Abstract
L'identification de la toxicité pour la reproduction des milliers de produits chimiques présents dans notre environnement a été l'un des défis les plus alléchantes dans le domaine de la santé environnementale. Cela est dû en partie à la rareté des systèmes modèles qui peuvent (1) récapituler précision touches caractéristiques des processus de reproduction et (2) le font dans un moyen à la mode à haut débit, sans la nécessité d'un grand nombre d'animaux vertébrés.
Nous décrivons ici un essai chez le nématode C. elegans qui permet l'identification rapide des substances toxiques de la lignée germinale en surveillant l'induction d'embryons aneuploïdes. En faisant usage d'une ligne rapporteur GFP, des erreurs dans la ségrégation des chromosomes résultant de la perturbation de la lignée germinale sont facilement visualisés et quantifiés par microscopie à fluorescence automatisé. Ainsi, la projection d'un ensemble particulier de composés pour sa toxicité peut être effectuée dans un format de plaque à 96 384 puits dans une affaire de jours. Une analyse secondaire des h positifsa peut être effectuée pour déterminer si les anomalies chromosomiques provenaient de la perturbation de la méiose ou de début erreurs chromosome de ségrégation embryonnaires. Au total, ce test représente une stratégie de premier passage rapide pour l'évaluation rapide de la dysfonction de la lignée germinale suite d'une exposition chimique.
Introduction
Il ya environ 87 000 produits chimiques inscrits pour le commerce aux États-Unis, mais seulement un petit nombre d'entre eux ont été testé pour ses effets potentiels sur la santé 1. Parmi ceux qui ont été testés, seule une partie a été évalué pour les effets sur la santé de la reproduction en partie à cause de la difficulté à déterminer l'altération des événements reproduction début chez les mammifères, en particulier au cours du développement des cellules germinales femelles et la différenciation. En effet, les premiers événements méiotiques ont lieu pendant les premiers stades du développement embryonnaire chez les mammifères femelles et sont donc difficiles d'accès et se accumuler dans les numéros appropriés à des fins de dépistage.
La lignée germinale fournit le lien crucial entre les générations, et sa fonction appropriée dépend de l'exécution précise du programme complexe de la division cellulaire et chromosomique appelée méiose. Le dérèglement du processus méiotique peut provoquer une réduction de la fertilité et de la productiongamètes et des embryons avec un nombre anormal de chromosomes, un état appelé aneuploïdie. Chromosomiques erreurs de ségrégation dans la méiose sont très pertinents pour la santé humaine. Les anomalies chromosomiques sont communs, avec une fréquence de 1 à 150 naissances vivantes, la trisomie 21, 18 et 13 ainsi que chromosomes X et Y étant les erreurs types les plus répandus 2,3. En outre, les malformations congénitales, y compris ceux d'origine chromosomiques, sont la principale cause de mortalité infantile aux États-Unis 4 L'idée que les influences environnementales peuvent affecter la ségrégation et le comportement chromosomique ne est pas nouveau 5, mais est encore mal comprise. Il est donc crucial pour enquêter sur laquelle des produits chimiques introduits dans notre environnement sont interférer avec la fertilité humaine, le développement des jeunes et la santé reproductive en général.
À la lumière de ces limites des modèles de mammifères, nous avons développé un test de l'écran à haut débit pour tester la toxicité de la reproduction dans le ascaris <em> C. elegans. Nous avons mobilisé plusieurs caractéristiques importantes offertes par ce système de modèle génétique communément employés comme sa petite taille, à faible coût, cycle de reproduction court, forte proportion de cellules germinales et la facilité de manipulation 6. Worms peuvent être cultivées dans des plaques à 96 puits ou dans des cultures liquides à volume élevé et à cause de leur transparence peuvent être directement visualisés sur des plaques pour la détection des journalistes fluorescentes. Le test décrit ci-dessous tire profit de ces caractéristiques et profite d'une souche du ver contenant le rapporteur fluorescent Pxol-1 :: GFP pour détecter la perturbation lignée germinale et l'induction de l'aneuploïdie embryonnaire.
