Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

הערכה מקיפה של תאי מין כימי רעילות שימוש נמטודות Published: February 22, 2015 doi: 10.3791/52445
Automatic Translation
1, 3, 1,2
1Institute for Society and Genetics, University of California, Los Angeles, 2Environmental Health Sciences, University of California, Los Angeles, 3California Nanosystems Institute, Department of Molecular and Medical Pharmacology, University of California, Los Angeles

Abstract

זיהוי רעיל הרבייה של אלפי כימיקלים הנמצאים בסביבה שלנו היה אחד האתגרים המפתים ביותר בתחום בריאות והסביבה. זה נובע בחלקו המיעוט של מערכות מודל ש( 1) יכול במדויק לשחזר תכונות מפתחות של תהליכי רבייה ו( 2) לעשות זאת בצורה בינונית עד תפוקה גבוהה, ללא הצורך במספר גבוה של בעלי חיים בעלי חוליות.

אנו מתארים כאן assay בג נמטודות elegans המאפשר זיהוי המהיר של רעלים בתאי מין על ידי ניטור האינדוקציה של עוברי aneuploid. על ידי עשיית שימוש של קו כתב GFP, טעויות בהפרדת כרומוזום הנובעת מהפרעה בתאי מין הם דמיינו בקלות ולכמת על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי האוטומטי. כך ההקרנה של מערכת מסוימת של תרכובות לרעילותו יכולה להתבצע בפורמט צלחת 96 384 היטב בעניין של ימים. ניתוח משני של h החיובישלה ניתן לבצע כדי לקבוע אם מומי כרומוזום מקורו מהפרעת meiotic או מטעויות הפרדה כרומוזום עוברית מוקדמות. בסך הכל, assay זה מייצג אסטרטגיה הראשונה לעבור מהר להערכה המהירה של בעיות בתפקוד תאי מין בעקבות חשיפה כימית.

Introduction

ישנם כ 87,000 כימיקלים רשומים למסחר בארצות הברית, אך רק מספר קטן של אלה נבדקו להשפעות בריאותיות פוטנציאליות 1. מבין אלה שנבדקו, רק חלק כבר העריך להשפעות פוריות נובעות בחלקו הקושי בקביעת שינוי באירועי הרבייה המוקדמים ביונקים, במיוחד בפיתוח תאי נבט נשי ובידול. ואכן, אירועי meiotic הראשונים יתקיימו במהלך המוקדמים של התפתחות עוברית ביונקי נקבת השלבים ולכן קשים לגישה וללאסוף במספרים מתאימים למטרות הקרנה.

Germline מספקת קישור החיוני בין דורות, והפונקציה המתאימה תלויה בביצוע המדויק של התכנית המורכבת של חטיבת הסלולר וכרומוזומליות מכונה מיוזה. אי סדיר של תהליך meiotic עלול לגרום לירידה בפוריות והייצור שלתאי מין ועוברים עם מספר לא תקין של כרומוזומים, מצב המכונים aneuploidy. טעויות הפרדה כרומוזום במיוזה רלוונטיות מאוד לבריאות אדם. חריגות כרומוזום נפוצות, בתדירות של 1 ל 150 לידות חיות, 21 טריזומיה, 18 ו -13, כמו גם טעויות כרומוזום X ו- Y להיות הסוגים הנפוצים ביותר 2,3. יתר על כן, מומים מולדים, כוללים אלה של מקורות כרומוזומליות, הם הגורם המוביל למוות תינוק בארה"ב 4 הרעיון שהשפעות סביבתיות יכולות להשפיע על הפרדה והתנהגות כרומוזומלית הוא לא חדש 5, אבל עדיין הבין היטב. לכן זה חיוני כדי לחקור מי מהכימיקלים מוחדרים הסביבה שלנו מפריעים לפוריות אדם, התפתחות מוקדמת ופוריות כוללת.

