeutics (CFFT). Авторы также признают, отличный сервис по Baylor культуре клеток среды (NIH грант P30 CA125123) в выражения Вт и мутантный белок CFTR с использованием системы бакуловируса. Неактивным VX-770 аналоговый, V-09-1188, был подарок Vertex Pharmaceuticals.
Acknowledgments
Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| fos-choline 14 detergent | Anatrace Affymetrix (www.anatrace.affymetrix.com) | F312 | Affymetrix: Anatrace Products; CAS# :77733-28-9 |
| cOmplete EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets | Roche (www.roche-applied-science.com) | 04 693 132 001 | EDTA-free Protease inhibitor cocktail tablets (1 in 50 ml or mini: 1 in 10 ml) (Roche Diagnostics GmbH; Ref: 11873 580 001) |
| cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EDTA-free, EASYpack | Roche (www.roche-applied-science.com) | 05 892 791 001 | |
| Ni-NTA Agarose | Qaigen GmbH | 1018240 | |
| Fisherbrand Screening columns | Fisher Healthcare | 11-387-50 | |
| Amicon Ultra Centrifugal filters, Ultracel-100K | Millipore (www.millipore.com) | UFC910008 | |
| cAMP-Dependent Protein Kinase A (PKA), Catalytic Subunit | New England Biolabs (www.neb.com/products/p6000-camp-dependent-protein-kinase-pka-catalytic-subunit) | Peirce PKA is also suitable | |
| PC, Chicken Egg | Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) | 840051C | |
| POPC | Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) | 850457C | |
| PS, Porcine Brain | Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) | 840032C | CFTR has been successfully reconstituted into Egg PC, POPC, 2:1 (w/w) Egg PC:POPC, or a mixture of PE:PS:PC:ergosterol, 5:2:2:1 (w/w) |
| PE, Chicken Egg | Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) | 841118C | |
| Ergosterol | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | 45480 | |
| Pierce Detergent removal spin column | Thermo Scientific | 87779 | 1 ml capacity columns |
| valinomycin | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | V-0627 | |
| VX-770 (ivacaftor) | Selleck Chemicals | S1144 | |
| iodide selective microelectrode | Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/microionn.tam) | LIS-146ICM | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Clampex 8.1 software | Axon Instruments (www.axon.com) | we use components of the ClampX system with a home made filter to monitor and record the response to our electrode | |
| Alternate Software: ArrowLabb System | Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/ionsystems.tam) | LIS-146LICM-XS | Lazar Research sells a meter that can interface with a computer and software to record the probe response. This software should serve a similar function to our setup. |
| small stir bars | Big Science Inc (www.stirbars.com) | SBM-0502-CMB | choose a stir bar small enough to easily fit into a well of a 96-well plate |
| Sephadex G50, fine | GE Health Care (www.gelifesciences.com) | 17-0042-01 | |
| Sonicator | Laboratory Supplies Co, Inc. | G112SP1G | Bath sonicators from other manufacturers should also be suitable |
References
- Kim Chiaw, P., Eckford, P. D., Bear, C. E. Insights into the mechanisms underlying CFTR channel activity, the molecular basis for cystic fibrosis and strategies for therapy. Essays Biochem. 50 (1), 233-248 (2011).
- Bear, C. E., et al. Purification and functional reconstitution of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). Cell. 68 (4), 809-818 (1992).
- Cai, Z., Sohma, Y., Bompadre, S. G., Sheppard, D. N., Hwang, T. C. Application of high-resolution single-channel recording to functional studies of cystic fibrosis mutants. Methods Mol Biol. 741, 419-441 (2011).
- Genetic Analysis Consortium. , http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr/Home.html (1989).
- Kerem, B., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: genetic analysis. Science. 245 (4922), 1073-1080 (1989).
- Yang, Y., et al. Molecular basis of defective anion transport in L cells expressing recombinant forms of CFTR. Hum Mol Genet. 2 (8), 1253-1261 (1993).
- Mendoza, J. L., et al. Requirements for efficient correction of DeltaF508 CFTR revealed by analyses of evolved sequences. Cell. 148 (1-2), 164-274 (2012).
- Rabeh, W. M., et al. Correction of both NBD1 energetics and domain interface is required to restore DeltaF508 CFTR folding and function. Cell. 148 (1-2), 150-163 (2012).
- Aleksandrov, A. A., et al. Allosteric modulation balances thermodynamic stability and restores function of DeltaF508. CFTR. J Mol Biol. 419 (1-2), 41-60 (2012).
- Ramsey, B. W., et al. A CFTR potentiator in patients with cystic fibrosis and the G551D mutation. N Engl J Med. 365 (18), 1663-1672 (2011).
- Riordan, C. R., et al. Purification and characterization of recombinant cystic fibrosis transmembrane conductance regulator from Chinese hamster ovary and insect cells. J. Biol. Chem. 270 (28), 17033-17043 (1995).
- Ryan, L., Rimington, T., Cant, N., Ford, R. C. Expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein in Saccharomyces cerevisiae. JoVE. (61), (2012).
- Ostedgaard, L. S., Welsh, M. J. Partial purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. J Biol Chem. 267 (36), 26142-26149 (1992).
- Peng, S., et al. One-step affinity isolation of recombinant protein using the baculovirus/insect cell expression system. Protein Expr Purif. 4 (2), 95-100 (1993).
- Ramjeesingh, M., et al. A novel procedure for the efficient purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). Biochem J. 327 (1), 17-21 (1997).
- Rosenberg, M. F., Kamis, A. B., Aleksandrov, L. A., Ford, R. C., Riordan, J. R. Purification and crystallization of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). J Biol Chem. 279 (37), 39051-39057 (2004).
- Ramjeesingh, M., et al. Purification and reconstitution of epithelial chloride channel cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Methods Enzymol. 294, 227-246 (1999).
- Sorscher, E. J., Sommerfelt, M. A. Purification of recombinant protein derived from the baculovirus expression system using glutathione affinity agarose. Methods Mol Biol. 3, 337-348 (1995).
- Eckford, P. D., Li, C., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) potentiator VX-770 (ivacaftor) opens the defective channel gate of mutant CFTR in a phosphorylation-dependent but ATP-independent manner. J Biol Chem. 287 (44), 36639-36649 (2012).
- Alkhouri, B., et al. Synthesis and properties of molecular probes for the rescue site on mutant cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. J Med Chem. 54 (24), 8693-8701 (2011).
- Eckford, P. D., et al. VX-809 and Related Corrector Compounds Exhibit Secondary Activity Stabilizing Active F508del-CFTR after Its Partial Rescue to the Cell Surface. Chem Biol. 21 (5), 666-678 (2014).
- Kim Chiaw, P., Wellhauser, L., Huan, L. J., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. A chemical corrector modifies the channel function of F508del-CFTR. Mol.Pharmacol. 78 (3), 411-418 (2010).
- Verkman, A. S., Galietta, L. J. Chloride channels as drug targets. Nat Rev Drug Discov. 8 (2), 153-171 (2009).
- Pasyk, S., Li, C., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. Direct interaction of a small-molecule modulator with G551D-CFTR, a cystic fibrosis-causing mutation associated with severe disease. Biochem J. 418 (1), 185-190 (2009).
- Norez, C., et al. Determination of CFTR chloride channel activity and pharmacology using radiotracer flux methods. J Cyst Fibros. 3 (2), 119-121 (2004).
- Whitney, J. C., et al. Structural basis for alginate secretion across the bacterial outer membrane. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (32), 13083-13088 (2011).
- Islam, S. T., et al. Proton-dependent gating and proton uptake by Wzx support O-antigen-subunit antiport across the bacterial inner membrane. mBio. 4 (5), e00678-e00613 (2013).
- Ramjeesingh, M., et al. Ch. 16. Reliable Lab Solutions: Essential Ion Channel MethodsReliable Lab Solutions. Conn, P. M. , Academic Press. 337-357 (2010).
- Wellhauser, L., et al. A small-molecule modulator interacts directly with deltaPhe508-CFTR to modify its ATPase activity and conformational stability. Mol Pharmacol. 75 (6), 1430-1438 (2009).
- Lee, S. Y., Letts, J. A., MacKinnon, R. Functional reconstitution of purified human Hv1 H+ channels. J Mol Biol. 387 (5), 1055-1060 (2009).
- Chang, X. B., et al. Protein kinase A (PKA) still activates CFTR chloride channel after mutagenesis of all 10 PKA consensus phosphorylation sites. J. Biol. Chem. 268 (15), 11304-11311 (1993).
- Gadsby, D. C., Nairn, A. C. Regulation of CFTR Cl- ion channels by phosphorylation and dephosphorylation. Adv.Second Messenger Phosphoprotein Res. 33, 79-106 (1999).
- Li, C., et al. ATPase activity of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. J Biol Chem. 271 (45), 28463-28468 (1996).
- Ma, T., et al. Thiazolidinone CFTR inhibitor identified by high-throughput screening blocks cholera toxin-induced intestinal fluid secretion. J Clin Invest. 110 (11), 1651-1658 (2002).
- Kopeikin, Z., Sohma, Y., Li, M., Hwang, T. C. On the mechanism of CFTR inhibition by a thiazolidinone derivative. J Gen Physiol. 136 (6), 659-671 (2010).
- Wang, X. F., Reddy, M. M., Quinton, P. M. Effects of a new cystic fibrosis transmembrane conductance regulator inhibitor on Cl- conductance in human sweat ducts. Exp Physiol. 89 (4), 417-425 (2004).