L'utilisation de cette souche rapporteur est basé sur la présence des hommes généralement rares dans une population de vers principalement hermaphrodite. Ces mâles (<0,2%) proviennent naturellement de l'erreur dans la ségrégation du chromosome X 7. Cependant, comme la perturbation de la lignée germinale conduit souvent à des erreurs dans la ségrégation des autosomeset hétérochromosomes, il est corrélé à la fois avec une incidence élevée de mâles phénotype (X mauvaise ségrégation) ainsi que la létalité embryonnaire (autosome de mauvaise ségrégation). Pour détecter facilement l'induction des hommes tout en contournant la question de la mortalité embryonnaire, un promoteur spécifique mâle (xol-1) est utilisé pour diriger l'expression de la GFP dans les embryons précoces encore contenues dans l'utérus de la vis sans fin. En tant que tel, l'apparition d'embryons exprimant la GFP est utilisée comme indicateur de la présence d'embryons aneuploïdes. Cette méthode a déjà été utilisée pour identifier les gènes impliqués dans le maintien de la lignée germinale et la méiose 8,9. Adapté au dépistage chimique, cette souche est employé dans un milieu à l'écran à haut débit. Surtout, la souche rapporte fidèlement la aneugenicity de produits chimiques et est donc pertinent de paramètres de la reproduction des mammifères 10. L'essai décrit ici sera particulièrement utile pour les toxicologues dans les milieux de l'industrie pharmaceutique et chimique à la recherched'évaluer rapidement la toxicité des produits chimiques sur les effets sur la reproduction. En outre, ce test se aligne pleinement avec les priorités gouvernementales mises en évidence dans la toxicité dans le 21 e rapport de 11 siècle.
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Protocol
1. Préparation des bactéries Alimentation
NOTE: Cette section décrit la préparation de bactéries d'alimentation (la souche de E. coli OP50).
- Isoler une seule colonie de E. coli souche OP50 à partir d'un bouillon de lysogénie (LB) plaque de gélose et aseptique inoculer dans 300 ml de bouillon LB autoclave.
- Laisser la culture inoculé à croître pendant une nuit dans un agitateur à 200 tpm et 37 ° C, jusqu'à ce que la saturation soit atteinte.
- Transférer le OP50 en 6 tubes de 50 ml coniques stériles, pré-pesées. Pellet les bactéries par centrifugation pendant 5 min à 6000 tpm (5000 xg).
- Jeter le surnageant et laver les bactéries avec 50 ml d'M9 stérile. Répéter deux fois.
- Après le second lavage retirer le M9 restant, assurant qu'aucun M9 est laissé dans le tube.
- Déterminer le poids de la pastille par pesée du tube contenant le culot de bactéries et soustraire le poids du tube conique de 50 ml.
- Reprendre le culot in M9 à une concentration de 100 mg / ml.
- Conserver la solution de OP50 à 4 ° C jusqu'à son utilisation pour la culture de la vis sans fin.
2. Préparation de nématodes croissance à moyen (NGM) des boîtes de Petri
NOTE: Cette section décrit la préparation de plaques NGM Petri, qui sont les plaques où le C. vers elegans sont maintenues en routine en laboratoire.
- Autoclave le milieu de gélose NGM.
- En utilisant des procédures stériles, distribuer 17 ml d'une solution de gélose NGM dans des boîtes de Pétri de 6 cm en utilisant une pompe péristaltique.
NOTE: Une quantité constante d'agar dans les plaques réduit le besoin de recentrer le microscope lors du passage d'une plaque à l'autre. - Laisser les plaques à température ambiante pendant 2 à 3 jours avant utilisation pour laisser la gélose solidifier et permettre à l'excès d'humidité de se évaporer.