לאור המגבלות של המודלים של יונקים אלה, פיתחנו assay מסך תפוקה גבוהה כדי לבדוק רעילות רבייה בתולעת העגולה <em> C. elegans. יש לנו התגייס כמה תכונות חשובות המוצעות על ידי מערכת מודל גנטית זה נפוץ כגון גודלה הקטן, בעלות נמוכה, מחזור רבייה קצר, שיעור גבוה של תאי נבט וקלות מניפולציה 6. ניתן לגדל תולעים ב96-גם צלחות או בתרבויות נוזל בנפח גבוהות ובגלל השקיפות שלהם ניתן הדמיה ישירות על צלחות לגילוי של כתבי ניאון. Assay המתואר להלן מנצל מאפיינים אלה ומנצל את מתח תולעת המכיל את כתב ניאון GFP Pxol-1 :: לזהות הפרעה ואינדוקציה של aneuploidy העוברי בתאי מין.

השימוש במתח הכתב הזה מבוסס על ההתרחשות בדרך כלל נדירה של זכרים באוכלוסיית תולעת בעיקר מינית. גברים אלה (<0.2%) נובעים באופן טבעי משגיאה בהפרדה של כרומוזום X 7. עם זאת, כהפרעה בתאי מין בתדירות גבוהה גורם לשגיאות בהפרדה של autosomesושל heterochromosomes, והוא מתואם גם עם שכיחות גבוהה של פנוטיפ גברים (missegregation X) כמו גם קטלנית עוברי (missegregation אוטוזום). כדי לזהות בקלות האינדוקציה של גברים תוך עקיפת הבעיה של הקטלניות עובריים, אמרגן זכר ספציפי (xol-1) משמש לנהוג ביטוי של ה- GFP בעוברים מוקדמים הכילו עדיין בתוך הרחם של התולעת. ככזה, את המראה של עוברים להביע GFP משמש כמדד לנוכחות של עוברי aneuploid. שיטה זו שימשה בעבר לזיהוי גנים מעורבים בתחזוקה בתאי מין ו8,9 מיוזה. מותאם להקרנה כימית, זן זה הוא מועסק במדיום למסך תפוקה גבוהה. חשוב לציין, את המתח בנאמנות מדווח aneugenicity של כימיקלים ולכן הוא רלוונטי לנקודתי קצה רבייה של יונקים 10. Assay שתואר כאן יהיה שימושי במיוחד לtoxicologists בהגדרות תרופות ותעשייה כימית מחפשכדי להעריך במהירות את הרעילות של כימיקלים לנקודתי קצה רבייה. יתר על כן, assay זה מיישר באופן מלא עם סדרי העדיפויות הממשלתיות המודגשים ברעילות בדו"ח המאה ה -21 11.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנה של חיידקים האכלה

הערה: סעיף זה מתאר את ההכנה של חיידקי האכלה (OP50 זן E. coli).

  1. לבודד מושבה אחת של E. OP50 זן coli ממרק lysogeny (LB) צלחת אגר וסביבה נקיה מחיידקים לחסן לתוך 300 מיליליטר של מרק LB autoclaved.
  2. לאפשר לתרבות מחוסנת לגדול לילה שייקרה ב 200 סל"ד ו -37 מעלות צלזיוס, עד שהגיעה לרוויה.
  3. העבר את OP50 לתוך 6 צינורות סטרילי,-שקלו מראש 50 מיליליטר חרוטי. גלולה החיידקים על ידי צנטריפוגה 5 דקות ב6,000 סל"ד (XG 5000).
  4. בטל supernatant ולשטוף את החיידקים עם 50 מיליליטר של M9 סטרילי. חזור פעמיים.
  5. לאחר לשטוף את השני להסיר M9 שנותר, להבטיח שלא M9 נשאר בצינור.
  6. לקבוע את המשקל של גלולה ידי שקילת הצינור המכיל את גלולה החיידקים ולהפחית את המשקל של צינור חרוטי 50 מיליליטר.
  7. Resuspend i גלולהn M9 בריכוז של 100 מ"ג / מיליליטר.
  8. אחסן את פתרון OP50 ב 4 מעלות צלזיוס עד שהוא משמש לתרבות התולעת.

2. הכנת בינונית צלחות (NGM) פטרי נמטודות צמיחה

הערה: סעיף זה מתאר את הכנת צלחות פטרי NGM, המהוות את הצלחות שבו ג תולעי elegans נשמרים באופן שיגרתי במעבדה.

