Umfassende Beurteilung der Keimbahn Chemical Toxicity Mit der Nematode<em> Caenorhabditis elegans</em
Summary
We describe the detailed steps of a high-throughput chemical assay in the nematode Caenorhabditis elegans used to assess germline toxicity. In this assay, disruption of germline function following chemical exposure is monitored using a fluorescent reporter specific to aneuploid embryos.
Abstract
Die Ermittlung der Reproduktionstoxizität von den Tausenden von in der Umwelt vorhandenen Chemikalien ist eines der verlockenden Herausforderungen im Bereich Umwelt und Gesundheit. Dies ist zum Teil auf den Mangel an Modellsystemen, die (1) exakt zu rekapitulieren können Tasten Funktionen der reproduktiven Prozesse und (2), tun dies in einem mittel- bis Hochdurchsatz-Mode, ohne die Notwendigkeit für eine hohe Anzahl von Wirbeltieren.
Wir beschreiben hier einen Test in dem Fadenwurm C. elegans, die die schnelle Identifizierung von Keimbahn-Giftstoffe können durch die Überwachung der Induktion von aneuploid Embryonen. Durch die Verwendung eines GFP-Reporter Linie ist, werden Fehler in der Chromosomensegregation von Keimbahnunterbrechung resultierende leicht visualisiert und durch automatisierte Fluoreszenzmikroskopie quantifiziert. So ist die Durchmusterung einer bestimmten Satz von Verbindungen für ihre Toxizität in einer 96- bis 384-Well-Plattenformat in wenigen Tagen durchgeführt werden. Sekundäranalyse der positiven hseine durchgeführt, um festzustellen, ob die Chromosomenanomalien von meiotischen Störung oder aus frühen embryonalen Chromosomensegregation Fehler entstanden ist. Insgesamt dieser Test einen schnellen First-Pass-Strategie für die schnelle Beurteilung der Keimbahn Dysfunktion folgenden chemischen Exposition.
Introduction
Es gibt rund 87.000 Chemikalien für den Handel in den Vereinigten Staaten registriert, aber nur eine kleine Anzahl von ihnen haben zu möglichen Gesundheitsschäden 1 getestet. Von denen, die getestet wurden, wurde nur ein Teil für die reproduktive Gesundheitseffekte teilweise aufgrund der Schwierigkeit bei der Bestimmung der Veränderung der ersten fortpflanzungs Ereignisse bei Säugern, insbesondere bei weiblichen Keimzellentwicklung und -differenzierung bewertet. Tatsächlich sind die ersten Reife Veranstaltungen finden während der frühen Stadien der Embryonalentwicklung bei weiblichen Säugetieren und sind deshalb schwer zugänglich und sammeln in den Zahlen für Screening-Zwecken.
Die Keimbahn bietet das entscheidende Bindeglied zwischen den Generationen, und ihre jeweilige Funktion ist abhängig von der genauen Ausführung der komplizierten Programm der Zell- und Chromosomenteilung bezeichnet Meiose. Dysregulation des Reifeprozess kann zu einer verringerten Fruchtbarkeit und die Produktion zur Folge habenGameten und Embryonen mit einer abnormalen Anzahl von Chromosomen, eine Bedingung genannt Aneuploidie. Chromosomensegregation Fehler in der Meiose sind von großer Bedeutung für die menschliche Gesundheit. Chromosomenanomalien sind häufig, mit einer Frequenz von 1 150 Lebendgeburten, Trisomie 21, 18 und 13 sowie die X- und Y-Chromosomen-Fehler als die am weitesten verbreiteten Arten 2,3. Außerdem angeborene Fehlbildungen, auch die der chromosomalen Ursprungs, sind die Hauptursache für Kindstod in der US 4 Die Idee, dass Umwelteinflüsse können Chromosomensegregation und das Verhalten beeinflussen, ist nicht neu 5, ist aber noch weitgehend unverstanden. Es ist daher wichtig zu untersuchen, welche der in unsere Umgebung eingeführt Chemikalien mit menschlichen Fruchtbarkeit, Frühentwicklung und die allgemeine reproduktive Gesundheit zu stören sind.
Angesichts dieser Einschränkungen der Säugetier-Modelle haben wir ein Hochdurchsatz-Screening-Test entwickelt, um die Reproduktionstoxizität im Fadenwurm testen <em> C. elegans. Wir haben mehrere wichtige Merkmale dieses üblicherweise verwendeten genetischen Modellsystem angeboten mobilisiert wie ihre geringe Grße, geringen Kosten, kurze Reproduktionszyklus, hohen Anteil an Keimzellen und leichte Handhabbarkeit 6. Würmer können in 96-Well-Platten oder in großen Mengen Flüssigkulturen gezüchtet werden und wegen ihrer Transparenz kann direkt auf Platten zur Detektion von fluoreszierenden Reportern abgebildet werden. Das im Folgenden beschriebene Test nutzt diese Eigenschaften und nutzt eine Wurm-Stamm, dem fluoreszierenden Reporter Pxol-1 :: GFP zu Keimbahnunterbrechung und Induktion von embryonalen Aneuploidie zu erkennen.