- Ensemencer les plaques NGM en utilisant une technique stérile. Appliquer 1-2 gouttes de culture liquide OP50 et diffuser l'aide d'une tige de verre. Veillez à ne pasfaire passer le gazon bactérien tout le chemin vers les bords des plaques.
- Laisser la pelouse OP50 à croître pendant 1-2 jours à la température ambiante avant d'utiliser les plaques à croître vers.
3. Préparation d'une population de Worm synchrone
NOTE: Le cycle de vie de C. elegans est composé du stade embryonnaire, quatre stades larvaires (L1-L4) et l'âge adulte. Cette section décrit la préparation d'une population de vers l'âge synchrone. Tous les matériaux entrant en contact avec C. elegans après le traitement de l'eau de Javel doivent être stériles.
- Jour 1 - Préparation de gravides Worm population
- Utilisez des assiettes NGM dans lequel la majorité de la population de vers se compose de larves L1 affamés.
- Recueillir les larves L1 avec un ver stérilisée ramasser et de les transférer au frais 6 cm de plaques NGM ensemencé avec OP50. Incuber pendant environ 65 heures à 20 ° C jusqu'à ce que la majorité des vers adultes sont gravides. Àéviter plaque surpeuplement et permettent les vers de se développer sans épuiser les bactéries, ne pas transférer plus d'un ou deux groupes de larves L1 à chaque plaque NGM frais.
- Jour 4 - Création d'un synchronisée L1 larves population
- Recueillir les vers gravides des plaques NGM en les lavant avec 1-2 ml de M9 et de les transférer à un tube conique de 15 ml.
- Laissez les vers gravides sédimentent au fond du tube de 15 ml conique pour environ 5-10 min. Eliminer le surnageant sans perturber le culot à vis sans fin.
- Transférer le culot de ver 2-4 microtubes et ajouter 1 ml d'eau de Javel / solution de NaOH. Incuber pendant 2-3 min à température ambiante. Surveillez la progression de la réaction sous la loupe binoculaire pour confirmer tous les vers sont morts. Ne pas blanchir plus de 5 min que les embryons pourraient mourir.
- Recueillir les vers par centrifugation pendant 1 min à 3000 rpm (900 xg). Retirer le surnageant et ajouter 1 ml de M9 stérileneutraliser la réaction.
- Laver les vers deux fois par centrifugation pendant 1 min à 3000 rpm (900 x g).
- Retirer le surnageant et ajouter M9 jusqu'à 100-200 ul.
- En utilisant une pipette Pasteur en verre ajouter une goutte de la vis sans fin / M9 mélanger pour effacer plaques NGM et incuber pendant au moins 24 heures à 20 ° C pour permettre aux embryons éclosent.
REMARQUE: Sans nourriture la croissance des larves sera arrêtée au stade L1.
- Jour 5 - Création d'un synchronisée larves L4 population
- Recueillir les larves L1 à partir des plaques NGM claires par lavage des plaques avec 2.1 ml de M9 et les transférer dans un tube conique de 15 ml.
- Laissez les morts vers adultes sédiment au fond du tube conique de 15 ml pendant environ 5 min.
- Recueillir le surnageant, où les vers sont L1, dans un nouveau tube conique de 15 ml, et précipiter les vers par centrifugation pendant 2 min à 2600 rpm (1000 xg).
- Eliminer le surnageant leyant environ 500 pi.
- Déterminer la concentration de la solution vers dans M9 en comptant le nombre de vers dans 10 ul de gouttes à l'aide d'un stéréomicroscope. Comptez au moins 5 gouttes.
- Ajuster la concentration des vers à 20-25 vers / ul et ajouter 50 ul du ver / M9 mélange sur des plaques NGM ensemencés avec OP50.
- Incuber pendant 65 heures à 15 ° C (pour l'incubation à travers le week-end) pour permettre à la population synchronisée L1 à grandir jusqu'à ce qu'ils atteignent le stade L4.
