Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Funksjonell tilberedning og Channel Aktivitet Målinger av Renset villtype og Mutant CFTR Protein

Published: March 9, 2015 doi: 10.3791/52427
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3
1Programme in Molecular Structure and Function, Hospital for Sick Children, 2Department of Biochemistry, University of Toronto, 3Department of Physiology, University of Toronto

Summary

Beskrevet her er en hurtig og effektiv fremgangsmåte for funksjonell rekonstitusjon av renset villtype og mutant CFTR protein som bevarer aktivitet for dette klorid kanal, som er defekte i cystisk fibrose. Jodid utstrømming fra rekonstituerte proteoliposomes mediert av CFTR tillater studier av kanal aktivitet og effekter av små molekyler.

Abstract

Den Cystisk fibrose transmembran Conductance Regulator (CFTR) er en unik kanal dannende medlem av ATP Binding Kassett (ABC) super av transportører. Kanalen aktivitet av CFTR fosforylering og nucleotide avhengig klorid er ofte studert i hele cellesystemer og som enkeltkanaler i utskårende membran patcher. Mange cystisk fibrose-forårsakende mutasjoner er blitt vist å endre denne aktivitet. Mens et lite antall renseprotokoller er blitt publisert, har en rask metode for rekonstituering som beholder kanalaktivitet, og en egnet metode for å studere kanal populasjon aktivitet i et renset system er mangelfull. Her hurtige metoder er beskrevet for rensing og funksjonell rekonstitusjon av full-lengde proteinet CFTR inn proteoliposomes med definert lipid sammensetning som beholder aktivitet som et regulert halogenid kanal. Denne tilberedning fremgangsmåte sammen med en ny fluks-baserte analysen av kanalaktivitet er et egnet system forstudere kanal befolkning egenskapene til villtype CFTR og sykdomsfremkallende mutanter F508del- og G551D-CFTR. Konkret har metoden verktøyet i å studere de direkte virkningene av fosforylering, nukleotider og små molekyler som potensiatorer og hemmere på CFTR kanal aktivitet. Metodene er også mottagelig for studiet av andre membran kanaler / transportører for anioniske underlag.

Introduction

Klorid transport over de apikale membraner av epitelceller i slike vev som lunge, tarm, bukspyttkjertel og svettekjertler er i hovedsak mediert av Cystisk fibrose transmembran Conductance Regulator (CFTR), en ATP- og fosforylering regulert medlem av ABC (ATP- bindende kassett) C familien av membran proteiner (anmeldt i 1). I likhet med andre medlemmer av subfamilien ABCC er CFTR et stort, multi strekker seg integrert membranprotein som binder ATP ved to nukleotid-bindingsseter som dannes ved grenseflaten av de nukleotid-bindende domener (NBDs), hvor det har beskjeden ATPase-aktivitet på en enkelt nettstedet. Imidlertid, i motsetning til andre ABCC subfamilien medlemmer, har CFTR utviklet seg som en unik regulert Cl kanal i stedet for som et aktivt oppløst stoff transportør.

Mutasjoner i CFTR årsaken Cystisk fibrose, en sykdom som påvirker flere organer, inkludert lungene, fordøyelsessystem, bukspyttkjertel og skjede, som fører til morbidity og dødelighet hos unge voksne. Lungesykdom utgjør typisk for tidlig dødelighet i cystisk fibrose, og i de fleste tilfellene er forårsaket av tap av funksjons CFTR på overflaten epitelet av de ledende luftveier. Mangelen på CFTR kloridkanal-aktivitet fører til en reduksjon i både Cl - og vann bevegelse over overflaten epitel for å modifisere fluid-lag på den apikale overflate av prikk respiratorisk epitel. Dette resulterer i en viskøs luftveisoverflatevæske som svekker evnen til cilierte respiratoriske epitel-celler for effektivt å klare patogener ut av luftveiene. Som en konsekvens av de fleste CF-pasienter lider av tilbakevendende anfall av lungebetennelse og lungeskade på grunn av betennelse.

Som forventet, studier av virkningsmekanismen til den normale proteinet CFTR primært fokusert på detaljerte elektrofysiologiske studier av dens kanal gating aktivitet. Enkeltkanal studier har vist direkte at CFTR fungerer som en PKA-avhengig Cl- Kanal som besitter en ATP regulert gate 2. Detaljelektrofysiologiske studier gir en god del informasjon om enkelt CFTR kanaler 1,3, men det kan være bekymring med hensyn til om egenskapene til en bestemt enkelt kanal som har blitt studert er reflekterende av hele befolkningen i CFTR kanaler og derfor enkelt kanal Resultatene bør alltid vurderes sammen med metoder for å studere den makroskopiske befolkningen. Direkte analyse av befolkningen kanal aktivitet av renset CFTR har potensial til å gi innsikt i den molekylære defekter forbundet med sykdomsfremkallende mutasjoner, og for å drive oppdagelsen av kjemiske modulatorer som reparerer mutant CFTR proteiner. Til dags dato er det i overkant av 1900 forskjellige mutasjoner i CFTR tenkt å forårsake Cystisk fibrose 4. Den store mutasjon, F508del-CFTR, funnet på minst ett allel i ca 90% av pasientene i Nord-Amerika og Europa fører til protein misfolding ennd oppbevaring i det endoplasmatiske retikulum 5. F508del-CFTR har også andre konsekvenser, herunder defekt kanal aktivitet 6-9. Den resulterende mangel på CFTR fra celleoverflaten er assosiert med alvorlig sykdom. G551D-CFTR, en mindre vanlig mutasjon, er antatt å være riktig foldet ennå er dysfunksjonell som et klorid kanal på celleoverflaten 6. Utviklingen av småmolekylære correctors og potensiatorer har som mål å korrigere folding og / eller salg av mutanter som F508del-CFTR til celleoverflaten, og potensierende eller økende kanalaktiviteten av mutasjoner som G551D når de er tilstede på celleoverflaten, henhold . Mens correctors VX-809 og VX-661 (ennå ikke er godkjent for bruk hos pasienter, forsterkeren Kalydeco (ivacaftor, VX-770) blir brukt på 150 mg hver 12. time i CF-pasienter> 6 år med minst ett G551D -CFTR mutasjon, og mer nylig for pasienter med en av G178R, S549N, S549R, G551S, G1244E, S1251N, S1255Pog G1349D. Kalydeco er både sikker og resulterer i forbedring av de kliniske mål på sykdoms CF 10, men mekanismen for virkningen av denne lille molekylet er dårlig forstått ved tidspunktet for FDA-godkjenning for anvendelse i pasienter.

En håndfull av CFTR rensemetoder har blitt beskrevet tidligere 2,11-18, mange av dem krever en betydelig lengre tid å fullføre. I en nylig publikasjon 19, ble et unikt hurtig rensing og rekonstituering metoden beskrevet for CFTR overuttrykt i S f 9 celle-ekspresjonssystem, og dette renset protein i definert lipid-system ble benyttet for å utvikle en CFTR halogenid kanalaktivitet assay for en populasjon av CFTR molekyler. Analysen sammenfatter de kjente effektene av fosforylering, nukleotider og hemmere på CFTR funksjon. Systemet ble benyttet for å undersøke effektene av potensiator VX-770 / Kalydeco på vekt- (vill-type), F508del- og G551D-CFTR, og det ble vist for den førstetid at stoffet samhandler direkte med CFTR protein for å forsterke sin kanal aktivitet i en ATP-uavhengig måte, demonstrere nytteverdi og anvendelse av disse metodene til studiet av samspillet mellom CFTR og mutanter med nukleotider og små molekyler fra en befolkning perspektiv til besvare klinisk relevante spørsmål om protein. Metodene er også blitt anvendt for å studere andre potensiator molekyler og deres derivater 20, så vel som effekten av et lite molekyl korrigerings på aktiviteten av proteinet 21.

Efflux-analyser er blitt brukt i mange studier som tidligere for å undersøke aktiviteten av CFTR mutanter og effektene av CFTR-modulerende forbindelser på sin aktivitet, inkludert hele celleanalyser ved bruk av elektroder, radioaktive tracere og fluoroforer 22,23, membranvesikler med ioneselektive elektroder 24 og renset rekonstituert CFTR med radioaktive tracere 25. Men the bruk av ion selektive elektroder for å studere renset rekonstituert CFTR først ble rapportert nylig 19. En tilpasning av den aktuelle metode er blitt anvendt til rekonstituering og funksjonell karakterisering av to membranproteiner i Pseudomonas aeruginosa, en vanlig CF patogen. Tilberedning av renset Alge ytre membran protein kombinert med iodide utstrømningshastigheter målinger ble brukt til å støtte en modell for anioniske alginat sekresjon gjennom denne transporter 26. Rekonstitusjon og jodid-avgivelses målinger ble påført på rensede Wzx protein, noe som tillot en modell til å bli foreslått som antyder en H + -avhengig antiport mekanisme for lipid-tilknyttet oligosakkarid translokasjon over den indre bakterielle membranen ved dette proteinet 27. I begge tilfeller ble jodid anvendt som et surrogat for den anioniske substrat, om enn ved lavere gjennomstrømning enn man kunne vente av et naturlig substrat. Fremgangsmåten kan være egnet for tilpasning til andre proteiner med cationic transport eller ledningsforstyrrelser for anioniske underlag.

