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Biology

Barcoding genetica con proteine ​​fluorescenti per applicazioni multiplexati

Published: April 14, 2015
doi:
10.3791/52452
, , , , , , ,
1Department of Biology,San Diego State University

Summary

Since the discovery of the green fluorescent protein gene, fluorescent proteins have impacted molecular cell biology. This protocol describes how expression of distinct fluorescent proteins through genetic engineering is used for barcoding individual cells. The procedure enables tracking distinct populations in a cell mixture, which is ideal for multiplexed applications.

Abstract

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery of fluorescent proteins and their genes have enabled the engineering of protein fusions for localization, the analysis of transcriptional activation and translation of proteins of interest, or the general tracking of individual cells and cell populations. The use of fluorescent protein genes in combination with retroviral technology has further allowed the expression of these proteins in mammalian cells in a stable and reliable manner. Shown here is how one can utilize these genes to give cells within a population of cells their own biosignature. As the biosignature is achieved with retroviral technology, cells are barcoded ´indefinitely´. As such, they can be individually tracked within a mixture of barcoded cells and utilized in more complex biological applications. The tracking of distinct populations in a mixture of cells is ideal for multiplexed applications such as discovery of drugs against a multitude of targets or the activation profile of different promoters. The protocol describes how to elegantly develop and amplify barcoded mammalian cells with distinct genetic fluorescent markers, and how to use several markers at once or one marker at different intensities. Finally, the protocol describes how the cells can be further utilized in combination with cell-based assays to increase the power of analysis through multiplexing.

Introduction

Tecnologie come spettroscopia di fluorescenza, microscopia a fluorescenza e citometria a flusso, tutti si basano su di fluorescenza, una proprietà ampiamente sfruttato in applicazioni biochimiche, biomediche, e chimici. Fluorescenza, sia intrinseca o tramite l'etichettatura, è stata sfruttata per l'analisi dei pattern di espressione di proteine ​​e profili, destino cellulare, interazioni proteina e le funzioni biologiche 1-9, e attraverso di fluorescenza / Förster trasferimento di energia di risonanza per la rivelazione di interazioni biomolecolari e cambiamenti conformazionali 10-13. Dal momento che l'isolamento del victoria proteina fluorescente verde Aequorea (GFP) 14, la scoperta di proteine ​​fluorescenti aggiuntivi presenti in natura provenienti da altri cnidari, in particolare i coralli, ha ampiamente aumentato il numero di proteine ​​fluorescenti esistenti con spettri di eccitazione / emissione distinguibili. Questi, insieme con l'introduzione di mutazioni nei loro geni 15-19, HAVe ulteriormente ampliato le possibilità, ottenendo una vera tavolozza di proteine ​​fluorescenti a disposizione degli scienziati che sfruttano la microscopia, citometria a flusso e altre tecnologie basate sulla fluorescenza per le loro ricerche.

In parallelo, anche se in maniera indipendente, lo sviluppo della tecnologia ha drasticamente retrovirale facilitato l'espressione stabile di informazioni genetiche ectopica in cellule di mammifero 20-23. Non è quindi sorprendente che questa tecnologia è stata utilizzata per trasferire geni di proteine ​​fluorescenti in un ampio numero di tipi di cellule e tessuti 24-28 o per la produzione di animali transgenici 29-31. Seguendo la natura dei retrovirus, l'informazione genetica della proteina fluorescente ectopica viene introdotto all'interno del genoma della cella 32 e la cella diventa fluorescente `per ever'. La struttura, ha permesso il monitoraggio del destino delle cellule, o di una singola cella all'interno di una popolazione di cellule. La cella ora fluorescente così acquicolore rosso proprio BioSignature e può essere definito come codice a barre. La sua unica BioSignature identifica da altre cellule, e, soprattutto, la distingue dalle cellule geneticamente manipolate per esprimere proteine ​​fluorescenti diversi con spettri di assorbimento / emissione distinguibili. Applicazioni biologiche quali il monitoraggio dei fattori di riprogrammazione verso pluripotency 33, l'analisi dei fattori subnucleari per la delucidazione della localizzazione nucleolare 34, la costruzione dei plasmidi reporter fluorescenti per studi trascrizionali 35 o l'etichettatura genetica dei neuroni per lo studio di architettura di rete neuronale 36 , sono solo quattro esempi dei molti che hanno sfruttato diversi geni di proteine ​​fluorescenti per lo stesso apparato sperimentale.