4. Exposition de Worms à des produits chimiques dans les plaques à 96 puits
NOTE: Cette section décrit l'utilisation de Pxol1 :: rapporteur transcriptionnel GFP contenant C. souche elegans pour le dépistage de l'induction de l'aneuploïdie.
- Recueillir les larves L4 à partir des plaques NGM claires par lavage des plaques avec 2.1 ml de M9 et les transférer dans un tube conique de 15 ml.
- Laissez le L4 vers sédiments au fond de la15 ml tube conique de environ 5-10 min. Eliminer le surnageant sans perturber le culot à vis sans fin.
- Ajouter 3-5 ml de M9 et déterminer la concentration de la solution vers dans M9 en comptant le nombre de vers dans 10 ul de gouttes à l'aide d'un stéréomicroscope. Comptez au moins 5 gouttes pour chaque échantillon.
- Remettre en suspension les vers à une concentration de 1,000 / ml dans les vers M9.
- Diluer les bactéries OP50 de l'article 1 10 fois avec M9. Assurez-vous que les bactéries remises en suspension atteignent la température ambiante parce que la température inférieure affecte le développement du ver.
- En utilisant une pipette multicanaux, d'abord ajouter 100 ul du ver / M9 mélange (de l'étape 4.4) et puis ajouter 400 pl des bactéries OP50 dilué (de l'étape 4.5) pour chaque puits d'une 2 ml ronde profonde de plaque de 96 puits à fond. À la fin, chaque puits aura 100 vers dans 500 pi.
- Ajouter 0,5 ul de la substance d'essai ou le contrôle approprié pour les puits souhaités, pour parvenir à une concentr finale suggéréation de 100 uM, une concentration couramment utilisé dans les écrans chimiques en C. elegans 12. Exposer l'éthanol ou le DMSO témoins de solvant à une concentration finale de 0,1%.
NOTE: Nous vous recommandons l'utilisation de nocodazole (100 M) comme témoin positif. - Sceller la plaque avec un film adhésif. Ne oubliez pas de sceller la plaque bien de prévenir la contamination croisée entre les puits.
- Envelopper la plaque avec une feuille d'aluminium.
- Transférer la plaque à un agitateur (170 à 180 rpm) de la température appropriée pour la longueur de temps appropriée (24 ou 65 h). La température de la pièce affecte la croissance des vers; maintenir la température autour de 20 ° C.
Acquisition 5. Image gravides Worms dans une plaque 384 puits
NOTE: Cette section décrit l'utilisation d'un microscope à haute teneur à l'image de la Pxol1 exposée :: vers GFP, de visualiser l'expression de la GFP dans les embryons dans l'utérus d'hermaphrodites adultes. Pourchaque plaque 384 puits à cribler, utiliser des vers de plaques 4 x 96 puits.
- Après exposition aux produits chimiques dans le shaker, laissez la plaque à 96 puits de repos pendant 10-15 min pour permettre les vers adultes dans les sédiments au fond de la plaque.
- En utilisant une pipette multicanaux, retirer 350 pi de la M9, en faisant très attention à ne pas déranger les vers dans le fond de la plaque.
- Laver les vers avec 1 ml de M9 et répétez l'étape 5.1.
- En utilisant une pipette multicanaux, retirez 1 ml de la M9, étant Vey attention à ne pas déranger les vers dans le bas de la plaque.
- En utilisant une pipette multicanaux, remettre en suspension les vers dans le M9 restante et de recueillir 100 pi du ver / M9 mélange des plaques à 96 puits et le charger dans les puits d'une murs noirs / plaque de fond claire 384 puits. Répétez le processus en utilisant les vers de plaques 4 x 96 puits, jusqu'à ce que tous les puits de la plaque 384 puits ont été chargés.
NOTE: Il est important pour tous les puits d'avoir le même volume pour augmenter lal'efficacité et la rapidité de la mise au point automatique pendant le processus d'acquisition d'image. Chaque puits doit contenir entre 80 à 100 vers. - Ajouter 1 ul de lévamisole (100 M) à chaque puits et laisser les vers incuber pendant environ 30 min.
