Since the discovery of the green fluorescent protein gene, fluorescent proteins have impacted molecular cell biology. This protocol describes how expression of distinct fluorescent proteins through genetic engineering is used for barcoding individual cells. The procedure enables tracking distinct populations in a cell mixture, which is ideal for multiplexed applications.
Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery of fluorescent proteins and their genes have enabled the engineering of protein fusions for localization, the analysis of transcriptional activation and translation of proteins of interest, or the general tracking of individual cells and cell populations. The use of fluorescent protein genes in combination with retroviral technology has further allowed the expression of these proteins in mammalian cells in a stable and reliable manner. Shown here is how one can utilize these genes to give cells within a population of cells their own biosignature. As the biosignature is achieved with retroviral technology, cells are barcoded ´indefinitely´. As such, they can be individually tracked within a mixture of barcoded cells and utilized in more complex biological applications. The tracking of distinct populations in a mixture of cells is ideal for multiplexed applications such as discovery of drugs against a multitude of targets or the activation profile of different promoters. The protocol describes how to elegantly develop and amplify barcoded mammalian cells with distinct genetic fluorescent markers, and how to use several markers at once or one marker at different intensities. Finally, the protocol describes how the cells can be further utilized in combination with cell-based assays to increase the power of analysis through multiplexing.
Technologieën zoals fluorescentie spectroscopie, fluorescentie microscopie en flowcytometrie, allemaal afhankelijk van fluorescentie, een woning op grote schaal uitgebuit in biochemische, biomedische en chemische toepassingen. Fluorescentie, hetzij intrinsiek of door etikettering, is benut voor de analyse van eiwit expressie en profielen lot van de cel, eiwit interacties en biologische functies 1-9, en door fluorescentie / Förster resonantie energieoverbrenging voor de detectie van biomoleculen interacties en conformationele veranderingen 10-13. Aangezien de isolatie van het Aequorea victoria groen fluorescerend eiwit (GFP) 14, de ontdekking van nature voorkomende fluorescerende eiwitten van andere cnidarians, vooral koralen, sterk toegenomen het aantal bestaande fluorescerende eiwitten met onderscheiden excitatie / emissie spectra. Deze, samen met de introductie van mutaties in de genen 15-19, have verder uitgebreid de mogelijkheden, het verkrijgen van een ware palet van fluorescente proteïnen beschikbaar voor wetenschappers die microscopie benutten flowcytometrie andere fluorescentie gebaseerde technologieën voor hun onderzoek.
Daarnaast hoewel onafhankelijk de ontwikkeling van retrovirale technologie drastisch vergemakkelijkt de stabiele expressie van ectopische genetische informatie in zoogdiercellen 20-23. Het is dus niet verwonderlijk dat deze technologie is gebruikt om genen van fluorescerende eiwitten over in een groot aantal celtypen en weefsels 24-28 of voor de productie van transgene dieren 29-31. Na de aard van retrovirussen, wordt de genetische informatie van het ectopische fluorescerend eiwit geïntroduceerd in het genoom van de cel 32 en de cel wordt fluorescente 'voor ever'. Deze woning is toegestaan volgen van lot van de cel, of van een enkele cel binnen een populatie van cellen. De nu fluorescerende cel heeft dus Acquired eigen Biosignatuur en kan worden gedefinieerd als barcode. Zijn unieke Biosignatuur identificeert zich van andere cellen, en belangrijker nog, onderscheidt het zich van cellen genetisch gemanipuleerd om verschillende fluorescerende eiwitten met onderscheiden absorptie / emissie spectra te uiten. Biologische toepassingen zoals het volgen van herprogrammering factoren naar pluripotentie 33, de analyse van subnucleaire factoren voor de opheldering van nucleolaire lokalisatie 34, de constructie van fluorescerende reporter plasmiden voor transcriptionele studies 35 of de genetische kenmerken van neuronen voor de studie van neuronale netwerkarchitectuur 36 , zijn slechts vier voorbeelden van de vele die verschillende fluorescent proteïne genen benut voor dezelfde experimentele opstelling.
Flowcytometrie ruim is toegepast voor de analyse van biologische processen op enkele cel niveau, zoals genexpressie, celcyclus, apoptose en signalering door fosforylatie 37-43 .De stabiele expressie van fluorescent proteïne genen in zoogdiercellen is verder versterkt het nut van flowcytometrie voor celanalyse 38,44 en ligand-receptor interacties 45. Verbeterde mogelijkheden hebben stroom toegestaan cytometrie een veel gebruikt methodologie voor high-throughput en high content 46 geworden. Ondanks het nu uitgebreid aantal fluorometers en robotica technologieën die paar plaatafleesinrichting systemen, beeldvorming en kan flowcytometrie, lijkt er een gebrek in de experimentele ontwerp dat kan benutten en past deze verbeterde technologische mogelijkheden zijn.