Die Verwendung dieser Reporterstamm ist auf der in der Regel seltenen Auftretens von Männchen in einer hauptsächlich Zwitterwurmpopulation beruht. Diese Männchen (<0,2%) natürlicherweise von Fehler in der Trennung von dem X-Chromosom 7. Da Keimbahnunterbrechung führt häufig zu Fehlern bei Trennung von Autosomenund heterochromosomes korreliert er sowohl mit einer erhöhten Inzidenz von männlichen Phänotyp (X missegregation) sowie embryonale Letalität (Autosom missegregation). Um die Induktion von Männern leicht erkennen, unter Umgehung der Frage der embryonalen Letalität, ist männlich spezifischen Promotor (xol-1) verwendet werden, um die Expression von GFP in frühen Embryonen noch innerhalb des Wurms Gebärmutter enthaltenen fahren. Als solches wird das Auftreten von GFP-exprimierenden Embryonen als Proxy für das Vorhandensein von aneuploiden Embryonen verwendet. Dieses Verfahren wurde zuvor verwendet worden, um Gene in die Keimbahn Wartung und Meiose 8,9 gebracht identifizieren. Um chemisches Screening angepasst wird dieser Stamm in einem Medium mit hohem Durchsatz Bildschirm beschäftigt. Wichtig ist, dass die Belastung getreu berichtet die aneugenicity von Chemikalien und ist daher für Säugetier reproduktiven Endpunkte 10. Der hier beschriebene Assay ist besonders nützlich, um Toxikologen in der pharmazeutischen und chemischen Industrie Einstellungen suchen seinum zeitnah die Toxizität von Chemikalien zu reproduktiven Endpunkte. Darüber hinaus dieser Test vollständig ausgerichtet mit den staatlichen Prioritäten in der Toxizität im 21. Jahrhundert 11 Bericht hervorgehoben.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die hier beschriebene Methode ist die erste groß angelegte Strategie zur Identifizierung von Keimbahn-Giftstoffe. Es erfordert die Verwendung eines GFP transgenen Pxol-1 :: GFP, die Belastung, die getreulich berichtet die Induktion von Aneuploidie in frühen Embryonen, die als Proxy für die Keimbahnstörungen verwendet wird. Das Verfahren beinhaltet die sorgfältige Synchronisation eines C. elegans Wurm Bevölkerung und Belichtung Würmer Chemikalien in 96-Well-Format, gefolgt von Abbildung der GFP p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank the following funding sources NIH ES020353 and the Colgate-Palmolive Alternative Research Grant award for making this work possible.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 60mm vented, sharp edge Petri Dishes | Tritech | T3315 | |
| Agar | Apex | 20-274 | |
| Axygen 96 Well Clear Round Bottom 2mL Polypropylene Deep Well Plate | Corning | P-DW-20-C-S | |
| Bactopeptone | Apex | 20-261 | |
| Bacto-tryptone | Fisher Scientific | BP1421-2 | |
| Bleach | Clorox | ||
| Calcium Chloride (CaCl2) | VWR | AA12316-A1 | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | ICN10138225 | |
| DMSO | VWR | IC19018680 | |
| E. coli (OP50) | Caenorhabditis Genetics Center | http://www.cbs.umn.edu/cgc | |
| Ethanol 200 proof | VWR | EM-4455S | |
| Greiner CELLSTAR 384 well plates | Sigma-Aldrich | M1937-32EA | |
| ImageXpress Micro XLS System | Molecular Devices | ||
| Levamisole hydrochloride | Fluka | 31742 | |
| Magnesium Sulfate Anhydrous (MgSO4) | VWR | 97061-438 | |
| MetaXpress High Content Image Acquisition & Analysis Software | Molecular Devices | ||
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Rayon Films for Biological Cultures | VWR | 60941-086 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S318 | |
| Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) | VWR | BDH0316 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ 745 | This microscope has a total magnification form 3.35x to 300x. Any microscope with similar characteristics will work. |
| TY2441 C. elegans, Pxol-1::GFP reporter strain | Caenorhabditis Genetics Center | http://www.cbs.umn.edu/cgc | |
| Yeast extract | Becton Dickinson | 212750 |
References
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