REMARQUE: lévamisole agit comme un agoniste du récepteur de l'acétylcholine et immobilise les vers. - Transférer la plaque à un microscope haute teneur grand champ capable de fournir l'imagerie automatisée.
- Pour l'acquisition de l'image, utiliser une acquisition et d'analyse d'image logiciel teneur élevée selon les directives du fabricant. Sélectionnez l'objectif 4X pour acquérir une image par bien.
- Avant de commencer l'acquisition de l'image, réglez les paramètres d'imagerie de la GFP à 45 ms de l'exposition et de la résolution de 2160 x image pour 2160.
- Recueillir les données que le nombre de vers GFP-positives divisé par le nombre total de vers dans le puits, cette dernière mesure étant relativement constante entre les puits.
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Representative Results
L'exposition de la Pxol-1 :: GFP souche rapporteuse à des agents chimiques tels que les microtubules poison nocodazole (figure 1) conduit à l'induction d'une forte proportion d'embryons exprimant la GFP dans l'utérus d'hermaphrodites adultes exposés par rapport à un témoin de DMSO. Les embryons GFP-positives sont significativement plus lumineux que le fond faible fluorescence observé dans d'autres embryons ainsi que l'auto-fluorescence observée dans l'intestin des animaux. Vers exposés sont directement imagés sur des plaques 384 puits et le nombre de vers contenant au moins un embryon GFP-positives est compté pour chaque bien et normalisé par le nombre total de vers dans ce puits. Un résultat positif de l'écran chimique désigne un composé a induit une proportion d'embryons GFP-positives dans une population de ver à une fréquence supérieure à 1,7x DMSO 10. Suite à l'optimisation de seuil, l'analyse de contenu d'image élevée (voir fichier Matériaux) permet l'calc automatiséulation du nombre d'objets positifs (c.-à-embryons) divisé par le nombre total de vers dans le bien et est la méthode de choix pour la grande adaptation à l'échelle de l'essai.
| Commencez avec affamés population de vers de générer une population adulte gravide |
| ↓ (Culture 3 jours) |
| Blanchir la population adulte gravide |
| ↓ |
| Transfert vers blanchi pour effacer plaques NGM |
| ↓ (Culture 1 jour) |
| Recueillir synchronisée population L1 et transfert à plaques NGM avec OP50 |
| ↓ (Incuber 65 h à 15 ºC) |
| Recueillir la population L4 synchronisée |
| ↓ </ Td> |
| Distribuer 100 L4 vers à chaque puits des plaques à 96 puits dans 0,5 ml de M9 / OP50 |
| ↓ |
| Ajoutez les produits chimiques (100 M) à chaque puits |
| ↓ (Incuber pendant 24 ou 65 heures) |
| Transférer 100 ul de la population adulte (80 gravide synchronisé vers) des plaques à 96 puits à une plaque 384 puits. |
| ↓ |
| Ajouter 1 ul de lévamisole dans chaque puits (1 uM concentration finale) |
| ↓ (Incuber 30 à 45 min) |
| Capturer et analyser les images de chaque puits à haute microscope contenu |
Tableau 1. flux de travail expérimental. Jour 1, l'utilisation de faim population de vers de générer une population adulte gravide. Jour 4, bleach de la population adulte gravide pour générer une population de L1 synchronisée. Le jour 5, le transfert de la population L1 plaques NGM claires à OP50 ensemencé des plaques NGM pour générer une population de L4 synchronisée. Jour 8, transférer la population L4 synchronisé à la plaque à 96 puits et les exposer aux différents produits chimiques. Jour 9 et 11 jours, transférer les adultes gravides exposées à une plaque 384 puits à imager avec un microscope à forte teneur.