La citometria a flusso è stato ampiamente utilizzato per l'analisi dei processi biologici a livello di singola cellula, come l'espressione genica, ciclo cellulare, apoptosi, e segnalazione attraverso fosforilzione 37-43 .Il espressione stabile di geni di proteine ​​fluorescenti in cellule di mammifero ha ulteriormente migliorato l'utilità di citometria a flusso per l'analisi delle cellule 38,44 e ligando-recettore interazioni 45. Capacità avanzate hanno permesso di citometria a flusso per diventare una metodologia ampiamente utilizzata per high-throughput e alto contenuto di screening 46. Nonostante il numero ampliato di fluorometers e robotica tecnologie che possano sistemi per la lettura paio piastre, imaging e citometria a flusso, sembra che ci sia una mancanza di disegno sperimentale che può sfruttare e montare queste capacità tecnologiche avanzate.

Metodologie basate sulle cellule veloci, affidabili, semplici e robuste sono drasticamente necessari per le applicazioni canalizzate che migliorano ulteriormente la capacità high-throughput. Questo è particolarmente vero nel campo della scoperta di farmaci in cui saggi cellulari di ingegneria in un formato multiplex può migliorare la potenza di high-throughput di screening 39,47-50 </sup>. Multiplexing, in quanto permette analisi simultanee in un campione, migliora ulteriormente le funzionalità high-throughput 51-54. Barcoding genetica fluorescente permette non solo elegante multiplexing, ma anche, una volta costruito, elude la necessità di protocolli in termini di tempo, riduce i costi accompagnate da anticorpi, perline e macchie 39,52,55, e può ridurre il numero di schermi necessari per alto applicazioni di throughput. Abbiamo recentemente descritto come la tecnologia può migliorare retrovirale multiplexing attraverso barcoding genetica fluorescente per applicazioni biologiche, esprimendo un test precedentemente sviluppato per monitorare HIV-1 proteasi 56,57 con diverse varianti clinicamente prevalenti 58. La metodologia è illustrata in modo più descrittivo concentrandosi su come selezionare e amplificare le celle a barre geneticamente fluorescenti e come produrre pannelli di popolazioni clonali che esprimono proteine ​​fluorescenti distinte e / o diversa intensit fluorescenzaIES. Pannelli di popolazioni di cellule distinguibili in base alle loro caratteristiche fluorescenti aumentano funzionalità multiplexing, che possono essere ulteriormente sfruttati in combinazione con saggi cellulari che affrontano diverse questioni biologiche. Il protocollo inoltre descritto come ingegnere di un gruppo di cellule con codice a barre che recano uno dei saggi cellulari precedentemente sviluppate in laboratorio, come ad esempio 59. Questo protocollo non è quindi lo scopo di mostrare la consolidata tecnologia retrovirale / lentivirali per il trasferimento genetico, il valore delle proteine ​​fluorescenti o le applicazioni di citometria a flusso 60,48 ma piuttosto per mostrare la potenza migliorando di combinare tre per le applicazioni canalizzate.

Protocol

1. Preparazione di cellule di mammifero, produzione virale e trasduzione per codici a barre genetico Tavola 2.5 x 10 6 cellule aderenti in un piatto di 10 cm (o intorno 50-60% confluenza) un giorno prima di trasfezione in Modified Eagle Medium di Dulbecco (DMEM) con siero di vitello fetale del 10% (FCS). Per retrovirale uso di produzione imballaggi linea cellulare di scelta, come Phoenix-GP (un gentile dono da Gary Nolan, Stanford University). NOTA: La linea cellulare di packaging esprime st…

Representative Results

Multiplexing fluorescenti geneticamente codice a barre cellule a fini di applicazioni biologiche possono essere realizzati solo dopo che siano stati generati singole popolazioni clonali. Multiplexing è più efficace quando le popolazioni di codici a barre hanno caratteristiche distinte fluorescenti nitide con il minimo sovrapposizione spettrale. L'esempio illustrato nella figura 1 con popolazioni clonali di cellule di mammifero SupT1 illustra che le cellule a barre con mCherry e proteina fluorescen…