Her en hurtig renseprosedyre er beskrevet for CFTR-proteinet og dets tilberedning til proteoliposomes med definert lipid. Den raske omdanningsprosedyren kan lett bli tilpasset for bruk med CFTR renset ved hjelp av andre metoder, forutsatt at den type av vaskemiddel som brukes i rensingen er mottagelig for fjerning av de metoder som brukes her, eller kan byttes ut med et egnet vaskemiddel før omdanningsprosedyren. Den jodid efflux fremgangsmåte for måling av kanalaktivitet av renset og rekonstituert CFTR-proteinet er beskrevet i detalj, og noen typiske resultater som kan oppnås fra denne fremgangsmåten er presentert.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Rensing av CFTR

MERK: Vennligst se tabell av materialer og utstyr for en liste over utstyr og materialer som brukes i denne protokollen. En detaljert protokoll eksisterer for overekspresjon av human-CFTR Wt og mutanter i S f 9-baculovirus ekspresjonssystem 17,28. Overuttrykke CFTR og forberede pellets av S f ni celler i henhold til denne protokollen.

  1. Crude membran forberedelse
    1. Oppnå en fersk eller tine frosne S f 9 cellepelleten fra en 500 ml kultur av celler overuttrykkende wildtype-, F508del- eller G551D CFTR-protein med en C-terminal Hans 10 -tag, dyrket ved standard celledyrkningsmetoder, som beskrevet tidligere 17,28. Cellepelleter vil ha et volum på omtrent 5 ml og en våtvekt på ca. 5 g.
    2. Resuspender S f 9-celler i 20 ml fosfat-bufret saltvann (PBS) pH 7,4 med protease inhibitor cocktail (en tablett pr 50 ml) ved 4 ° C, som sikrerprøven vises visuelt homogen og ingen klumper av celler forblir.
    3. Lyses celler ved hjelp av en høytrykks celle disruptor (tabell av materialer og utstyr), og nådde et minimum på 10.000 psi (fortrinnsvis 15.000-20.000 psi) for 2 min per passering. Holde prøven ved 4 ° C i løpet av lysis.
      1. Samle prøven i et rør på is etter at lyseperioden deretter umiddelbart laste prøven i cellen disruptor. Gjenta lyseprosedyren tre ganger. Undersøke under et mikroskop for å sikre at mindre enn 10% forblir intakt.
        Merk: Andre metoder for å lysere cellene, slik som glasskuler, etc. er ikke strengt kontrollert for dette system, men en bruker kan finne en slik alternativ metode egnet.
    4. Sentrifuger cellelyse materiale ved 4 ° C i en høyhastighets-sentrifuge ved 2000 xg i 20 min. Samle supernatanten og kast pelleten. Fordel supernatanten mellom 20 rørene og sentrifugere prøvene i 1 time ved 4 ° C ved 125.000 xg i en bordplate ultracentrifuge.
    5. Fjern og kast supernatanten, være forsiktig for ikke å forstyrre pelleten, og lagre pellets i de samme rørene ved -80 ° C for mindre enn to måneder før bruk, eller beholde på is og fortsette med rensing umiddelbart.
  2. CFTR solubilization
    1. Skaffe 1-4 friske eller frosne S f 9 rått membranpellets og resuspender hver i 1 ml buffer 1 (2% fos -choline; se tabell 1 for fullstendig oppskrift) ved 4 ° C på is, ved å bruke en 25 G nål og en ml sprøyte inntil løsningen er homogen ved øyet uten synlige cellemembran klumper. Dersom mer enn en pellet blir oppløseliggjort, fortsetter å behandle hver prøve i henhold til instruksjonene for en enkelt pellet nedenfor i parallell, pooling prøvene ved trinn 1.3.2.
    2. Oppløse en mini proteasehemmer tablett i 1 ml buffer 2 (10 mM imidazoli se tabell 1) som mangler fos -choline 14 vaskemiddel (proteasehemmere er 10x mer concentvurdert enn deres anbefalte fortynning på dette punkt) og tilsett 100 ul til den resuspenderte pellet urene membran (proteasehemmere er på sitt anbefalte fortynning på dette punkt). Satt på is i 45-60 min med miksing av inversjon fem ganger hver 5 min.
    3. Sentrifuger resuspendert rå membran pellet i en bordplate ultrasentrifuge i 25 minutter ved 125 000 x g og 4 ° C. Beholde supernatanten, som inneholder oppløst CFTR og kast pelleten.
  3. Kolonne binding, fosforylering og eluering
    1. Vask 400 ul av nikkel-NTA (nitrilotrieddiksyre) agarose slurry eller tilsvarende harpiks med 1 ml buffer 2 (10 mM imidazol; se tabell 1) som mangler detergent, for å fjerne løsningsmiddel og buffer ved 4 ° C. Gjenta vask to ganger mer.
    2. Kombiner oppløseliggjort CFTR, resterende protease inhibitor (900 ul) og nikkel-harpiks (fra 400 ul slurry) til en total på 10 ml med Buffer 2 (10 mM imidazol; se tabell 1) which mangler noen ekstra vaskemiddel. De fos -choline 14 konsentrasjon blir effektivt fortynnet til 0,2% (vekt / volum) ved dette trinnet. Hvis det er flere rør, basseng alle prøver inneholdende solubilisert CFTR, proteaseinhibitorer, nikkel-NTA-harpiks og 0,2% (w / v) fos -choline-14 ved dette punktet. Inkuber i 60 min ved 4 ° C med forsiktig risting.
    3. Passere CFTR-proteaseinhibitor-nikkel-NTA-løsning ned en liten screening kolonne (tabell 1) eller en tilsvarende tom kolonne.
    4. Vask nikkel NTA harpiks som holdes tilbake i kolonnen, med 4 ml per første pellet av Buffer 3 (10 mM imidazol + DDM; se tabell 1) som mangler fos -choline 14, men inneholder 1 mM DDM (dodecyl maltosid vaskemiddel), ved 4 ° C. Tilsetning av DDM vaskemiddel ikke vesentlig endre pH i denne bufferen.
    5. Forbered PKA-MgATP-løsning ved tilsetning av 25 pl (5 mM, sluttkonsentrasjon) av MgATP, 2500 U av cAMP-avhengig proteinkinase A, katalytisk subenhet (PKA) til 475 mL buffer 3 (10 mM -imidazol + DDM, se tabell 1) til kolonnen. Fosforylere protein ved å forsegle den nedre ende av kolonnen med en hette eller Parafilm, og tilsetning av 500 ul av PKA-MgATP løsning for hver første pellet anvendt.
    6. Inkuber ved romtemperatur (20 ° C) i 20 minutter med forsiktig blanding, og resuspensjon av harpiksen ved bruk av en 1 ml pipette hvert 2 min for å sikre at PKA er kommet i kontakt med hele overflaten av nikkel-NTA-harpiks.
    7. Fjerne hetten og eluere PKA / MgATP løsningen fra kolonnen. Vask kolonnen med 2 ml av buffer 3 (10 mM imidazol + DDM; se tabell 1) ved 4 ° C.
    8. Multiplisere antall pellets som brukes i eksperimentet ved 4. Vask kolonnen med dette antall ml Buffer 4 (50 mM imidazol + DDM; se tabell 1) ved 4 ° C, ved tilsetning av 4 ml buffer til kolonnen, slik at den til å strømme gjennom og umiddelbart tilsette de neste 4 ml alikvot til kolonnen.
      9. tabell 1) ved 4 ° C pr første pellet anvendt gjennom kolonnen, 1 ml på en gang uten en pause for å tillate at kolonnen for å tørke, og samle hele eluatet inneholdende renset CFTR i et enkelt rør.
    9. Konsentrer proteinprøve for å fjerne imidazol og lav molekylvekt degraderingsprodukter ved hjelp av en sentrifuge filteranordning (100,000 molekylvekt cut-off), slik som beskrevet i tabell av materialer og utstyr, eller annen lignende anordning, i totalt 10 ml Buffer 6 (75 mM KI + DDM; se tabell 1) eller en annen buffer valginneholdende 1 mM DDM (for eksempel buffer 7 for ikke-jodid-avgivelsesforsøk, 25 mM HEPES + DDM; se tabell 1), ved sentrifugering ved 2000 x g og 4 ° C i 20 minutter før prøven konsentreres til 200 pl. Fortynn prøve til 10 ml og gjenta konsentrasjonstrinnet.
      MERK: I vår erfaring (upublisert), -imidazol betydelig inhibits ATPase aktiviteten til CFTR og bør fjernes på dette trinn ved fortynning og konsentrasjon i det minste to ganger hvis prøven skal benyttes til funksjonelle målinger.
    10. Samle konsentrert renset CFTR. Hold ved 4 ° C i nærvær av DDM buffer til bruk innen 1-2 dager eller fortsette videre umiddelbart til tilberedning trinn. Ikke fryse renset protein, som i vår erfaring vi observerer redusert aktivitet.