Snel, betrouwbaar, eenvoudig en robuust cellen gebaseerde methoden zijn drastisch nodig voor multiplex-toepassingen die verder te verbeteren high-throughput capaciteit. Dit geldt vooral op het gebied van geneesmiddelen waarbij techniek celgebaseerde proeven in een gemultiplexte vorm het vermogen van high-throughput screening 39,47-50 kan verbeteren </sup>. Multiplexing, omdat maakt gelijktijdige analyses in een monster, verder verbetert high-throughput mogelijkheden 51-54. Fluorescerende genetische barcoding maakt niet alleen voor elegante multiplexing, maar ook, zij eenmaal, omzeilt de noodzaak van tijdrovende protocollen, verlaagt de kosten gepaard met antilichamen, kralen en vlekken 39,52,55, en kan het aantal schermen die nodig is voor high verminderen throughput toepassingen. We hebben recent beschreven hoe retrovirale technologie multiplexen via fluorescent genetische barcode verbeteren voor biologische toepassingen, door expressie een assay die eerder HIV-1 protease-activiteit 56,57 monitor met verschillende klinisch voorkomende varianten 58. De methodologie wordt toegelicht in een meer beschrijvende manier te focussen op hoe om te selecteren en te versterken genetisch fluorescerende barcode cellen en hoe panelen van klonale populaties uiten verschillende fluorescerende eiwitten en / of verschillende fluorescentie intensit producerenies. Panelen van celpopulaties onderscheiden op basis van hun fluorescerende eigenschappen verbeteren gemultiplexte vermogens, die verder in combinatie kunnen worden benut met celgebaseerde proeven die verschillende biologische vragen pakken. Het protocol beschrijft ook hoe je een panel van barcode cellen die één van de cel-gebaseerde testen die eerder ontwikkeld in het laboratorium ingenieur, zoals bijvoorbeeld 59. Dit protocol is dus niet bedoeld om de gevestigde retrovirale / lentivirale technologie voor genetische overdracht, de waarde van fluorescerende eiwitten of de toepassing van flowcytometrie 60,48 laten maar om het versterkende kracht van het combineren van de drie voor gemultiplexte aanvragen blijkt.
Hier twee goed uitgewerkte procedures zijn gecombineerd; genetische manipulatie door middel van retrovirale technologie en detectie van fluorescerende eiwitten met behulp van flowcytometrie. Fluorescerend eiwit gebaseerde genetische barcode voor de productie van unieke cellijnen verschaft een robuuste en eenvoudige manier voor multiplex toepassingen. Genereren van genetisch gemanipuleerde barcode cellen door retrovirale-technologie, is in eerste instantie een langdurig proces, maar maakt het mogelijk om te verkrijgen, e…
The authors have nothing to disclose.
Wij zouden graag Dr Garry Nolan danken aan de Stanford University voor het verstrekken van de Phoenix GP inpakcellijn voor de productie van retrovirale deeltjes. Wij danken Dr Roger Tsien aan de Universiteit van Californië in San Diego voor het verstrekken van td tomaat. We willen ook graag naar de San Diego State University flowcytometrie Core Facility bedanken voor hun service en hulp.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
10mL syringes | BD | 309604 | used for filtering the virus |
0.45µm plytetrafluoroethylen filter | pall corporation | 4219 | used for filtering the virus |
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Corning | 45000-304 | cell growth media for HEK 293T cells |
PEI (Polyethylenimine) | poly sciences | 23966-2 | 2mg/mL concentration used |
Hanging bucket centrifuge (refrigerated) | Eppendorf | 5805 000.017 | used for spin infection |
PBS (phosphate buffered saline) | Corning | 21-040-CV | used for washing of cells |
Polybrene (hexadimethreen bromide) | Sigma-Aldrich | 107689 | Used to increase viral infection efficiency. Used at a 5µg/mL concentration. |
FACSAria | BD Biosciences | instrument used for sorting cell populations | |
FACSCanto | BD Biosciences | instrument used for cell analysis | |
Phoenix-GP | Gift from Gary Nolan | cell line used to produced retroviral particles | |
Fetal calf serum | Mediatech | MT35015CV | used for cell growth and sorting |
SupT1 cells | ATCC | CRL-1942 | Human T lymphoblasts |
HEK 293T cells | ATCC | CRL-11268 | Human Embryonic Kidney cells that also contain the SV40 large T-antigen |
RPMI 1640 | Corning | 10-040-CV | cell growth media for SupT1 cells |