Discussion

Qui sono stati combinati due procedure consolidate; l'ingegneria genetica attraverso la tecnologia retrovirali e l'individuazione di proteine ​​fluorescenti che utilizzano citometria a flusso. Codici a barre a base di proteine ​​fluorescenti genetica per la produzione di linee cellulari uniche fornisce un modo semplice e affidabile per applicazioni multiplex. Generazione di codici a barre cellule geneticamente modificate attraverso la tecnologia retrovirale, è inizialmente un processo lungo, ma permette…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vorremmo ringraziare il Dott Garry Nolan dalla Stanford University per la fornitura della linea cellulare di packaging Phoenix GP per la produzione di particelle retrovirali. Ringraziamo il Dr. Roger Tsien presso l'Università della California a San Diego per la fornitura di td Tomato. Vorremmo anche ringraziare il Fondo San Diego State University Citometria a flusso di base per il loro servizio e aiuto.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
10mL syringes BD   309604 used for filtering the virus
0.45µm plytetrafluoroethylen filter pall corporation 4219 used for filtering the virus
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) Corning 45000-304 cell growth media for HEK 293T cells
PEI (Polyethylenimine) poly sciences 23966-2  2mg/mL concentration used
Hanging bucket centrifuge (refrigerated) Eppendorf  5805 000.017 used for spin infection
PBS (phosphate buffered saline) Corning 21-040-CV used for washing of cells
Polybrene (hexadimethreen bromide) Sigma-Aldrich 107689 Used to increase viral infection efficiency.  Used at a 5µg/mL concentration. 
FACSAria BD Biosciences instrument used for sorting cell populations
FACSCanto BD Biosciences instrument used for cell analysis
Phoenix-GP Gift from Gary Nolan cell line used to produced retroviral particles
Fetal calf serum Mediatech MT35015CV  used for cell growth and sorting
 SupT1 cells ATCC CRL-1942 Human T lymphoblasts
HEK 293T cells ATCC CRL-11268 Human Embryonic Kidney cells that also contain the SV40 large T-antigen
RPMI 1640 Corning 10-040-CV cell growth media for SupT1 cells
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References