| M9 tampon - 1 L | |
| 1. Mélanger les ingrédients suivants dans un grand bécher ou un cylindre gradué en utilisant une barre d'agitation magnétique | |
| 3 g KH 2 PO 4 | |
| 6 g de Na 2 HPO 4 | |
| 5 g de NaCl | |
| 1 ml de MgSO 4 1 M | |
| H 2 O à 1 L. | |
| 2. Aliquoter dans des bouteilles de taille appropriée (300 ml à 500 ml bouteilles de taille) | |
| 3. Stériliser à l'autoclave pendant 30-60 min | |
| NGM médias pour les plaques - 4 L | |
| 1. Ajouter ce qui suit dans un erlenmeyer, puis remplir à 4 L: | |
| 12 g de NaCl | |
| 10 g Bactopeptone | |
| Agar 80 g | |
| 2. Ajouter et bien mélanger: | |
| 4 ml de cholestérol (5 mg / ml) | |
| 4 ml de CaCl2 (1 M solution mère) | |
| 4 ml MgSO 4 (1 M solution mère) | |
| 3. autoclave pendant 30-60 min | |
| 4. Laisser refroidir légèrement et ajouter 100 ml de KH 2 PO | |
| LB support - 1 L | |
| 1. Ajouter ce qui suit à 800 ml H 2 O | |
| 10 g de Bacto-tryptone. | |
| 5 g d'extrait de levure. | |
| 10 g de NaCl. | |
| 2. Ajuster le pH à 7,5 avec NaOH. | |
| 3. Réglez le volume à 1 L avec dH 2 O | |
| 4. Stériliser par autoclavage pendant 30 à 60 min | |
| solution d'eau de Javel pour la synchronisation des populations - 50 ml | |
| 7,5 ml de NaOH 10 N | |
| 6 ml eau de Javel (régulière) | |
| 36,5 ml dH 2 O |
Tableau 2. Solutions.
Figure 1:. Exemples d'images obtenues à partir de l'exposition de la Pxol-1 :: GFP souche rapporteuse de contrôler DMSO et nocodazole de contrôle positif Dans cet exemple, les vers ont été exposés pendant 24 heures à nocodazole ou le DMSO Pxol-1 :: GFP vers ont été. exposés à (A) 0,1% de DMSO (témoin négatif) ou (B) 100 uM nocodazole (témoin positif) et imagé dans des plaques à 384 puits. Flèche rouge: GFP embryons positifs clairement visibles dans l'utérus de nocodazole traité une vis sans fin. Barre d'échelle = 1 mm. (C) et (D) sont amplifiés parties de (A) et (B), respectivement. Barre d'échelle = 0,33 mm.
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Discussion
La méthode décrite ici constitue la première stratégie de grande échelle pour l'identification de substances toxiques de la lignée germinale. Il nécessite l'utilisation d'un transgénique GFP Pxol-1 :: GFP contenant la souche qui rend fidèlement l'induction de l'aneuploïdie dans les embryons précoces qui est utilisé comme un proxy pour le dysfonctionnement de la lignée germinale. La méthode implique la synchronisation minutieuse d'un C. elegans population de vers et de l'exposition à des produits chimiques vers en format 96 puits suivi par imagerie des vers GFP-positives par microscopie automatisée à haute teneur.
Plusieurs étapes de ce protocole sont essentiels à la cohérence des résultats. Premièrement, les populations de vers doivent être extrêmement synchrone comme pour maximiser le nombre de larves L4 correctement mise en scène qui sera utilisé pour l'exposition. Pour cette raison, la méthodologie décrite ici comprend deux étapes de synchronisation, d'abord par le blanchiment de la population de vers, puis par la famine L1. Le deuxième paragraphe importantecompteur de cette méthode est la durée d'exposition. Les vers sont régulièrement exposés soit pour 24 h ou 65 h. Comme la méiose est un processus continu en C. elegans, ces deux fenêtres d'exposition permet la capture des événements soit modifié fin de la méiose (24 h) ou deux événements méiotiques précoces et tardifs (65 h). Il est toutefois important de noter que l'exposition semble plus à mieux prédire la toxicité de la reproduction chez les mammifères 10.
Un aspect particulièrement intéressant du procédé est sa flexibilité. Alors que le protocole est conçu pour criblage à haut débit, une version réduite de l'essai peut être effectué pour le criblage d'un plus petit nombre d'échantillons en utilisant des plaques à 24 puits ou des tubes de 1,5 ml. L'abaissement de l'échelle de l'écran permet le test d'un plus grand nombre de vers par échantillon qui pourraient augmenter la sensibilité du test. Dans le format actuel, criblage de composés en quatre exemplaires est recommandé de fournir confiance statistique élevé dans le aneuploidy taux mesurés. Un obstacle potentiel dans cette grande méthodologie échelle vient de la nécessité pour la détection automatisée d'embryons GFP-positives. Bien que cette tâche peut être facilement réalisée par oeil, la mise en place minutieuse des paramètres appropriés sur le logiciel d'analyse d'image, idéalement avec un spécialiste de l'imagerie, est crucial pour l'automatisation de la procédure. En outre, au-delà de la détection d'embryons GFP-positives, la validation secondaire des résultats doit être effectuée afin de déterminer si des erreurs chromosomiques sont d'origine embryonnaire ou la méiose. Nous avons précédemment montré que les dosages secondaires sont facilement réalisées en C. elegans et inclure la DAPI-coloration des noyaux germinales ainsi que l'acridine orange coloration des vers pour la mesure de l'apoptose 10. De ces deux tests simples, la progression anormale travers la méiose, morphologie nucléaire anormale et la fragmentation ainsi que la perte des cellules germinales peuvent tous être évalués.
Pris ensemble, nous avons described ici les étapes nécessaires à l'évaluation rapide de la toxicité de la lignée germinale en utilisant le système modèle C. elegans. Surtout, l'utilisation de l'aneuploïdie dans le ver comme un marqueur de la toxicité de la lignée germinale est un dosage pertinent, car il est prédictive de mammifères paramètres de toxicité de la reproduction y compris diminution de la taille des portées et des défauts de l'ovaire 10. Ce est d'une importance particulière que des effets toxiques sur la lignée germinale femelle sont particulièrement pénibles pour enquêter. Ainsi, ce test rapide offre une alternative aux grands essais sur les animaux comme un premier écran de toxicité de passe et met en lumière l'effet des expositions aux produits chimiques environnementaux sur divers aspects du programme de la méiose complexe.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60 mm Vented, sharp edge Petri dishes | Tritech | T3315 | |
| Agar | Apex | 20-274 | |
| Axygen 96-well clear round bottom 2 ml polypropylene deep well plate | Corning | P-DW-20-C-S | |
| Bactopeptone | Apex | 20-261 | |
| Bacto-tryptone | Fisher Scientific | BP1421-2 | |
| Bleach | Clorox | ||
| Calcium chloride (CaCl2) | VWR | AA12316-A1 | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | ICN10138225 | |
| DMSO | VWR | IC19018680 | |
| E. coli (OP50) | Caenorhabditis Genetics Center | http://www.cbs.umn.edu/cgc | |
| Ethanol 200 proof | VWR | EM-4455S | |
| Greiner CELLSTAR 384 well plates | Sigma-Aldrich | M1937-32EA | |
| ImageXpress Micro XLS System | Molecular Devices | ||
| Levamisole hydrochloride | Fluka | 31742 | |
| Magnesium sulfate anhydrous (MgSO4) | VWR | 97061-438 | |
| MetaXpress High Content Image Acquisition & Analysis Software | Molecular Devices | ||
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Rayon films for biological cultures | VWR | 60941-086 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S318 | |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | VWR | BDH0316 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ 745 | This microscope has a total magnification form 3.35X to 300X. Any microscope with similar characteristics will work. |
| TY2441 C. elegans, Pxol-1::GFP reporter strain | Caenorhabditis Genetics Center | http://www.cbs.umn.edu/cgc | |
| Yeast extract | Becton Dickinson | 212750 |
References
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