2. Tilberedning av CFTR

  1. Lipidpreparatet
    MERK: CFTR har blitt rekonstituert i Egg PC, POPC, 2: 1 (w / w) Egg PC: POPC (1: 1 w / w) blanding, eller en blanding av PE: PS: PC: ergosterol, 5: 2 : 2: 1 (w / w).
    1. For iodide efflux eksperimenter, tørr 5 mg Egg PC (200 mL av 25 mg / ml lager, se tabell av materialer og utstyr) under en strøm av argon gass i 20 min ved romtemperatur i en Pyrex eller annen solid (ikke-borosilicate ) glassrør.
    2. Ved hjelp av absorbans ved 280 nm, en ELISA-enssay eller annen metode, beregne konsentrasjonen av det rensede proteinet CFTR prøven. For jodid efflux eksperimenter med villtype CFTR, bruker et protein: lipid-forhold på 1: 300 til 1: 3000 (v / v) for å frembringe et tilstrekkelig signal. For G551D- og F508del-CFTR, bruke et protein: lipidforholdet på ca 1: 200-1: 1200 (w / w) for å påvise utstrømming aktivitet.
    3. Optimalisere protein: lipidforholdet for det enkelte system. Beregn volum av renset protein nødvendig. Beregn volum buffer med 1 mM DDM som kreves for å lage et endelig volum på 1 ml, dvs. 1 ml - (volum av proteinet som er nødvendig) = volum av buffer.
      1. Legg det beregnede volumet av ønsket buffersystem med 1 mM DDM til tørket lipid (men ikke legg CFTR protein på dette tidspunktet) og dekke glassrør med Parafilm. For iodide efflux eksperimenter, suspender lipider i buffer 6 (75 mM KI + DDM, se tabell 1). For andre eksperimenter suspendere i Buffer 8 (25 mM HEPES + DDM, seTabell 1), eller en annen ønsket intern buffer inneholdende 1 mM DDM.
      2. Vortex i 2 minutter ved romtemperatur for å hjelpe til med suspensjonen av lipidet i DDM buffer. Alternativt kan varme opp prøven til 37 ° C i 1-2 min før virvling.
    4. Suspen lipidet gjentatte ganger ved romtemperatur med en 1 ml sprøyte og 25 G nål inntil ingen lipidfilmen er synlig på begge sider av røret. Unngå å injisere luft inn i løsningen, som vil produsere fine bobler, og hjelpe til oksydasjon av jodid og lipider.
    5. Sonikere suspendert lipid i Parafilm dekket røret for en 20 sek briste i et bad inneholdende sonikator is, og deretter overføre på is i 1 minutt. Dette gjentas 3 ganger.
      MERK: Intens sonikasjon slår iodide løsninger gule grunn av oksidasjon. Derfor unngå overdreven sonikasjon. Overvåke prøven for fargeendringer. Hvis en fargeendring er kjent, kast prøven og forberede igjen. Endringen i farge på grunn av oksydasjon av noe avjodidet ville resultere i oksydasjon av lipidene under de samme betingelser. Fortrenge luften fra røret med argongass før sonicating løsningen vil bidra til å hindre oksidasjon av lipider og jodid. Intens sonikasjon kan bryte dårlig kvalitet eller ripete glassrør som resulterer i tap av prøven.
    6. Legg volumet av renset CFTR beregnet i trinn 2.1.3 til sonikert lipid prøven til en oppnå et sluttvolum på 1 ml. Bland protein med lipid og vaskemiddel ved resuspensjon 10 ganger med en 25 G nål og 1 ml sprøyte.
    7. Sett lipid- og proteinprøve på is i 30 min under omvirvling av røret for å blande 5 ganger hver 5 min.
  2. Vaskemiddel-bindende kolonne forberedelse
    1. Skaff en engangsbruk kommersiell vaskemiddel bindende spin kolonne (se tabell av materialer og utstyr) med en 1 ml volumkapasitet og bryte den nederste kategorien for å starte kolonne flyter.
    2. Sentrifuger kolonnen i 2 minutter ved 2000 x g for å fjerne lagrings bUffer, og kast denne bufferen.
    3. Tilsett 5 ml buffer 7 (75 mM KI, se tabell 1) til kolonnen, og deretter sentrifugeres ved 200 x g i 4 min for å eluere vaskebuffer. Gjenta trinn 2 ganger for totalt 3 vasker for å fjerne alle spor av lagringsbuffer. Kast all gjennomstrømning.
      MERK: Det er viktig at bufferen brukes til å vaske kolonnen IKKE inneholde DDM eller annen vaskemiddel. Kolonnen har en begrenset bindingskapasitet for vaske- og hvis en buffer inneholdende detergent blir benyttet, vil søylen være ineffektive ved fjerning av detergent fra protein-lipid-detergentprøve.
    4. Nøye alikvot alle 1 ml av lipid-detergent-proteinprøve på toppen harpiks av kolonnen og inkuberes prøven ved toppen av kolonnen i 2 minutter ved romtemperatur.
    5. Sentrifugere prøven ved romtemperatur i 4 minutter ved 2000 xg og samle den uklare proteoliposome prøven i en ren 1,5 eller 2 ml mikrosentrifugerør eller et glassrør og plasser sample på is.
    6. Utlevering rester proteoliposomes i kolonnen ved å tilsette 200 ul av buffer 7 (75 mM KI, tabell 1) eller en annen buffer (uten vaskemiddel) til toppen av kolonnen og gjenta sentrifugeringstrinnet i 2 min.
    7. Legg den andre eluatet til proteoliposome prøven hvis det ser skyet.
    8. Lagre prøven ved 4 ° C over natten eller brukes umiddelbart for jodid-avgivelses målinger.

3. Jodid utstrømming Målinger for Renset, Rekonstituert CFTR

  1. Generering av et jodid gradient over membranen proteoliposomal
    1. Pre-svelle Sephadex G50 perler i Buffer 9 (75 mM K-Glu; kaliumglutamat, se tabell 1) (ca. 5 g tørre perler i 50 ml buffer) eller ønsket utvendig buffer ved romtemperatur i minst 2 timer eller ved 4 ° C over natten.
    2. Forberede fire Sephadex G50 kolonner mettet i buffer 9 (75 mM K-Glu, se tabell 1) eller annenbuffer i små kolonner screening ved å laste harpiksen til minst ¾ i kolonnen.
    3. Sentrifuger i 4 minutter ved 2000 x g for å fjerne overskudd av buffer fra harpiksen. Det bør være ca. 2,25 ml pakket hydratisert harpiks i kolonnen ved slutten av sentrifugeringstrinn.
      MERK: Resin bør være lett hydrert, men ikke nedsenket i væske og en påfølgende kort spinn bør ikke eluere betydelige mengder buffer. Det er avgjørende for en vellykket eluering av proteoliposome prøve som harpiks kolonnen er verken for våt eller for tørr og brukeren må kanskje eksperimentere med kolonnene for å bli kjent med de mest vellykkede buffer utvekslingsforhold.
    4. Legge nøye 125-150 ul proteoliposome prøven til toppen av hver kolonne og sentrifuger i 4 minutter ved 2000 x g.
    5. Pool proteoliposome Eluater sammen for umiddelbar bruk i jodid utstrømming eller andre forsøk.
      MERK: eluert volum fra hver kolonne skal være omtrent150 ul og prøven bør være noe uklar, men mindre uklar enn den opprinnelige prøven. Større volumer eller klare eluater antyder at kolonnene ikke er blitt tørket tilstrekkelig, eller har blitt tørket for mye, henholdsvis, og vil ikke resultere i en vellykket jodid effluks eksperiment.
  2. Jodid effluks assay
    1. Vask en jodid selektiv mikro elektrode (tabell av materialer og utstyr) i stor utstrekning med de-ionisert vann, og deretter inkuberes i 20 min før forsøket i buffer 10 (15 mikrometer KI, se tabell 1). Vask elektroden igjen i stor utstrekning med de-ionisert vann.
    2. Tilsett 150 ul av medikament (20 pM typisk konsentrasjon for å produsere en endelig konsentrasjon på 10 uM i analysebuffer) i 9 (75 mM K-Glu, se tabell 1) eller bærer i buffer 9 til en brønn av en 96-brønns plate med en liten loppe oppsikt bar.
      1. Pass på at det ikke er noen bobler stede. Bruk en pipette for å fjerne bortkommenbobler. Hvis en medikamentløsning blir brukt, sikre at den endelige DMSO-konsentrasjon i brønnen er mindre enn 1% (v / v) (typisk 0,1-0,2% (v / v)).
    3. Tilsett 150 ul av rekonstituert CFTR-protein som ble fremstilt i avsnitt 3.1 i buffer 9 (75 mM K-Glu, se tabell 1) til brønnen sammen med medikament eller buffer, for å frembringe et totalt volum på 300 pl i brønnen av platen.
    4. Plasser 96-brønn plate på en røreplate og omrør ved 130 rpm (eller ved en moderat hastighet på ca. fjerdedel av den maksimale hastighet).
    5. Sett tuppen av jodidet selektiv elektrode nøye inn i brønnen med prøven, slik at spissen ikke berører bunnen av brønnen eller å bli truffet av rørestav. Sikre at referanseelektrode, hvis separate, også er i kontakt med oppløsningen i brønnen.
    6. Rekord tracings ved hjelp av en hjemmelaget eller kommersielle dataprogram som grensesnitt med elektroden (se tabell av materialer og utstyr for detaljer).Bruke en samplingsfrekvens på 2 Hz, med filtrering av signalet gjennom et lavpassfilter.
    7. La prøven til stabilisering i 5 min for å produsere en stabil flate, eller i nærheten av flat baseline under opptak.
    8. Tilsett 3 ul MgATP (100 mM stock fremstilt i dH 2 O og justert til pH 7 med KOH; 1 mM sluttkonsentrasjon) til prøven for å aktivere protein. Tillate ~ 5 min å nå en ny stabil baseline. Alltid justere pH-verdien i 100 mM stock MgATP til nøytral før bruk for å unngå forandringer i pH i den ytre buffer.
    9. Tilsett 3 mL av valinomycin lager (2 pM; 20 nM sluttkonsentrasjon) til prøven for å shunte forandringer i potensialforskjellen som genereres av jodid-selektiv konduktans gjennom CFTR. Noter avtagende helning (fall i mV) på grunn av CFTR-mediert jodid utstrømning aktivitet i minst 5 min.
    10. For å sikre at fangst av jodid i de proteoliposome lumen var tilstrekkelig, tilsett 3 ul 10% (v / v) Triton X-100 til prøven. Significant og umiddelbar frigjøring jodid indikerer at tilstrekkelig jodid er blitt fanget i vesiklene, slik at overlapping ikke var den begrensende faktor for endringer i helning bestemt i 3.2.9, men snarere CFTR-mediert aktivitet.
    11. Vask elektrode og rørestav grundig med deionisert vann etter behandling av prøver med medikament eller med Triton X-100 for å sikre at alle spor av disse reagenser er blitt fjernet for å unngå forurensning av den neste prøven.
    12. Fremstille en serie av fortynnede KI konsentrasjoner i det mikromolare til nanomolare området i buffer 9 (K-Glu-buffer, se tabell 1). Noter mV responsen av elektroden overfor hver konsentrasjon fra 0 til den høyeste konsentrasjon fremstilt. Konstruere en standardkurve hvor sonderespons (mV) er plottet versus log av den molare konsentrasjon jodid. Bruke standardkurven for å omdanne mV responsen av sonden under utstrømningen eksperiment for å konsentrasjon av jodid frigjøres.
      MERK: Forbered en kalibrerings curve på en ukentlig basis inntil en bruker er sikker på hvor raskt responsen til sonden endres. Det vil være en drift i responsen, og følsomheten av sonden over tid. Som probe aldre, vil svaret bli dårligere. Dette kan være delvis opphevet ved å endre de interne løsninger med jevne mellomrom og grundig vasking av sondespissen i vann etter bruk, noe som sannsynlige grenser tilslutning av molekyler til sondens overflate.
    13. Bestemme den gjennomsnittlige helning av linjen av konsentrasjonen mot tid plottet for hver proteoliposome prøve for den siste 30 sekunder før tilsetning av MgATP, og etter tilsetning av valinomycin, men før tilsetning av Triton X-100. Trekk fra grunnlinjen skråningen fra valinomycin å bestemme CFTR-mediert jodid utstrømning aktivitet for den prøven.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Beskrevet i denne skriftlige publikasjonen er metoder for å rense, rekonstituere og måle regulert kanal aktivitet av CFTR protein. Figur 1a viser arbeidsflyten for rensing, tilberedning og iodide utstrømningshastigheter prosedyrer. Metoder for rekonstituering og kanal aktivitetsmålinger av jodid flux blir også vist nærmere i den tilhørende video.

Rensing og tilberedning av CFTR inn proteoliposomes

CFTR kan være funksjonelt uttrykt ved høye nivåer i S f 9-celler ved anvendelse av rekombinante baculovirus inneholdende Wt eller mutant CFTR-cDNA-2. Selv om ikke et pattedyr ekspresjonssystem ble CFTR uttrykkes ved hjelp av baculovirus-systemet i S f 9-celler for å sikre en høy grad av ekspresjon. CFTR produksjon kan være så høyt som 1% av totalt celleprotein 17,28. S f 9- baculovirus-systemet har den fordel at proteinet er glykosylert kjernen ogkvalitetskontroll maskiner i dette system er relativt ettergivende, slik at CFTR og mutanter kan fremstilles på celleoverflaten. En ti histidin tag ble konstruert på karboksyterminalen å tillate rensing i kraft av affinitet av denne koden for nikkel-NTA. C-terminal tag bidrar til å hindre co-rensing av avkortede CFTR proteiner og gir funksjonell CFTR protein i ATPase, enkelt kanal og iodide efflux eksperimenter 17,19,24,28,29. Imidlertid renseprotokollen beskrevet her bør være egnet for N-terminalt kodet CFTR også.

Tidligere har det vært vist at proteinet CFTR kan effektivt ekstraheres fra S f 9 plasmamembranpreparater ved å bruke NaPFO (natrium pentadecafluoro-oktanoat) ved romtemperatur 15. Men for å mottakelighet av NaPFO utfelles ved 4 ° C, en temperatur som bidrar til å opprettholde riktig foldet protein, og den omstendelige dialyse nødvendig for å fjerne PFO ikke var mottagelig for rapid rensing og omdanningsmetoder til hensikt å maksimalisere aktiviteten av proteinet i etterfølgende analyser av CFTR funksjon. En vurdering av et panel av vaskemidler (inkludert dodecyl-β-D-maltosid (DDM), 3 - [(3-cholamidopropyl) dimetylammonio] -1-propansulfonat (CHAPS), fos -choline 12 og fos -choline 14, viste at fos -choline 14 var mest effektive i å oppløseliggjøre human CFTR-His 10 fra S f 9 membraner, og at DDM var effektiv i å opprettholde aktiviteten av ATPase CFTR i vaskemiddelløsning (data ikke vist). Således er en fos -choline 14 vaskemiddel ekstraksjonstrinn er utført, fulgt av utveksling DDM vaskemiddel for å opprettholde aktiviteten av proteinet.

Etter rensing og konsentrasjon, blir en proteinfraksjon oppnådd i DDM vaskemiddel som inneholder en ~ 150 kDa båndet som sin hovedkomponent (Figur 2; Silver Stain). Dette molekylvekt tilsvarer menneskelig CFTR uttrykt i S <em> f 9cells og analysert ved hjelp av SDS-PAGE, hvor det mangler typer av komplekse glykosylering karakteristisk for CFTR i pattedyrceller. De 150 kDa-arter synes å være ca 90% ren etter SDS-PAGE-analyse og sølvfarging. Western-blotting ved hjelp av M3A7 anti-CFTR antistoff bekrefter at dette musemonoklonalt rettet mot NBD2 reagerer med 150 kDa bånd (figur 2; blot). I visse undersøkelser, spormengder av lavmolekylære komponenter er til stede som mindre bånd synlige på gelen, på ~ 60 og ~ 80 kD (data ikke vist). Den M3A7 anti-CFTR-antistoff reagerer med 60 og 80 kDa-båndene, men reagerer ikke med andre ikke-CFTR proteiner (data ikke vist). Dette tyder på at de lavere molekylvekt komponenter er CFTR nedbrytningsprodukter co-renset med CFTR via deres C-terminal Hans tag. Rensingen skjer i nærvær av proteaseinhibitorer, og det ser ut til at disse komponentene er tilstede i cellene før renseprosedyren is utført. Konsentrasjonen trinn av fremgangsmåten fjerner praktisk talt alle de kontaminerende fragmenter med lavere molekylvekt. CFTR kan bli rekonstituert ved dette punkt, eller protein fra en annen rensemetode kan brukes i rekonstituering protokollen.

En liposomal flux basert analysen rapporterer funksjonelt tilberedning av en befolkning på rensede og utblandede CFTR molekyler som regulert, anionselektive kanaler

For å bestemme om en betydelig andel av renset CFTR ble rekonstituert som regulert klorid kanal ved hjelp av de ovennevnte fremgangsmåter, ble en proteoliposomal halogenid fluks analyse utviklet som rapporterer aktiviteten av en populasjon av rekonstituert CFTR molekyler (vist skjematisk på figur 1B). Hvis, i verste fall, de fleste av de rekonstituerte CFTR molekyler er misfoldede, disse molekylene vil mislykkes i å gi en ledningsevne, ikke klarer å skille mellom kationer og anionerog / eller porten vil mangle regulering av PKA fosforylering og nukleotider. Lee et al. Har publiserte metoder som tillater beregning av prosent funksjonell rekonstitusjon av et membranprotein 30.

Tomme liposomer (mangler CFTR) eller proteoliposomes (bærer rekonstituert CFTR) er lastet med KI (75 mm) og ekstra-liposomal jodid utvekslet med kalium glutamat (75 mm) ved å sende liposomer gjennom en gelfiltreringskolonne. KI lastet proteoliposomes tilsettes til en brønn inneholdende K-Glu (kaliumglutamat) for å lage et ytre gradient for jodid og utstrømning overvåkes som økninger i extraliposomal jodid over tid ved hjelp av et jodid følsomme mikroelektrode 24. Utstrømningen av negativt ladede jodid resulterer i en reduksjon i mV-signal (signalet blir mer negativ). Når konsentrasjonen av jodid frigjort over tid blir plottet, er hellingen invertert (som i figur 3) for å vise en økning i jodid i exintern oppløsning over tid.

K-Glu ble valgt som impermeant motion som det er ett eksempel på et anion som ikke passerer gjennom CFTR protein, synes ikke å forårsake betydelig blokkering av pore under de betingelser som benyttes, og ikke forårsaker interferens med jodid selektiv elektrode. Et assay kunne optimaliseres rundt en annen anion, forutsatt at det oppfyller disse kriteriene. Syttifem mM anion konsentrasjonene ble valgt empirisk som konsentrasjoner som ga god overlapping og tilstrekkelige signaler for måling i analysen under de betingelser som er beskrevet. Det blir egentlig ingen jodid utgivelse fra iodide belastede liposomer mangler funksjonelt rekonstituert CFTR inntil vesiklene permeabilized med vaskemiddel (figur 3, kontroll spor), mens CFTR-rekonstituert, iodide belastede proteoliposomes megle iodide slipper inn den eksterne løsningen etter tilsetting av MgATP (1 mM) for å åpne CFTR kanal og valinomycin(20 nM) for å hindre utviklingen av en membranpotensialet (figur 3A, se spor for protein: lipid-masseforhold på 1: 3000 (v / v)).

Valinomycin er en ionofor som transporterer kalium spesielt over membranen, ned sin konsentrasjonsgradient, og konsentrasjonen på 20 nM ble valgt empirisk som den høyeste konsentrasjon som ikke forstyrre integriteten av tomme liposomer i det foreliggende system. Dette kan ha behov for å være optimalisert for hvert enkelt system. Uten tilsetning av valinomycin, er en forkortet jodid frigjøring av noen nM som raskt når et platå (data ikke vist). Selv om disse betingelser er kjent for ellers maksimalt aktivere anion kanalaktivitet i CFTR (som i figur 3A), viser det seg at mangelen på en signifikant respons reflekterer den momentane økning i intraliposomal positiv ladning mediert av jodid ledning gjennom den anionselektive pore i CFTR , umiddelbart begrense continuOUS iodide utstrømning hvor valinomycin ikke er inkludert. Dette valinomycin-mediert reaksjon bekrefter at jod utstrømming var begrenset i de tidligere forsøkene på grunn av oppladning opphopning, støtte anionet selektivitet av rekonstituert CFTR. Hvis CFTR manglet denne selektivitet, vil både kalium jodid og har vært i stand til å strømme ut fra proteoliposomes derved å oppheve behovet for valinomycin å initiere fluks.

De jod konsentrasjonene målt på disse innledende tidspunkter var empirisk valgt til å falle innenfor det optimale følsomhetsområde for jodid føleelektrode anvendes. Bruk av andre jodid elektroder kan kreve optimalisering av disse faktorene. Etter å ha nådd et platå, er Triton X-100 lagt til permeabilize de proteoliposomes og slippe ut gjenværende fanget jodid. I motsetning til de innledende målinger jodid (oppnådd mellom 1 og 2 minutter etter tilsetning valinomycin), målingene ved disse endepunkter ikke er i den lineære rekke av elektrode calitil kalibreringskurve (data ikke vist), for derved å utelukke en nøyaktig vurdering av den fraksjon av liposomer som CFTR-protein er i stand til å mediere jodid effluks i forhold til det totale antall av liposomer i analysen, eller dens prosent funksjonell rekonstitusjon.

Frekvensen av jodid fluks reflekterer antall CFTR proteinmolekyler, den åpne sannsynlighet og enhetlig konduktans av hver CFTR kanal. Derfor ratene jodid utstrømning skal være avhengig av antallet og sannsynligheten for åpne hver CFTR molekyl. Prediksjonen ble testet i dette system ved å øke antallet av CFTR-molekyler pr liposom. Forholdet mellom aktivert (fosforylert og MgATP behandlet) CFTR protein til lipid ble variert, med forhold varierende fra 1: 300 til 1: 3000 (w / w) (Figur 3A). Jo større mengde rekonstituert CFTR tilstede i proteoliposomes, jo større graden av effluks (målt mellom 1-2 min etter tilsetning valinomycin), som støtter prediksjon tlue ingshastighetene er avhengig av antall CFTR molekyler i hver liposomen. Effluks som oppnås ved bruk av spesifikke protein: lipidforhold er reproduserbare mellom eksperimentelle dager og protein renselser, og dermed fremhever rigor av denne metoden.

Frekvensen av jodid effluks synes å forholde seg til den åpne sannsynlighet for CFTR-kanalen i denne rekonstituert system. Som fosforylering av PKA er nødvendig for CFTR-aktivering 31 (og vurdering ved 32), er det ventet at det vil være en lav hastighet på jodid effluks i vesikler inneholdende CFTR som ikke er fosforylert av eksogent PKA behandling, der den åpne sannsynlighet er lavt . I proteoliposomes som har blitt behandlet PKA, vil den åpne sannsynlighet være mye høyere, noe som resulterer i en mye større forventet hastighet på dyseutstrømningen. I praksis, for PKA-behandlede CFTR i nærvær av 1 mM MgATP i dette system, frekvensen av jodid effluks målt fra ett til to minutter etter tilsetning av valinomyci er omtrent fire ganger høyere frekvensen av CFTR protein utsettes for MgATP men ikke PKA (Figur 3B). Disse funnene støtter hypotesen om at frigivelseshastighet forholde å kanal åpen sannsynlighet. I praksis kan det være vanskelig å sammenligne aktiviteten i denne analyse direkte å åpne sannsynlighet gitt at andre faktorer så som tidsavhengige endringer i den elektrokjemiske drivkraft vil påvirke observerte effluks aktivitet. Leseren blir advart om at denne analysen er ikke en erstatning for detaljerte enkeltkanalaktivitets innspillinger.

Interessant er det vanligvis observert en lav hastighet på jodid utstrømning av "ufosforylerte" protein i nærvær av MgATP som er betydelig større enn utstrømningen fra liposomer som mangler CFTR (figur 3B, C). Dette lav rente kan reflektere basal fosforylering av CFTR i S f 9 cellers uttrykk systemet før rensing 33. CFTR renset fra andre uttrykk systems kan ha ulike nivåer av basal fosforylering og derfor forskjellig rest aktivitet.

Denne raske renseprotokoll utbytter Wt-CFTR fra S f 9-celler ved nær homogenitet, men for F508del- og G551D-CFTR, er fremgangsmåten bedre beskrives som en anrikningsfremgangsmåte. Noen forurensende band er observert via SDS-PAGE 19, hvorav mange reflektere CFTR nedbrytningsprodukter som er reaktiv til CFTR antistoffer og ser ut til å være til stede før celle avbrudd. Rekonstitusjonstiden og jodid flux metoder er egnet for disse beriket prøver av klinisk relevante mutanter. Som vist i fig 3D, er betydelig jodid utstrømningen måles for både F508del- (protein: lipid-masseforhold på ca. 1: 600) og G551D-CFTR (protein: lipid-forhold på ca. 1: 300). Mens begge mutanter har lavere absolutte aktivitet enn vill-CFTR (protein: lipid-masseforhold på 1: 1200), er det vanskelig å sammenligne prøvene direkte som kvantifiseringikke kan være så nøyaktig for de mutanter som er forurenset med CFTR-nedbrytningsprodukter. Men både F508del-CFTR og G551D renset ved disse metodene, rekonstituert og underkastet målinger efflux reagerer som forventes å lavmolekylære potensiatorer (figur 4), og viser tilsvarende kanalfunksjon til protein renset ved strengere PFO rensemetode 19.

Kanalen aktivitet av renset og rekonstituert CFTR kan moduleres av lavmolekylære inhibitorer og potensiatorer

CFTR inh -172 34 er den mest spesifikke CFTR inhibitor tilgjengelig som har blitt vist å inhibere den åpne sannsynlighet for CFTR klorid kanaler i enkeltkanal konduktansmålingene 35 og for å inhibere CFTR-aktivitet i andre studier 22,36. Som vist i figur 3C, er hastigheten av utstrømningen etter valinomycin tilsetning betydelig redusert ved forbehandling med CFTR inh ub> -172. Derfor er denne analysen av kanalen aktivitet av en populasjon av rensede og rekonstituert CFTR molekyler effektive i rapporteringen av modulatorer slik som inhiberende ligand CFTR inh -172.

Analysen er følsom og meget anvendelig for undersøkelse av virkningene av små molekyl Forsterkende behandling i tillegg. Som vist i figur 4, er alle tre genotyper CFTR testet vesentlig forsterkes av aktive potensiatorer av små molekyler slik som Kalydeco / VX-770 eller VRT-532 (figur 4C, er vist for G551D), mens en inaktiv analog har ingen virkning på jodidet effluks Aktiviteten av CFTR (vist for F508del-CFTR, figur 4B). Analysen kan anvendes for undersøkelse av potensiator konsentrasjonsavhengig, og rollen til ATP og fosforylering på potensiator-mediert CFTR-aktivitet.

27fig1highres.jpg "width =" 700px "/>
Figur 1:. Analysen design og arbeidsflyt (A) Arbeidsflyt for det arbeidet som er beskrevet i denne publikasjonen (B) Skjematisk fremstilling av jodidet efflux eksperiment.. En modifisert versjon av panel B ble opprinnelig publisert i The Journal of Biological Chemistry. Eckford, PDW; Li, C .; Ramjeesingh, M .; og Bear, CE Cystisk fibrose transmembran Conductance Regulator (CFTR) Forsterkende VX-770 (Ivacaftor) Åpner Defekt Channel Gate of Mutant CFTR i en fosforyleringstrinn avhengig, men ATP-uavhengig måte. 2012; 287: 36639-36649. © The American Society for biokjemi og molekylærbiologi.

Figur 2
Figur 2:. CFTR rask rensing prosedyre gir renset Wt-CFTR protein Sølv farget SDS-PAGE gel og Western blot ved hjelp av M3A7 CFTR-antistoff for renset human-CFTR Wt protein i DDM beholderen (1 ug og 0,1 ug av gelen og blot, henholdsvis), isolert fra S f 9-celler overuttrykkende en (His) 10 -tagged versjon proteinet. Wt-CFTR (> 90% rent) blir detektert ved 150 kDa, som passer for dette protein som mangler glykosylering kompleks. Denne forskningen ble opprinnelig publisert i The Journal of Biological Chemistry. Eckford, PDW; Li, C .; Ramjeesingh, M .; og Bear, CE Cystisk fibrose transmembran Conductance Regulator (CFTR) Forsterkende VX-770 (Ivacaftor) Åpner Defekt Channel Gate of Mutant CFTR i en fosforyleringstrinn avhengig, men ATP-uavhengig måte. 2012; 287: 36639-36649. © The American Society for biokjemi og molekylærbiologi.

Figur 3
Figur 3: jegodide efflux analyse rapporter regulert kanal aktivitet for det rensede protein og rekonstituert CFTR. (A) Renset og fosforylert Wt-CFTR rekonstituert ved protein: lipid-forhold på 1: 300 (vekt / vekt), 1: 1200 (w / w) og 1: 3000 (w / w) medierer jodid utstrømning fra hulrommet til vesikkel massebadet over tid etter tilsetning av 1 mM MgATP og 20 nM valinomycin. Tilsetningen av 0,1% (w / v) Triton X-100 for å permeabilisere de proteoliposomes frigjør fanget jodid i vesikkel lumen ved slutten av forsøket. (B) Initial jodid utstrømning tidsforløpet for rekonstituert Wt-CFTR-proteinet som ikke hadde vært pre-fosforylerte. (C) Initial jodid-avgivelseshastigheter viser avhengigheten av den observerte aktivitet på funksjonell CFTR protein. PKA fosforylering av proteinet kreves for vesentlig kanalaktivitet, som hemmes ved tilsetning av CFTR-inhibitor, CTTR inh -172 (20 pM). Data er midler ± SEM; * P <0,05, *** p <0.0001. (D) Flere genotyper produsere regulerte CFTR signaler i jodid efflux analysen, inkludert vekt-, F508del- og G551D-CFTR versus kontroll. Data er midler ± SEM; * P <0,05; *** P <0,0004 vs. kontroll. Denne forskningen (deler av data i paneler A, C og D) ble opprinnelig publisert i The Journal of Biological Chemistry. Eckford, PDW; Li, C .; Ramjeesingh, M .; og Bear, CE Cystisk fibrose transmembran Conductance Regulator (CFTR) Forsterkende VX-770 (Ivacaftor) Åpner Defekt Channel Gate of Mutant CFTR i en fosforyleringstrinn avhengig, men ATP-uavhengig måte. 2012; 287: 36639-36649. © The American Society for biokjemi og molekylærbiologi.

Figur 4
Figur 4: fosforylering avhengig forsterkning av CFTR av små molekyler som kan bli avlest ved å brukeiodide efflukssystem for vekt-, F508del- og G551D-CFTR. (A) Vekt-CFTR forsterkes betydelig ved potensiator VX-770 (10 uM), bare i den PKA-fosforylert tilstand. Dataene er gjennomsnitt ± SEM, * p <0,01 vs. + PKA-VX-770. (B) VX-770 (10 uM), men ikke en inaktiv analog, V-09-1188 (10 pM), potenserer den jodid-effluks betydelig aktivitet av fosforylert F508del-CFTR. Dataene er gjennomsnitt ± SEM, n = 3, *** p <0,001 vs. -VX-770 kontroll. (C) Potensering av G551D-CFTR med 10 uM VRT-532 eller VX-770. Dataene er gjennomsnitt ± SEM, n = 5, ** p <0,001, *** p <0,0001 vs. -VX-770 kontroll. Denne forskningen (paneler ac) ble opprinnelig publisert i The Journal of Biological Chemistry. Eckford, PDW; Li, C .; Ramjeesingh, M .; og Bear, CE Cystisk fibrose transmembran Conductance Regulator (CFTR) Forsterkende VX-770 (Ivacaftor) Åpner Defekt Channel Gate of Mutant CFTR i en fosforyleringstrinn avhengig men ATP-uavhengig måte. 2012; 287: 36639-36649. © The American Society for biokjemi og molekylærbiologi.

r> ight "> 7.4
Buffer Navn Innhold pH Justere pH hjelp
Buffer 1 2% fos -choline 2% (w / v) fos -choline 14 detergent i 10 mM imidazol, 25 mM HEPES 7.4 Imidazol / HEPES
Buffer 2 10 mM -imidazol 10 mM imidazol, 25 mM HEPES (uten vaskemiddel) 7.4 Imidazol / HEPES
Buffer 3 10 mM -imidazol + DDM 10 mM imidazol, 25 mM HEPES, 1 mM dodecyl-β-D-maltosid 7.4 Imidazol / HEPES
Buffer 4 50 mM -imidazol + DDM 50 mM imidazol, 25 mM HEPES, 1 mM dodecyl-β-D-maltosid 7.4 Imidazol / HEPES
Buffer 5 600 mM -imidazol + DDM 600 mM imidazol, 25 mM HEPES, 1 mM dodecyl-β-D-maltosid 7.4 Imidazol / HEPES
Buffer 6 75 mM KI + DDM 75 mM KI, 20 mM MOPS, 1 mM dodecyl-β-D-maltosid 7.4 KOH
Buffer 7 75 mM KI 75 mM KI, 20 mM MOPS 7.4 KOH
Buffer 8 25 mM HEPES + DDM 25 mM HEPES, 25 mM NaCl, 1 mM dodecyl-β-D-maltosid 7.4 HCl / NaOH
Buffer 9 75 mM K-Glu 75 mM K-glutamat, 20 mM MOPS KOH / glutaminsyre
Buffer 10 15 mM KI 15 mM KI, 20 mM MOPS 7.4 KOH

Tabell 1: Tabell over buffere.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det har vært et begrenset antall renseprotokoller for full-lengde, funksjonelle CFTR isolert fra en rekke cellulære høyekspresjonsystemer. Metoden som beskrives her er en fordel fordi det gir rask rensing av WT-CFTR eller høy anrikning av F508del- og G551D-CFTR i moderate mengder som er svært funksjonelle i analyser inkludert ATPase og direkte målinger av kanalfunksjon, herunder enkeltkanalmålinger i planar bilags systemer og demonstrerte tiltak av CFTR befolkningen kanal funksjon som er svært relevant for studiet av små molekyler 19-21. Rensemetoden er integrert i en hurtig og effektiv rekonstituering protokollen, kan imidlertid renset protein fra andre metoder bli koplet til denne rekonstituering protokollen også, forutsatt at rense vaskemiddel er mottagelig for fjerning på samme måte.

I motsetning til kompliserte og møysommelig enkeltkanal eksperimenter fra excserte membran lapper, metodene beskrevet her tillater en robust men likevel enkel vurdering av CFTR kanalfunksjon, og entydig dette tiltaket rapporterer funksjonen av en større populasjon av CFTR kanaler i stedet for en eller noen få molekyler. I motsetning til teknikker som involverer membranplaster, lar denne fremgangsmåte direkte vurdering av virkningene av små molekyl-modulatorer for kanalen i nærheten av eller fullstendig fravær av assosierte proteiner, avhengig av effektiviteten av det koplede renseprosedyren.

Kritiske trinnene i protokollen

Selv om det er flere viktige skritt i funksjonell rekonstituering av CFTR for anionet flux analysen, som angitt notater i protokollen, optimalisering av proteinet: lipidforholdet under CFTR rekonstituering er nøkkelen. Slik optimalisering er nødvendig for hver CFTR genotype.

Modifikasjoner og feilsøking av teknikken

Baseline mV response for sonden som brukes her under jodid effluks analysen med prøver fremstilt som beskrevet er vanligvis -20 til -50 mV. Vesentlige avvik fra dette området tyder på det kan være problemer med prøven. Andre sonder selges av ulike produsenter kan avvike fra de retningslinjer som her. Hvis en stabil baseline ikke kan oppnås, kan det oppstå rest vaskemiddel eller inaktive, denaturert, dårlig kvalitet protein bli permeabilizing vesiklene til iodide.

Unnlatelse av å oppdage en betydelig endring i frekvensen av valinomycin avhengig jodid utstrømming fra liposomer som inneholder fosforylert CFTR i nærvær av MgATP kan gjenspeile flere problemer, som alle bør undersøkes. Disse problemene omfatter: dårlig kvalitet, delvis denaturert CFTR eller uren CFTR; ufullstendig fjerning av vaskemiddel under tilberedning; ikke-optimale protein: lipidforholdet i proteoliposomes; eller utilstrekkelig valinomycin lagt, rende kostnad ødsling ufullstendig.

Det jegodide efflux analyser gir fleksibilitet til å bruke pre-fosforylert CFTR-proteinet (som beskrevet i protokollen), eller fosforylert CFTR under analysen. Hvis det rekonstituerte protein ikke ble fosforylert under renseprosedyren, kan prøven bli fosforylert under jodid effluks eksperiment i trinn 3.2.7, ved tilsetning av PKA med MgATP. I dette tilfelle sørge for at grunnlinjen er registrert i minst fem minutter for å forsikre at proteinet er blitt tilstrekkelig fosforylert av PKA-enzym før måling funksjon med tilsetning av valinomycin. Lignende resultater oppnås ved enten metode.

Under protokollen, er modulatoren molekylet tillatt å interagere med CFTR-proteinet i 5 minutter før måling av aktiviteten ved tilsetning av MgATP og deretter valinomycin. Som de fleste CFTR modulatorer er svært lipofilt, kan det ta tid mellom tillegg til bad og likevekt tilknytning til CFTR protein. Analysen kan ikke fortsette uten the tilsetning av valinomycin, og dermed ingen informasjon går tapt ved å utføre analysen på denne måte. I situasjoner hvor brukeren ikke er bekymret for at det kan være en tidsforsinkelse før interaksjon av den lille molekyl med proteinet, kan analysen bli utført av den akutte tilsetning av modulator etter tilsetning av valinomycin, mens det fremdeles i den innledende fasen av frekvensen målingen.

Begrensninger av teknikken

Som nevnt tidligere, dette proteoliposomal fluks basert assay for regulert kanalaktivitet av en populasjon av rensede og rekonstituert i full lengde CFTR molekyler gir en unik metode for å utspørre ligander som direkte modifiserer aktiviteten. Imidlertid er fremgangsmåten begrenset ved at det ikke gir innsikt i mekanismen gjennom hvilke ligander endre frekvensen av fluksen gjennom CFTR. Ideelt sett bør proteoliposomal fluks analysen av rensede og rekonstituert CFTR brukes i kombinasjon med plane leppeid-lags studier av enkelt kanal aktivitet. Denne kombinasjonen vil gi innsikt i tilstanden av proteinet som binder ligandene, dvs. åpen og / eller lukket tilstand.

Betydning i forhold til eksisterende metoder

Det er for tiden mangel på metoder for å vurdere den direkte interaksjon av små molekyler med CFTR kanal versus små molekyl modulatorer som samhandler med en annen mobil komponent til indirekte endre kanal aktivitet, for eksempel gjennom en modulerende eller signalveien eller avbrudd av viktig protein-protein interaksjoner. Den jodid efflux metoden demonstrerer direkte interaksjon med proteinet i alle lite molekyl som modulerer aktiviteten av kanalen CFTR. Til tross for den lave gjennomstrømnings måte av målingene, er det fortsatt et betydelig verdi i disse unike fremgangsmåter for å studere direkte interaksjon av CFTR med lavmolekylære potensiatorer og korrektur. Mange små molecule modulatorer er under utvikling av både faglige grupper og den farmasøytiske industrien til å behandle CF-pasienter klinisk, da dette er den viktigste stakk av dagens CF forskning. Det er ventet at fremgangsmåtene som er beskrevet her, vil hjelpe til i utviklingen og validering av virkningsmekanismen av de mest lovende av disse molekylene.

Fremtidige anvendelser av teknikken

Metodene som benyttes her er også svært mottagelig for tilpasning til andre proteiner av interesse. Faktisk er en modifikasjon av de beskrevne fremgangsmåter ble anvendt for å studere to P. aeruginosa membranproteiner involvert i bevegelse av anioniske substrater over membranen 26,27, demonstrere nytten og allsidigheten av disse metodene. Deres bruk i studiet av ytterligere Anion kanaler og transportører er forventet i fremtiden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erkjenner råd fra Dr. Mohabir Ramjeesingh under utviklingen av rensemetoder som er beskrevet her. Disse studiene ble støttet av driftstilskudd til CEB fra den kanadiske Institutes of Health Research (CIHR) og Cystisk fibrose Canada (CFC). PDWE ble støttet delvis av Fellowship utmerkelser gjennom CIHR og CFC. Forfatterne erkjenner levering av corrector, forsterker og inhibitorforbindelser fra Dr. R. Bridges (Rosalind University of Medicine and Science) og distribusjon av cystisk fibrose Foundation Therapeutics (CFFT). Forfatterne erkjenner også fremragende service ved Baylor Cell Culture Facility (NIH stipend P30 CA125123) i å uttrykke Vekt og mutant CFTR protein bruker bakulovirus system. Den inaktive VX-770 analog, V-09-1188, var en gave fra Vertex Pharmaceuticals.

Acknowledgments

Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
fos-choline 14 detergent Anatrace Affymetrix (www.anatrace.affymetrix.com) F312 Affymetrix: Anatrace Products; CAS# :77733-28-9
cOmplete EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets Roche (www.roche-applied-science.com) 04 693 132 001 EDTA-free Protease inhibitor cocktail tablets (1 in 50 ml or mini: 1 in 10 ml) (Roche Diagnostics GmbH; Ref: 11873 580 001)
cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EDTA-free, EASYpack  Roche (www.roche-applied-science.com) 05 892 791 001
Ni-NTA Agarose Qaigen GmbH 1018240
Fisherbrand Screening columns Fisher Healthcare 11-387-50
Amicon Ultra Centrifugal filters, Ultracel-100K Millipore (www.millipore.com) UFC910008
cAMP-Dependent Protein Kinase A (PKA), Catalytic Subunit New England Biolabs (www.neb.com/products/p6000-camp-dependent-protein-kinase-pka-catalytic-subunit) Peirce PKA is also suitable
PC, Chicken Egg Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) 840051C
POPC Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) 850457C
PS, Porcine Brain Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) 840032C CFTR has been successfully reconstituted into Egg PC, POPC, 2:1 (w/w) Egg PC:POPC, or a mixture of PE:PS:PC:ergosterol, 5:2:2:1 (w/w)
PE, Chicken Egg Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) 841118C
Ergosterol Sigma (www.sigmaaldrich.com) 45480
Pierce Detergent removal spin column Thermo Scientific 87779 1 ml capacity columns
valinomycin Sigma (www.sigmaaldrich.com) V-0627
VX-770 (ivacaftor) Selleck Chemicals S1144
iodide selective microelectrode Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/microionn.tam) LIS-146ICM  
 
 
 
 
 
Name Company Catalog Number Comments
Clampex 8.1 software Axon Instruments (www.axon.com) we use components of the ClampX system with a home made filter to monitor and record the response to our electrode
Alternate Software: ArrowLabb System  Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/ionsystems.tam) LIS-146LICM-XS Lazar Research sells a meter that can interface with a computer and software to record the probe response.  This software should serve a similar function to our setup.
small stir bars Big Science Inc (www.stirbars.com) SBM-0502-CMB choose a stir bar small enough to easily fit into a well of a 96-well plate
Sephadex G50, fine GE Health Care (www.gelifesciences.com) 17-0042-01
Sonicator Laboratory Supplies Co, Inc. G112SP1G Bath sonicators from other manufacturers should also be suitable

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kim Chiaw, P., Eckford, P. D., Bear, C. E. Insights into the mechanisms underlying CFTR channel activity, the molecular basis for cystic fibrosis and strategies for therapy. Essays Biochem. 50 (1), 233-248 (2011).
  2. Bear, C. E., et al. Purification and functional reconstitution of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). Cell. 68 (4), 809-818 (1992).
  3. Cai, Z., Sohma, Y., Bompadre, S. G., Sheppard, D. N., Hwang, T. C. Application of high-resolution single-channel recording to functional studies of cystic fibrosis mutants. Methods Mol Biol. 741, 419-441 (2011).
  4. Genetic Analysis Consortium. , http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr/Home.html (1989).
  5. Kerem, B., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: genetic analysis. Science. 245 (4922), 1073-1080 (1989).
  6. Yang, Y., et al. Molecular basis of defective anion transport in L cells expressing recombinant forms of CFTR. Hum Mol Genet. 2 (8), 1253-1261 (1993).
  7. Mendoza, J. L., et al. Requirements for efficient correction of DeltaF508 CFTR revealed by analyses of evolved sequences. Cell. 148 (1-2), 164-274 (2012).
  8. Rabeh, W. M., et al. Correction of both NBD1 energetics and domain interface is required to restore DeltaF508 CFTR folding and function. Cell. 148 (1-2), 150-163 (2012).
  9. Aleksandrov, A. A., et al. Allosteric modulation balances thermodynamic stability and restores function of DeltaF508. CFTR. J Mol Biol. 419 (1-2), 41-60 (2012).
  10. Ramsey, B. W., et al. A CFTR potentiator in patients with cystic fibrosis and the G551D mutation. N Engl J Med. 365 (18), 1663-1672 (2011).
  11. Riordan, C. R., et al. Purification and characterization of recombinant cystic fibrosis transmembrane conductance regulator from Chinese hamster ovary and insect cells. J. Biol. Chem. 270 (28), 17033-17043 (1995).
  12. Ryan, L., Rimington, T., Cant, N., Ford, R. C. Expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein in Saccharomyces cerevisiae. JoVE. (61), (2012).
  13. Ostedgaard, L. S., Welsh, M. J. Partial purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. J Biol Chem. 267 (36), 26142-26149 (1992).
  14. Peng, S., et al. One-step affinity isolation of recombinant protein using the baculovirus/insect cell expression system. Protein Expr Purif. 4 (2), 95-100 (1993).
  15. Ramjeesingh, M., et al. A novel procedure for the efficient purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). Biochem J. 327 (1), 17-21 (1997).
  16. Rosenberg, M. F., Kamis, A. B., Aleksandrov, L. A., Ford, R. C., Riordan, J. R. Purification and crystallization of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). J Biol Chem. 279 (37), 39051-39057 (2004).
  17. Ramjeesingh, M., et al. Purification and reconstitution of epithelial chloride channel cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Methods Enzymol. 294, 227-246 (1999).
  18. Sorscher, E. J., Sommerfelt, M. A. Purification of recombinant protein derived from the baculovirus expression system using glutathione affinity agarose. Methods Mol Biol. 3, 337-348 (1995).
  19. Eckford, P. D., Li, C., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) potentiator VX-770 (ivacaftor) opens the defective channel gate of mutant CFTR in a phosphorylation-dependent but ATP-independent manner. J Biol Chem. 287 (44), 36639-36649 (2012).
  20. Alkhouri, B., et al. Synthesis and properties of molecular probes for the rescue site on mutant cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. J Med Chem. 54 (24), 8693-8701 (2011).
  21. Eckford, P. D., et al. VX-809 and Related Corrector Compounds Exhibit Secondary Activity Stabilizing Active F508del-CFTR after Its Partial Rescue to the Cell Surface. Chem Biol. 21 (5), 666-678 (2014).
  22. Kim Chiaw, P., Wellhauser, L., Huan, L. J., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. A chemical corrector modifies the channel function of F508del-CFTR. Mol.Pharmacol. 78 (3), 411-418 (2010).
  23. Verkman, A. S., Galietta, L. J. Chloride channels as drug targets. Nat Rev Drug Discov. 8 (2), 153-171 (2009).
  24. Pasyk, S., Li, C., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. Direct interaction of a small-molecule modulator with G551D-CFTR, a cystic fibrosis-causing mutation associated with severe disease. Biochem J. 418 (1), 185-190 (2009).
  25. Norez, C., et al. Determination of CFTR chloride channel activity and pharmacology using radiotracer flux methods. J Cyst Fibros. 3 (2), 119-121 (2004).
  26. Whitney, J. C., et al. Structural basis for alginate secretion across the bacterial outer membrane. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (32), 13083-13088 (2011).
  27. Islam, S. T., et al. Proton-dependent gating and proton uptake by Wzx support O-antigen-subunit antiport across the bacterial inner membrane. mBio. 4 (5), e00678-e00613 (2013).
  28. Ramjeesingh, M., et al. Ch. 16. Reliable Lab Solutions: Essential Ion Channel MethodsReliable Lab Solutions. Conn, P. M. , Academic Press. 337-357 (2010).
  29. Wellhauser, L., et al. A small-molecule modulator interacts directly with deltaPhe508-CFTR to modify its ATPase activity and conformational stability. Mol Pharmacol. 75 (6), 1430-1438 (2009).
  30. Lee, S. Y., Letts, J. A., MacKinnon, R. Functional reconstitution of purified human Hv1 H+ channels. J Mol Biol. 387 (5), 1055-1060 (2009).
  31. Chang, X. B., et al. Protein kinase A (PKA) still activates CFTR chloride channel after mutagenesis of all 10 PKA consensus phosphorylation sites. J. Biol. Chem. 268 (15), 11304-11311 (1993).
  32. Gadsby, D. C., Nairn, A. C. Regulation of CFTR Cl- ion channels by phosphorylation and dephosphorylation. Adv.Second Messenger Phosphoprotein Res. 33, 79-106 (1999).
  33. Li, C., et al. ATPase activity of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. J Biol Chem. 271 (45), 28463-28468 (1996).
  34. Ma, T., et al. Thiazolidinone CFTR inhibitor identified by high-throughput screening blocks cholera toxin-induced intestinal fluid secretion. J Clin Invest. 110 (11), 1651-1658 (2002).
  35. Kopeikin, Z., Sohma, Y., Li, M., Hwang, T. C. On the mechanism of CFTR inhibition by a thiazolidinone derivative. J Gen Physiol. 136 (6), 659-671 (2010).
  36. Wang, X. F., Reddy, M. M., Quinton, P. M. Effects of a new cystic fibrosis transmembrane conductance regulator inhibitor on Cl- conductance in human sweat ducts. Exp Physiol. 89 (4), 417-425 (2004).

Tags

Biokjemi cystisk fibrose CFTR rensing tilberedning klorid kanal kanalfunksjon iodide utstrømming potense
Funksjonell tilberedning og Channel Aktivitet Målinger av Renset villtype og Mutant CFTR Protein
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Eckford, P. D. W., Li, C., Bear, C.… More

Eckford, P. D. W., Li, C., Bear, C. E. Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein. J. Vis. Exp. (97), e52427, doi:10.3791/52427 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter