Nematod kullanma Germline Kimyasal zehirlilik Kapsamlı Değerlendirme<em> Caenorhabditis elegans</em
Summary
We describe the detailed steps of a high-throughput chemical assay in the nematode Caenorhabditis elegans used to assess germline toxicity. In this assay, disruption of germline function following chemical exposure is monitored using a fluorescent reporter specific to aneuploid embryos.
Abstract
Çevremizde bulunan kimyasalların binlerce üreme toksisitesinin belirlenmesi, çevre sağlığı alanında en kabartan zorluklardan biri olmuştur. Bu omurgalı hayvanların yüksek sayıda ihtiyaç duymadan, (1) doğru (2) yüksek verimli moda bir orta bunu yapmak üreme süreçlerinin tuşları özelliklerini özetlemek ve edebilirsiniz model sistemler azlığı kısmen kaynaklanmaktadır.
Biz nematod C. burada bir tahlil açıklamak Anöploid embriyoların indüksiyon izleyerek germlıne Toksik maddelerin hızla belirlenmesini sağlar elegans. GFP muhabiri hattının kullanımı yaparak, germ bozulma kaynaklanan kromozom ayrımı hataları kolayca görülebilir ve otomatik floresan mikroskobu ile ölçülebilir. Böylece toksisitesi bileşiklerin özel bir dizi tarama birkaç gün içinde bir 96- 384-kuyucuklu bir plaka biçiminde gerçekleştirilebilir. Pozitif h ikincil analizionun kromozom anomalileri mayoz bozulma veya erken embriyonik kromozom ayrımı hataları kaynaklanan olup olmadığını belirlemek için yapılabilir. Tamamen, bu deney, kimyasal maruziyet aşağıdaki germlıne disfonksiyonu hızlı değerlendirilmesi için hızlı ilk geçiş stratejisini temsil eder.
Introduction
Amerika Birleşik Devletleri ticaret için kayıtlı yaklaşık 87,000 kimyasallar, bu potansiyel sağlık etkileri 1 için test edilmiştir henüz sadece az sayıda bulunmaktadır. Test edilmiş olanların, sadece bir kısmı özellikle kadın germ hücre gelişimi ve farklılaşması sırasında memelilerde erken üreme olayların değişiklik belirlenmesinde zorluk nedeniyle kısmen üreme sağlığı etkileri için değerlendirilmiştir. Gerçekten de, birinci öz değişmesine ait olaylar dişi memelilerde embriyonik gelişiminin erken evrelerinde yer alan ve dolayısıyla erişim ve tarama amaçları için uygun sayıda toplama zordur.
germ kuşaklar arasındaki önemli bağlantıyı sağlar, ve uygun fonksiyon hücresel ve kromozomal bölünme karmaşık programın kesin yürütme mayoz olarak adlandırılan bağlıdır. Öz değişmesine ait işlemin bozulması fertilite düşüklüğü ve üretimi ile sonuçlanabilirkromozom anormal sayıda gamet ve embriyo, bir durum anöploidi olarak adlandırılan. Mayoz kromozom ayrımı hataları insan sağlığı için son derece önemlidir. Kromozom anomalileri 1 150 canlı doğumda sıklığı, Trizomi 21, 18 ve 13 gibi en yaygın türleri 2,3 olan X ve Y kromozomu hataları ile, yaygındır. Ayrıca, kromozomal kökenli olanlar dahil olmak üzere, konjenital malformasyonlar, ABD 4 çevresel etkiler kromozomal ayrımı ve davranışlarını etkileyebilir fikri bebek ölüm önde gelen nedenidir 5 yeni değil, ama yine de tam olarak anlaşılamamıştır. İnsan doğurganlık, erken gelişim ve genel üreme sağlığı engellemesini çevremiz içine kimyasalların hangi araştırmak için bu nedenle çok önemlidir.
Memeli modelleri, bu sınırlamaları sebebi olarak, <yuvarlak kurt üreme toksisitesini test etmek amacıyla yüksek verimli bir ekran deneyi geliştirdikem> C. elegans. Biz küçük boyutu, düşük maliyet, kısa üreme döngüsü, germ hücrelerinin yüksek oranda ve manipülasyon 6 kolaylığı olarak bu yaygın olarak kullanılan genetik model sistem tarafından sunulan birçok önemli özelliği seferber ettik. Solucanlar 96-oluklu plaka ya da yüksek hacimli sıvı kültürlerde yetiştirilebilir ve bu nedenle şeffaflığının doğrudan fluoresan muhabir saptanması için plakalar üzerinde görüntülenebilir. Aşağıda tarif edilen deney, bu özelliklerin avantajının ortaya germline bozulması ve embriyonik anöploidisi uyarılmasını tespit etmek için flüoresan raportör Pxol-1 :: GFP ihtiva eden bir sonsuz soyunun yararlanır.
Bu muhabir gerginlik kullanımı esas hermafroditik solucan nüfus erkeklerin genellikle nadir görülmesi dayanmaktadır. Bu erkek (<% 0.2) doğal X kromozomu 7 ayrılığı içinde hatasından kaynaklanmaktadır. Ancak, germ bozulma sık otozomal ayrılığı hatalara yol açarve heterochromosomes nedeniyle, erkek fenotip (X missegregation) yanı sıra, embriyonik öldürücülüğü (autosome missegregation) olarak yükseltilmiş bir oranı ile, her iki ilişkilidir. Embriyonik öldürücülük sorunu engellemeyi kolay kolay erkeklerde uyarılmasını tespit etmek için, bir erkek-özgü promoteri (xol-1), yine de, solucanların rahim içinde bulunan erken embriyolar GFP ekspresyonunu tahrik etmek için kullanılır. Bu nedenle, GFP ifade embriyo görünümü anöploid embriyoların varlığı için bir vekil olarak kullanılmaktadır. Bu yöntem, daha önce germlin bakım ve mayoz 8,9 karışmış genleri tanımlamak için kullanılır olmuştur. Kimyasal tarama Uyarlanmış, bu suş yüksek verimli ekranına bir ortamda kullanılır. Önemlisi, gerilme sadakatle kimyasalların aneugenicity raporları ve memeli üreme uç noktalara 10 nedenle alakalı. Burada anlatılan tahlil seyir ilaç ve kimya sanayi ayarlarında toksikoloji özellikle yararlı olacaktırhızla üreme uç noktaları yönelik kimyasalların toksisite değerlendirmek için. Ayrıca, bu deney tamamen 21. yüzyıl raporunda 11 Toksik vurgulanan devlet öncelikleri ile aynı hizaya.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada anlatılan yöntem germlıne Toksik maddelerin belirlenmesi için ilk büyük ölçekli stratejisini oluşturmaktadır. Bu sadakatle germ disfonksiyon için bir vekil olarak kullanılan erken embriyolar anöploidi indüksiyon raporları GFP transgenik Pxol-1 :: GFP içeren suşu kullanımını gerektirir. yöntem, bir C dikkat senkronizasyon gerektirir elegans solucan nüfus ve otomatik yüksek içerik mikroskobu ile GFP pozitif solucanlar görüntüleme ardından 96 kuyulu formatta kim…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank the following funding sources NIH ES020353 and the Colgate-Palmolive Alternative Research Grant award for making this work possible.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 60mm vented, sharp edge Petri Dishes | Tritech | T3315 | |
| Agar | Apex | 20-274 | |
| Axygen 96 Well Clear Round Bottom 2mL Polypropylene Deep Well Plate | Corning | P-DW-20-C-S | |
| Bactopeptone | Apex | 20-261 | |
| Bacto-tryptone | Fisher Scientific | BP1421-2 | |
| Bleach | Clorox | ||
| Calcium Chloride (CaCl2) | VWR | AA12316-A1 | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | ICN10138225 | |
| DMSO | VWR | IC19018680 | |
| E. coli (OP50) | Caenorhabditis Genetics Center | http://www.cbs.umn.edu/cgc | |
| Ethanol 200 proof | VWR | EM-4455S | |
| Greiner CELLSTAR 384 well plates | Sigma-Aldrich | M1937-32EA | |
| ImageXpress Micro XLS System | Molecular Devices | ||
| Levamisole hydrochloride | Fluka | 31742 | |
| Magnesium Sulfate Anhydrous (MgSO4) | VWR | 97061-438 | |
| MetaXpress High Content Image Acquisition & Analysis Software | Molecular Devices | ||
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Rayon Films for Biological Cultures | VWR | 60941-086 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S318 | |
| Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) | VWR | BDH0316 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ 745 | This microscope has a total magnification form 3.35x to 300x. Any microscope with similar characteristics will work. |
| TY2441 C. elegans, Pxol-1::GFP reporter strain | Caenorhabditis Genetics Center | http://www.cbs.umn.edu/cgc | |
| Yeast extract | Becton Dickinson | 212750 |
References
- Office, U. G. A. Report No. GAO-06-1032T. Actions are needed to improve the effectiveness of EPA’s chemical review program. Testimony before the Committee on Environment and Public Works. US Senate. , (2009).
- Fragouli, E., Wells, D., Delhanty, J. D. Chromosome abnormalities in the human oocyte. Cytogenet Genome Res. 133 (2-4), 107-118 (2011).
- Hassold, T., Hunt, P. A., Sherman, S. Trisomy in humans: incidence, origin and etiology. Curr Opin Genet Dev. 3 (3), 398-403 (1993).
- Heron, M., Hoyert, D. L., Murphy, S. L., Xu, J., Kochanek, K. D., Tejada-Vera, B. Deaths: final data for 2006. Natl Vital Stat Rep. 57 (14), 1-134 (2009).
- Hunt, P. A. Meiosis in mammals: recombination, non-disjunction and the environment. Biochem Soc Trans. 34 (Pt 4), 574-577 (2006).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
- Hodgkin, J., Horvitz, H. R., Brenner, S. . Nondisjunction Mutants of the Nematode CAENORHABDITIS ELEGANS.Genetics. 91 (1), 67-94 (1979).
- Nicoll, M., Akerib, C. C., Meyer, B. J. X-chromosome-counting mechanisms that determine nematode sex. Nature. 388 (6638), 200-204 (1997).
- Kelly, K. O., Dernburg, A. F., Stanfield, G. M., Villeneuve, A. M. Caenorhabditis elegans msh-5 is required for both normal and radiation-induced meiotic crossing over but not for completion of meiosis. Genetics. 156 (2), 617-630 (2000).
- Allard, P., Kleinstreuer, N. C., Knudsen, T. B., Colaiacovo, M. P. A Screening Platform for the Rapid Assessment of Chemical Disruption of Germline Function. Environ Health Perspect. 121 (6), 717-724 (2013).
- National Research Council. . Toxicity Testing in the 21st Century: A Vision and a Strategy. , (2007).
- Boyd, W. A., Smith, M. V., Kissling, G. E., Freedman, J. H. Medium- and high-throughput screening of neurotoxicants using C. elegans. Neurotoxicol Teratol. 32 (1), 68-73 (2010).