  1. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression.Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
  2. Misteli, T., Caceres, J. F., Spector, D. L. The dynamics of a pre-mRNA splicing factor in living cells. Nature. 387 (6632), 523-527 (1997).
  3. Godwin, A. R., Stadler, H. S., Nakamura, K., Capecchi, M. R. Detection of targeted GFP-Hox gene fusions during mouse embryogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (22), 13042-13047 (1998).
  4. Irish, J. M., et al. Single cell profiling of potentiated phospho-protein networks in cancer cells. Cell. 118 (2), 217-228 (2004).
  5. Natarajan, L., Jackson, B. M., Szyleyko, E., Eisenmann, D. M. Identification of evolutionarily conserved promoter elements and amino acids required for function of the C. elegans beta-catenin homolog BAR-1. Dev Biol. 272 (2), 536-557 (2004).
  6. Tumbar, T., et al. Defining the epithelial stem cell niche in skin.Science. 303 (5656), 359-363 (2004).
  7. Valencia-Burton, M., et al. Spatiotemporal patterns and transcription kinetics of induced RNA in single bacterial cells.Proc. Natl Acad Sci U S A. 106 (38), 16399-16404 (2009).
  8. Mahmoud, L., et al. Green fluorescent protein reporter system with transcriptional sequence heterogeneity for monitoring the interferon response.J Virol. 85 (18), 9268-9275 (2011).
  9. Saunders, M. J., et al. Fluorogen activating proteins in flow cytometry for the study of surface molecules and receptors.Methods. 57 (3), 308-317 (2012).
  10. Wang, Y. L., Taylor, D. L. Probing the dynamic equilibrium of actin polymerization by fluorescence energy transfer. Cell. 27 (3 Pt 2), 429-436 (1981).
  11. He, L., et al. Flow cytometric measurement of fluorescence (Forster) resonance energy transfer from cyan fluorescent protein to yellow fluorescent protein using single-laser excitation at 458 nm. Cytometry A. 53 (1), 39-54 (2003).
  12. Stephens, D. J., Allan, V. J. Light microscopy techniques for live cell imaging. Science. 300 (5616), 82-86 (2003).
  13. Clayton, A. H., et al. Ligand-induced dimer-tetramer transition during the activation of the cell surface epidermal growth factor receptor-A multidimensional microscopy analysis. J Biol Chem. 280 (34), 30392-30399 (2005).
  14. Prasher, D. C., Eckenrode, V. K., Ward, W. W., Prendergast, F. G., Cormier, M. J. Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein.Gene. 111 (2), 229-233 (1992).
  15. Heim, R., Cubitt, A. B., Tsien, R. Y. Improved green fluorescence. Nature. 373 (6516), 663-664 (1995).
  16. Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat Biotechnol. 22 (12), 1567-1572 (2004).
  17. Ai, H. W., Shaner, N. C., Cheng, Z., Tsien, R. Y., Campbell, R. E. Exploration of new chromophore structures leads to the identification of improved blue fluorescent proteins.Biochemistry. 46 (20), 5904-5910 (2007).
  18. Mishin, A. S., et al. The first mutant of the Aequorea victoria green fluorescent protein that forms a red chromophore. Biochemistry. 47 (16), 4666-4673 (2008).
  19. Tsien, R. Y. Constructing and exploiting the fluorescent protein paintbox (Nobel Lecture). Angew Chem Int Ed Engl. 48 (31), 5612-5626 (2009).
  20. Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272 (5259), 263-267 (1996).
  21. Klages, N., Zufferey, R., Trono, D. A stable system for the high-titer production of multiply attenuated lentiviral vectors. Mol Ther. 2 (2), 170-176 (2000).
  22. Lai, Z., Brady, R. O. Gene transfer into the central nervous system in vivo using a recombinanat lentivirus vector. J Neurosci Res. 67 (3), 363-371 (2002).
  23. Wolkowicz, R., Nolan, G. P., Curran, M. A. Lentiviral vectors for the delivery of DNA into mammalian cells. Methods Mol Biol. 246, 391-411 (2004).
  24. Grignani, F., et al. High-efficiency gene transfer and selection of human hematopoietic progenitor cells with a hybrid EBV/retroviral vector expressing the green fluorescence protein. Cancer Res. 58 (1), 14-19 (1998).
  25. Ramezani, A., Hawley, T. S., Hawley, R. G. Lentiviral vectors for enhanced gene expression in human hematopoietic cells. Mol Ther. 2 (5), 458-469 (2000).
  26. Roddie, P. H., Paterson, T., Turner, M. L. Gene transfer to primary acute myeloid leukaemia blasts and myeloid leukaemia cell lines. Cytokines Cell Mol Ther. 6 (3), 127-134 (2000).
  27. Zhang, X. Y., et al. Lentiviral vectors for sustained transgene expression in human bone marrow-derived stromal cells. Mol Ther. 5 (5 Pt 1), 555-565 (2002).
  28. Rossi, G. R., Mautino, M. R., Morgan, R. A. High-efficiency lentiviral vector-mediated gene transfer into murine macrophages and activated splenic B lymphocytes. Hum Gene Ther. 14 (4), 385-391 (2003).
  29. Hamra, F. K., et al. Production of transgenic rats by lentiviral transduction of male germ-line stem cells.Proc. Natl Acad Sci U S A. 99 (23), 14931-14936 (2002).
  30. Chan, A. W., Chong, K. Y., Martinovich, C., Simerly, C., Schatten, G. Transgenic monkeys produced by retroviral gene transfer into mature oocytes. Science. 291 (5502), 309-3012 (2001).
  31. Linney, E., Hardison, N. L., Lonze, B. E., Lyons, S., DiNapoli, L. Transgene expression in zebrafish: A comparison of retroviral-vector and DNA-injection approaches. Dev Biol. 213 (1), 207-2016 (1999).
  32. Engelman, A., Mizuuchi, K., Craigie, R. HIV-1 DNA integration: mechanism of viral DNA cleavage and DNA strand transfer. Cell. 67 (6), 1211-1221 (1991).
  33. Tiemann, U., et al. Optimal reprogramming factor stoichiometry increases colony numbers and affects molecular characteristics of murine induced pluripotent stem cells. Cytometry A. 79 (6), 426-435 (2011).
  34. Leung, A. K., Lamond, A. I. In vivo analysis of NHPX reveals a novel nucleolar localization pathway involving a transient accumulation in splicing speckles. J Cell Biol. 157 (4), 615-629 (2002).
  35. Malone, C. L., et al. Fluorescent reporters for Staphylococcus aureus. J Microbiol Methods. 77 (3), 251-260 (2009).
  36. Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
  37. Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Intracellular phospho-protein staining techniques for flow cytometry: monitoring single cell signaling events. Cytometry A. 55 (2), 61-70 (2003).
  38. Violin, J. D., Zhang, J., Tsien, R. Y., Newton, A. C. A genetically encoded fluorescent reporter reveals oscillatory phosphorylation by protein kinase. C.J Cell Biol. 161 (5), 899-909 (2003).
  39. Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling. Nat Methods. 3 (5), 361-368 (2006).
  40. Edwards, B. S., Ivnitski-Steele, I., Young, S. M., Salas, V. M., Sklar, L. A. High-throughput cytotoxicity screening by propidium iodide staining. Curr Protoc Cytomt. 9 (Unit 9 24), (2007).
  41. Schulz, K. R., Danna, E. A., Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Single-cell phospho-protein analysis by flow cytometry. Curr Protoc Immunol. 8 (Unit 8 17), (2007).
  42. Lu, R., Neff, N. F., Quake, S. R., Weissman, I. L. Tracking single hematopoietic stem cells in vivo using high-throughput sequencing in conjunction with viral genetic barcoding. Nat Biotechnol. 29 (10), 928-933 (2011).
  43. Grant, G. D., et al. Live-cell monitoring of periodic gene expression in synchronous human cells identifies Forkhead genes involved in cell cycle control. Mol Biol Cell. 23 (16), 3079-3093 (2012).
  44. Fiering, S. N., et al. Improved FACS-Gal: flow cytometric analysis and sorting of viable eukaryotic cells expressing reporter gene constructs. Cytometry. 12 (4), 291-301 (1991).
  45. Fay, S. P., Posner, R. G., Swann, W. N., Sklar, L. A. Real-time analysis of the assembly of ligand, receptor, and G protein by quantitative fluorescence flow cytometry. Biochemistry. 30 (20), 5066-5075 (1991).
  46. Edwards, B. S., Oprea, T., Prossnitz, E. R., Sklar, L. A. Flow cytometry for high-throughput, high-content screening. Curr Opin Chem Biol. 8 (4), 392-398 (2004).
  47. Durick, K., Negulescu, P. Cellular biosensors for drug discovery. Biosens Bioelectron. 16 (7-8), 587-592 (2001).
  48. Edwards, B. S., et al. High-throughput flow cytometry for drug discovery. Expert Opin Drug Discov. 2 (5), 685-696 (2007).
  49. Sklar, L. A., Carter, M. B., Edwards, B. S. Flow cytometry for drug discovery, receptor pharmacology and high-throughput screening. Curr Opin Pharmacol. 7 (5), 527-534 (2007).
  50. Curpan, R. F., et al. High-throughput screen for the chemical inhibitors of antiapoptotic bcl-2 family proteins by multiplex flow cytometry. Assay Drug Dev Technol. 9 (5), 465-474 (2011).
  51. Bradford, J. A., Buller, G., Suter, M., Ignatius, M., Beechem, J. M. Fluorescence-intensity multiplexing: simultaneous seven-marker, two-color immunophenotyping using flow cytometry. Cytometry A. 61 (2), 142-152 (2004).
  52. Krutzik, P. O., Clutter, M. R., Trejo, A., Nolan, G. P. Fluorescent cell barcoding for multiplex flow cytometry. Curr Protoc Cytom. 6 (Unit 6 31), (2011).
  53. Surviladze, Z., Young, S. M., Sklar, L. A. High-throughput flow cytometry bead-based multiplex assay for identification of Rho GTPase inhibitors. Methods Mol Biol. 827, 253-270 (2012).
  54. Sukhdeo, K., et al. Multiplex flow cytometry barcoding and antibody arrays identify surface antigen profiles of primary and metastatic colon cancer cell lines. PLoS One. 8 (1), e53015 (2013).
  55. Vignali, D. A. Multiplexed particle-based flow cytometric assays. J Immunol Methods. 342 (1-2), 243-255 (2000).
  56. Hilton, B. J., Wolkowicz, R. An assay to monitor HIV-1 protease activity for the identification of novel inhibitors in T-cells. PLoS One. 5 (6), e10940 (2010).
  57. Rajakuberan, C., Hilton, B. J., Wolkowicz, R. Protocol for a mammalian cell-based assay for monitoring the HIV-1 protease activity. Methods Mol Biol. 903, 393-405 (2012).
  58. Smurthwaite, C. A., et al. Fluorescent genetic barcoding in mammalian cells for enhanced multiplexing capabilities in flow cytometry. Cytometry A. 85 (1), 105-113 (2014).
  59. Stolp, Z. D., et al. A Novel Two-Tag System for Monitoring Transport and Cleavage through the Classical Secretory Pathway – Adaptation to HIV Envelope Processing. PLoS One. 8 (6), e68835 (2013).
  60. Schwartz, A., et al. Standardizing flow cytometry: a classification system of fluorescence standards used for flow cytometry. Cytometry. 33 (2), 106-114 (1998).

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Smurthwaite, C. A., Williams, W., Fetsko, A., Abbadessa, D., Stolp, Z. D., Reed, C. W., Dharmawan, A., Wolkowicz, R. Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications. J. Vis. Exp. (98), e52452, doi:10.3791/52452 (2015).
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