  1. החיטוי הבינוני אגר NGM.
  2. באמצעות נהלי סטרילי, לוותר 17 מיליליטר של תמיסה אגר NGM לתוך 6 סנטימטר צלחות פטרי באמצעות משאבת peristaltic.
    הערה: סכום קבוע של אגר בצלחות מפחית את הצורך במיקוד מחדש של מיקרוסקופ בעת מעבר מצלחת אחד למשנהו.
  3. השאר את הצלחות בטמפרטורת חדר למשך 2-3 ימים לפני השימוש כדי לתת אגר לחזק ולאפשר עודף הלחות להתאדות.
  4. זרע צלחות NGM באמצעות טכניקה סטרילית. החל 1-2 טיפות של נוזל תרבות OP50 ולהפיץ באמצעות מוט זכוכית. הקפד לאכדי להפיץ את דשא חיידקים כל הדרך עד לקצוות של הצלחות.
  5. לאפשר לדשא OP50 לגדול במשך 1-2 ימים בטמפרטורת חדר לפני השימוש בצלחות לגדול תולעים.

3. הכנת אוכלוסיית תולעת סינכרוני

הערה: מחזור החיים של ג elegans מורכב מהשלב העוברי, ארבעה שלבי זחל (L1-L4) ובבגרות. סעיף זה מתאר את ההכנה של אוכלוסייה בגיל-סינכרוני של תולעים. כל החומרים הבאים במגע עם C.elegans לאחר טיפול אקונומיקה חייבים להיות סטרילי.

  1. יום 1 - הכנת אוכלוסיית תולעת ההרה להולדת
    1. להשתמש בצלחות NGM שברוב אוכלוסיית התולעת מורכבת מזחלי L1 מורעבים.
    2. לאסוף את זחלי L1 עם תולעת מעוקרת לאסוף ולהעבירם ל6 צלחות NGM סנטימטר טריות זרע עם OP50. דגירה של כ -65 שעות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס עד שרוב התולעים הם מבוגרים הרה להולדת. ללהימנע מצפיפות יתר צלחת ולאפשר לגדול התולעים ללא מדלדל את החיידקים, לא להעביר אשכולות יותר מאחד או שניים של זחלי L1 לכל צלחת NGM טרי.
  2. יום 4 - הקמת המסונכרנת L1 זחלי אוכלוסייה
    1. לאסוף את התולעים הרה להולדת מצלחות NGM על ידי שטיפתם עם 1-2 מיליליטר של M9 ולהעביר אותם לצינור 15 מיליליטר חרוטי.
    2. בואו תולעים הרה להולדת משקעים התחתון של צינור חרוטי 15 מיליליטר במשך כ 5-10 דקות. הסר את supernatant מבלי להפריע גלולה התולעת.
    3. העבר את כדור תולעת 2-4 צינורות microcentrifuge ולהוסיף 1 מיליליטר של אקונומיקה / פתרון NaOH. דגירה של 2-3 דקות ב RT. מעקב אחר ההתקדמות של התגובה תחת סטראו כדי לאשר את כל התולעים מתים. לא להלבין יותר מ 5 דקות כעוברים יכולים למות.
    4. לאסוף את התולעים על ידי צנטריפוגה 1 דקות ב3,000 סל"ד (900 XG). הסר את supernatant ולהוסיף 1 מיליליטר של M9 סטרילי ללנטרל את התגובה.
    5. לשטוף את התולעים פעמיים על ידי צנטריפוגה 1 דקות ב3,000 סל"ד (900 XG).
    6. הסר את supernatant ולהוסיף M9 לעד 100-200 μl.
    7. בעזרת פיפטה פסטר זכוכית להוסיף טיפה של התולעת / M9 לערבב כדי לנקות צלחות NGM ומדגיר אותן לפחות 24 שעות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס, כדי לאפשר את העוברים ללבקוע.
      הערה: ללא מזון הצמיחה של הזחלים תיעצר בשלב L1.
  3. יום 5 - הקמת המסונכרנת L4 זחלי אוכלוסייה
    1. לאסוף את זחלי L1 מצלחות NGM ברורות על ידי שטיפת הצלחות עם 1-2 מיליליטר של M9 ולהעביר אותם לצינור 15 מיליליטר חרוטי.
    2. בואו משקעי תולעים בוגרות המתים לחלק התחתון של צינור חרוטי 15 מיליליטר במשך כ 5 דקות.
    3. אסוף את supernatant, שבו תולעי L1 הם, בצינור 15 מיליליטר חרוטי חדש, ולזרז את התולעים על ידי centrifuging 2 דקות ב2,600 סל"ד (1,000 XG).
    4. הסר את supernatant leaving כ -500 μl.
    5. קבע את הריכוז של תולעים פתרון M9 על ידי ספירת המספר של תולעים 10 טיפות μl באמצעות סטראו. לספור לפחות 5 טיפות.
    6. התאם את הריכוז של התולעים 20-25 תולעים / μl ולהוסיף 50 μl של התולעת / תערובת M9 לצלחות NGM זרע עם OP50.
    7. דגירה של 65 שעות ב 15 ° C (לדגירה דרך סוף השבוע) כדי לאפשר לאוכלוסייה המסונכרנת L1 לגדול עד שהם מגיעים לשלב L4.

4. חשיפה של תולעים לכימיקלים ב96-פלטות היטב

הערה: סעיף זה מתאר את השימוש בPxol1 :: כתב תעתיק GFP מכיל ג זן elegans למסך לאינדוקציה של aneuploidy.

  1. לאסוף את זחלי L4 מצלחות NGM ברורות על ידי שטיפת הצלחות עם 1-2 מיליליטר של M9 ולהעביר אותם לצינור 15 מיליליטר חרוטי.
  2. בואו משקעי תולעי L4 לתחתיתצינור חרוטי 15 מיליליטר במשך כ 5-10 דקות. הסר את supernatant מבלי להפריע גלולה התולעת.
  3. להוסיף 3-5 מיליליטר של M9 ולקבוע את הריכוז של תולעים פתרון M9 על ידי ספירת המספר של תולעים 10 טיפות μl באמצעות סטראו. לספור לפחות 5 טיפות עבור כל דגימה.
  4. Resuspend התולעים בריכוז של 1000 / מיליליטר תולעים בM9.
  5. לדלל את חיידקי OP50 מסעיף 1 פי 10 עם M9. ודא חיידקי resuspended להגיע לטמפרטורת חדר, כי טמפרטורה נמוכה משפיעה על התפתחות תולעת.
  6. בעזרת פיפטה רבה, להוסיף ראשון של התולעת / תערובת M9 (משלב 4.4) 100 μl ולאחר מכן להוסיף 400 μl של חיידקי OP50 המדולל (משלב 4.5) היטב בכל סיבוב עמוק 2 מיליליטר צלחת 96-היטב תחתונה. בסוף, כל אחד גם תהיה לי ב 500 μl 100 תולעים.
  7. הוסף 0.5 μl של שתי כימי בדיקה או בקרה הנאותה לבארות הרצויות, כדי להשיג concentr סופי הציעation של 100 מיקרומטר, ריכוז נפוץ במסכים כימיים בג elegans 12. לחשוף אתנול או בקרות ממס DMSO בריכוז סופי של 0.1%.
    הערה: אנו ממליצים על השימוש בnocodazole (100 מיקרומטר) כביקורת חיובית.
  8. חותם את הצלחת באמצעות סרט דבק. הקפד לאטום את הצלחת גם על מנת למנוע זיהום צולב בין בארות.
  9. לעטוף את הצלחת עם נייר אלומיניום.
  10. העבר את הצלחת שלייקרה (170-180 סל"ד) של הטמפרטורה המתאימה לכל האורך המתאים של זמן (24 או 65 שעות). הטמפרטורה של החדר משפיעה על הצמיחה של התולעים; לשמור על הטמפרטורה סביב 20 מעלות צלזיוס.

רכישת 5. תמונה של תולעים הרה להולדת בצלחת 384 גם

הערה: סעיף זה מתאר את השימוש במיקרוסקופ תוכן גבוה לתמונת Pxol1 נחשף :: תולעי GFP, כדי להמחיש את הביטוי של ה- GFP בעוברים ברחם של הרמפרודיטים מבוגרים. לכל צלחת 384 גם להיות מוקרנת, להשתמש תולעים מצלחות 4 x 96 היטב.

  1. לאחר חשיפה לכימיקלים שבייקרו, בואו שאר צלחת 96-היטב במשך 10-15 דקות, כדי לאפשר התולעים בוגרות למשקעים בתחתית הצלחת.
  2. בעזרת פיפטה רבה, להסיר 350 μl של M9, להיות זהירים מאוד שלא להפריע את התולעים בתחתית הצלחת.
  3. לשטוף את התולעים עם 1 מיליליטר של M9 וחזרו על שלב 5.1.
  4. בעזרת פיפטה רבה, להסיר 1 מיליליטר של M9, להיות ואבוי נזהר לא להפריע את התולעים בתחתית הצלחת.
  5. בעזרת פיפטה רבה, resuspend התולעים בM9 שנותר ולאסוף של התולעת / התערובת M9 100 μl מ96-גם הצלחות ולטעון אותו לתוך הבארות של קירות שחורים / צלחת 384 גם תחתונה ברורה. חזור על התהליך באמצעות תולעים מצלחות 4 x 96-היטב, עד שכל הבארות של הצלחת 384 גם הוטענו.
    הערה: חשוב לכל הבארות יש את אותו נפח כדי להגדיליעילות ומהירות של פוקוס אוטומטי במהלך תהליך רכישת תמונה. כל טוב צריך להכיל בין 80 ל -100 תולעים.
  6. הוסף 1 μl של levamisole (100 מיקרומטר) זה טוב ולתת את תולעי דגירה של כ 30 דקות.
    הערה: levamisole פועל כאגוניסט קולטן האצטילכולין ומשתק את התולעים.
  7. העבר את הצלחת למיקרוסקופ תוכן הגבוה widefield מסוגל לספק הדמיה אוטומטית.
  8. לרכישת תמונה, השתמש בתוכנת רכישת תמונה וניתוח תוכן גבוהה פי ההנחיות של היצרן. בחר את מטרת 4X לרכוש תמונה 1 בכל טוב.
  9. לפני שתתחיל ברכישת התמונה, להתאים את הפרמטרים ההדמיה GFP עד 45 אלפיות השניים של חשיפה ורזולוציה של תמונה ל -2160 x 2,160.
  10. לאסוף נתונים כמו מספר התולעים החיוביים GFP מחולקים במספר הכולל של תולעים בבאר, המדד האחרון להיות עקבי יחסית בין בארות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

חשיפה של זן הכתב :: GFP Pxol-1 לחומרים כימיים כגון רעל microtubule Nocodazole (איור 1) מובילה לאינדוקציה של שיעור גבוה של עוברים להביע GFP ברחם של הרמפרודיטים מבוגרים חשופים בהשוואה לשליטת DMSO. עוברי GFP החיובי בהירים באופן משמעותי מקרינת הרקע החלשה נצפתה עובר אחרות, כמו גם הקרינה האוטומטית נצפתה במעיים של בעלי החיים. תולעים נחשפו הם צילמו ישירות על צלחות 384 גם ומספר התולעים המכיל עובר אחד לפחות GFP חיובי נספר עבור כל טוב ומנורמל במספר הכולל של תולעים שבכן. להיט חיובי מהמסך הכימי פירוש מתחם מושרה שיעור עוברי GFP החיובי באוכלוסיית תולעת בתדירות גבוהה יותר מאשר 1.7x DMSO 10. בעקבות סף אופטימיזציה, ניתוח תמונת תכולה הגבוה (ראה קובץ חומרים) מאפשר calc האוטומטיulation של מספר האובייקטים החיוביים (כלומר, עובר) מחולקים במספר הכולל של תולעים בבאר והוא שיטת בחירה של ההסתגלות בקנה מידה הגדולה של assay.

התחל עם אוכלוסיית תולעת מורעבת כדי ליצור אוכלוסייה בוגרת הרה להולדת
↓ (תרבות 3 ימים)
להלבין את האוכלוסייה הבוגרת ההרה להולדת
↓
תולעי העברה מולבנת כדי לנקות צלחות NGM
↓ (יום תרבות 1)
לאסוף אוכלוסיית L1 מסונכרנת ולהעביר לצלחות NGM עם OP50
↓ (דגירה 65 שעות ב 15 מעלות צלזיוס)
לאסוף את אוכלוסיית L4 המסונכרן
↓ </ Td>
לוותר 100 תולעי L4 היטב בכל 96-גם הצלחות ב 0.5 מיליליטר של M9 / OP50
↓
הוספת כימיקלים (100 מיקרומטר) זה טוב
↓ (דגירה של 24 או 65 שעות)
העברת האוכלוסייה הבוגרת ההרה להולדת מסונכרנת 100 μl (80 תולעים) 96 הצלחות גם לצלחת 384 גם.
↓
הוסף 1 μl של levamisole היטב כל אחד (ריכוז סופי 1 מיקרומטר)
↓ (דגירה 30 עד 45 דקות)
ללכוד ולנתח תמונות של כל אחד גם עם מיקרוסקופ תוכן גבוה

טבלת 1. זרימת עבודה ניסויית. יום 1, אוכלוסיית תולעת שימוש מורעבת כדי ליצור אוכלוסייה בוגרת הרה להולדת. יום 4, bleaCH האוכלוסייה הבוגרת ההרה להולדת ליצור אוכלוסיית L1 מסונכרנת. יום 5, להעביר את אוכלוסיית L1 מצלחות NGM ברורות לOP50 זרע צלחות NGM ליצור אוכלוסיית L4 מסונכרנת. יום 8, להעביר את אוכלוסיית L4 המסונכרן לצלחת 96-היטב ולחשוף אותם לכימיקלים השונים. יום 9 ויום 11, להעביר את המבוגרים הרה להולדת נחשפו לצלחת 384 גם להיות צילמו עם מיקרוסקופ גבוה תוכן.

M9 מאגר - 1 ליטר
1. מערבבים את המרכיבים הבאים בכוס גדולה או סיים גליל באמצעות סרגל מערבבים מגנטי
KH 3 g 2 PO 4
6 גרם Na 2 4 HPO
5 גרם NaCl
1 מיליליטר 1M 4 MgSO
H 2 O ל 1 ל '
2. Aliquot לתוך בקבוקים בגודל מתאימים (300 מיליליטר בבקבוקים בגודל 500 מיליליטר)
3. לעקר ידי מעוקר במשך 30-60 דקות
תקשורת NGM צלחות - 4 L
1. להוסיף את הדברים הבאים בארלנמייר, לאחר מכן למלא 4 L:
12 גרם NaCl
10 גרם Bactopeptone
80 ג 'אגר
2. מוסיף ומערבבים היטב:
4 מיליליטר של כולסטרול (5 מ"ג / מיליליטר)
4 מיליליטר CaCl 2 (פתרון מניות 1 M)
4 מיליליטר MgSO 4 (פתרון מניות 1 M)
3. החיטוי במשך 30-60 דקות
4. בואו להתקרר מעט ולהוסיף של KH PO 2 100 מיליליטר b> 4 (1 M, פתרון מניות pH 6), ואז לשפוך צלחות
תקשורת LB - 1 ליטר
1. הוסף את H הבא ל -800 מיליליטר 2 O
10 גרם Bacto-tryptone.
תמצית שמרים 5 גרם.
10 גרם NaCl.
2. התאם ל- pH 7.5 עם NaOH.
3. התאם את נפח 1 ליטר עם DH 2 O
4. לעקר ידי מעוקר ל30-60 דקות
פתרון אקונומיקה לסנכרון אוכלוסיות - מיליליטר 50
7.5 מיליליטר 10 N NaOH
6 מיליליטר אקונומיקה (רגיל)
36.5 מיליליטר DH 2 O

= "Jove_content" ילדה> טבלה 2. פתרונות.

איור 1
איור 1:. דוגמאות של תמונות המתקבלות מחשיפה של זן הכתב :: GFP Pxol-1 לשלוט DMSO וnocodazole שליטה חיובי בדוגמא זו, תולעים נחשפו למשך 24 שעות לnocodazole או DMSO Pxol-1 :: תולעי GFP היו. נחשף ל() DMSO 0.1% (שליטה שלילית) או nocodazole (B) 100 מיקרומטר (ביקורת חיובית) וצלם בצלחות 384 גם. חץ אדום: עוברים חיוביים GFP נראים בבירור בתוך הרחם של תולעת nocodazole טופל אחד. בר סולם = 1 מ"מ. (ג) ו- (ד) מוגדלים חלקים () ו- (B) בהתאמה. בר סולם = 0.33 מ"מ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

השיטה המתוארת כאן מהווה אסטרטגיה בקנה מידה הגדולה הראשונה לזיהוי רעלים בתאי מין. זה דורש שימוש במהונדס GFP Pxol-1 זן המכיל :: GFP שנאמנות מדווח האינדוקציה של aneuploidy בעוברים מוקדמים המשמש כמדד לתפקוד לקוי של תאי מין. השיטה כרוכה בסנכרון זהיר של ג אוכלוסיית elegans תולעת וחשיפה לכימיקלים בתולעי 96-גם פורמט ואחריו הדמיה של התולעים החיוביים GFP על ידי מיקרוסקופ גבוה תוכן אוטומטי.

כמה שלבים של פרוטוקול זה הם חיוניים לעקביות של התוצאות. ראשית, אוכלוסיות התולעת צריכה להיות סינכרוני מאוד למקסם את מספר מבוים זחלי L4 שישמשו לחשיפה כמו שצריך. מסיבה זו, המתודולוגיה שתוארה כאן כוללת שני שלבי סנכרון, ראשונה על ידי הלבנה של אוכלוסיית התולעת ולאחר מכן על ידי רעב L1. סעיף החשוב השנימטר של שיטה זו הוא באורך של חשיפה. התולעים נחשפים באופן שיגרתי לשני hr 24 או 65 שעות. כמיוזה הוא תהליך מתמשך בג elegans, שני חלונות חשיפה אלה מאפשרים הלכידה של שני אירועים שינו מאוחר meiotic (24 שעות) או שניהם האירועים המוקדמים ומאוחרים meiotic (65 שעות). חשוב לציין, עם זאת נראה החשיפה ארוכה יותר לחזות רעילות רבייה של יונקים 10 טוב יותר.

היבט אחד אטרקטיבי במיוחד של השיטה הוא הגמישות שלה. בעוד הפרוטוקול מיועד להקרנת תפוקה גבוהה, גרסה מוקטנת של assay ניתן לבצע להקרנה של מספר קטן יותר של דגימות באמצעות 24 גם צלחות או צינורות 1.5 מיליליטר. הורדת הסולם של המסך מאפשרת הבדיקה של מספר גבוה יותר של תולעים לדגימה שיכול להגדיל את הרגישות של assay. במתכונתו הנוכחית, תרכובות הקרנה בquadruplicates מומלצת לספק ביטחון סטטיסטי גבוה יותר בaneuplשיעורי oidy נמדדו. המשוכה פוטנציאלית במתודולוגיה בקנה מידה הגדולה הזה מגיעה מהצורך בזיהוי האוטומטי של עוברי GFP חיובי. למרות שמשימה זו יכולה בקלות להתבצע על ידי העין, ההקמה זהירה של פרמטרים מתאימים בתוכנת ניתוח תמונה, באופן אידיאלי עם מומחה הדמיה, היא חיונית לאוטומציה של ההליך. יתר על כן, מעבר לזיהוי של עוברי GFP חיובי, אימות משנית של הלהיטים צריכה להתבצע כדי לקבוע אם שגיאות כרומוזומליות הן של meiotic או מוצא עוברי. הראינו בעבר כי מבחני משניים אמורים מבוצעים בקלות בג elegans וכולל DAPI המכתים של גרעינים בתאי מין, כמו גם צביעה כתומה acridine של התולעים למדידה של אפופטוזיס 10. משני מבחני פשוטים אלה, כולם יכול להיות העריכו התקדמות חריגה במיוזה, מורפולוגיה גרעינית חריגה ופיצול, כמו גם תאי נבט אובדן.

יחדיו, יש לנו described כאן את הצעדים הנדרשים להערכה המהירה של רעילות germline באמצעות C. מערכת המודל elegans. חשוב לציין, השימוש בaneuploidy בתולעת כסמן לרעילות germline הוא assay רלוונטי כפי שהוא ניבוי של נקודות קצה רעילות רבייה של יונקים, כולל ירידה בגודל המלטה ופגמים שחלה 10. זה הוא בעל חשיבות מיוחדת כהשפעות רעילות על נקבת germline במיוחד מפרכות כדי לחקור. לפיכך, assay המהיר זה מספק חלופה לניסויים בבעלי חיים גדולים כמו מסך רעילות ראשון לעבור ושופך אור על ההשפעה של חשיפה לחומרים כימיים סביבתיות בהיבטים שונים של תכנית meiotic המורכבת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
60 mm Vented, sharp edge Petri dishes Tritech T3315
Agar Apex 20-274
Axygen 96-well clear round bottom 2 ml polypropylene deep well plate Corning P-DW-20-C-S
Bactopeptone Apex 20-261
Bacto-tryptone Fisher Scientific BP1421-2
Bleach Clorox
Calcium chloride (CaCl2) VWR AA12316-A1
Cholesterol Fisher Scientific ICN10138225
DMSO VWR IC19018680
E. coli (OP50) Caenorhabditis Genetics Center http://www.cbs.umn.edu/cgc
Ethanol 200 proof VWR EM-4455S
Greiner CELLSTAR 384 well plates Sigma-Aldrich M1937-32EA
ImageXpress Micro XLS System Molecular Devices
Levamisole hydrochloride Fluka 31742
Magnesium sulfate anhydrous (MgSO4) VWR 97061-438
MetaXpress High Content Image Acquisition & Analysis Software Molecular Devices
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) Sigma-Aldrich P5655
Rayon films for biological cultures VWR 60941-086
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S5886
Sodium hydroxide (NaOH) Fisher Scientific S318
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) VWR BDH0316
Stereomicroscope Nikon SMZ 745 This microscope has a total magnification form 3.35X to 300X. Any microscope with similar characteristics will work.
TY2441 C. elegans, Pxol-1::GFP reporter strain Caenorhabditis Genetics Center http://www.cbs.umn.edu/cgc
Yeast extract Becton Dickinson 212750

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Office, U. G. A. Report No. GAO-06-1032T. Actions are needed to improve the effectiveness of EPA’s chemical review program. Testimony before the Committee on Environment and Public Works. US Senate. , Available from: http://www.gao.gov/cgi-bin/getrpt?GAO-06-1032T (2009).
  2. Fragouli, E., Wells, D., Delhanty, J. D. Chromosome abnormalities in the human oocyte. Cytogenet Genome Res. 133 (2-4), 107-118 (2011).
  3. Hassold, T., Hunt, P. A., Sherman, S. Trisomy in humans: incidence, origin and etiology. Curr Opin Genet Dev. 3 (3), 398-403 (1993).
  4. Heron, M., Hoyert, D. L., Murphy, S. L., Xu, J., Kochanek, K. D., Tejada-Vera, B. Deaths: final data for 2006. Natl Vital Stat Rep. 57 (14), 1-134 (2009).
  5. Hunt, P. A. Meiosis in mammals: recombination, non-disjunction and the environment. Biochem Soc Trans. 34 (Pt 4), 574-577 (2006).
  6. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  7. Hodgkin, J., Horvitz, H. R., Brenner, S. Nondisjunction Mutants of the Nematode CAENORHABDITIS ELEGANS.Genetics. 91 (1), 67-94 (1979).
  8. Nicoll, M., Akerib, C. C., Meyer, B. J. X-chromosome-counting mechanisms that determine nematode sex. Nature. 388 (6638), 200-204 (1997).
  9. Kelly, K. O., Dernburg, A. F., Stanfield, G. M., Villeneuve, A. M. Caenorhabditis elegans msh-5 is required for both normal and radiation-induced meiotic crossing over but not for completion of meiosis. Genetics. 156 (2), 617-630 (2000).
  10. Allard, P., Kleinstreuer, N. C., Knudsen, T. B., Colaiacovo, M. P. A Screening Platform for the Rapid Assessment of Chemical Disruption of Germline Function. Environ Health Perspect. 121 (6), 717-724 (2013).
  11. National Research Council. Toxicity Testing in the 21st Century: A Vision and a Strategy. , The National Academies Press. (2007).
  12. Boyd, W. A., Smith, M. V., Kissling, G. E., Freedman, J. H. Medium- and high-throughput screening of neurotoxicants using C. elegans. Neurotoxicol Teratol. 32 (1), 68-73 (2010).

Tags

ביולוגיה התפתחותית גיליון 96, מסך כימי תפוקה גבוהה aneuploidy רעילות רבייה GFP
הערכה מקיפה של תאי מין כימי רעילות שימוש נמטודות<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Parodi, D. A., Damoiseaux, R.,… More

Parodi, D. A., Damoiseaux, R., Allard, P. Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (96), e52445, doi:10.3791/52445 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter