Genetisk Barcoding med fluorescerende proteiner for Multipleksede Applications

Summary

Since the discovery of the green fluorescent protein gene, fluorescent proteins have impacted molecular cell biology. This protocol describes how expression of distinct fluorescent proteins through genetic engineering is used for barcoding individual cells. The procedure enables tracking distinct populations in a cell mixture, which is ideal for multiplexed applications.

Abstract

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery of fluorescent proteins and their genes have enabled the engineering of protein fusions for localization, the analysis of transcriptional activation and translation of proteins of interest, or the general tracking of individual cells and cell populations. The use of fluorescent protein genes in combination with retroviral technology has further allowed the expression of these proteins in mammalian cells in a stable and reliable manner. Shown here is how one can utilize these genes to give cells within a population of cells their own biosignature. As the biosignature is achieved with retroviral technology, cells are barcoded ´indefinitely´. As such, they can be individually tracked within a mixture of barcoded cells and utilized in more complex biological applications. The tracking of distinct populations in a mixture of cells is ideal for multiplexed applications such as discovery of drugs against a multitude of targets or the activation profile of different promoters. The protocol describes how to elegantly develop and amplify barcoded mammalian cells with distinct genetic fluorescent markers, and how to use several markers at once or one marker at different intensities. Finally, the protocol describes how the cells can be further utilized in combination with cell-based assays to increase the power of analysis through multiplexing.

Introduction

Teknologier som fluorescens spektroskopi, fluorescens mikroskopi og flowcytometri, alle er afhængige af fluorescens, en ejendom i vid udstrækning udnyttet i biokemiske, biomedicinske, og kemiske applikationer. Fluorescens, enten iboende eller gennem mærkning, er blevet udnyttet til analyse af protein udtryk mønstre og profiler, celle skæbne, protein interaktioner og biologiske funktioner ^1-9, og gennem fluorescens / Förster resonansenergioverførsel til påvisning af biomolekylære interaktioner og konformationsændringer ^10-13. Da isoleringen af Aequorea victoria-grønt fluorescerende protein (GFP) ¹⁴ opdagelsen af naturligt forekommende fluorescerende proteiner fra andre cnidarianer, især koraller, har i høj grad øget antallet af eksisterende fluorescerende proteiner med skelnes excitation / emission spektre. Disse, sammen med indførelsen af mutationer i deres gener ^15-19, have yderligere udvidet mulighederne, opnåelse af et ægte palet af fluorescerende proteiner til rådighed for forskere, der udnytter mikroskopi, flowcytometri og andre fluorescens-baserede teknologier til deres forskning.

Sideløbende, selv uafhængigt af udviklingen af retrovirale teknologi har drastisk lettet stabil ekspression af ektopisk genetisk information i pattedyrceller ^20-23. Det er således ikke overraskende, at denne teknologi er blevet anvendt til at overføre gener af fluorescerende proteiner i en bred række af celletyper og væv ^24-28 eller til produktion af transgene dyr ^29-31. Efter arten af retrovira, er den genetiske information af ektopisk fluorescerende protein indføres i genomet af cellen ^32, og cellen bliver fluorescerende `for ever'. Denne egenskab har gjort sporing af celle skæbne, eller en enkelt celle inden for en population af celler. Den nu fluorescerende celle har således Acquirød sin egen Biosignatur og kan defineres som Barcoded. Dens unikke Biosignatur identificerer det fra andre celler, og vigtigere, adskiller den fra celler genetisk manipulerede til at udtrykke forskellige fluorescerende proteiner med skelnes absorption / emission spektre. Biologiske applikationer såsom sporing af omprogrammering faktorer mod pluripotens ^33, analyse af inde i kernen faktorer til belysning af nucleolar lokalisering ^34, opførelsen af fluorescerende reporterplasmider for transkriptionelle studier ³⁵ eller den genetiske mærkning af neuroner til studiet af neuronal netværksarkitektur ³⁶ er kun fire eksempler på de mange, der har udnyttet forskellige fluorescerende protein gener for den samme forsøgsopstilling.

Flowcytometri er bredt anvendt til analyse af biologiske processer på enkelt celle niveau, såsom genekspression, cellecyklus, apoptose og signalering via phosphorylation ^37-43 .Den stabil ekspression af fluorescerende protein-gener i mammale celler er yderligere forbedret anvendeligheden af flowcytometri for celleanalyse ^38,44 og ligand-receptor-interaktioner ^45. Øget kapacitet har tilladt flowcytometri bliver en almindeligt anvendt metode til high-throughput og med højt indhold screening ^46. På trods af den nu udvidet antal fluorometre og robotter teknologier, der kan par pladelæser systemer, billedbehandling og flowcytometri, synes der at være en mangel i eksperimentel design, der kan udnytte og passe disse forbedrede teknologiske muligheder.

Hurtig, pålidelig, enkle og robuste cellebaserede metoder drastisk nødvendige for multiplex applikationer, som yderligere forstærker high-throughput kapacitet. Dette er især tilfældet inden for drug discovery hvor engineering cellebaserede assays i et multiplekset format kan øge kraften i high-throughput screening ^39,47-50 </sup>. Multiplexing, da det muliggør samtidige analyser i en prøve, forbedrer yderligere højt gennemløb kapaciteter ^51-54. Fluorescent genetisk barcoding ikke kun giver mulighed for elegant multiplexing, men også, når manipuleret, omgår behovet for tidskrævende protokoller, reducerer omkostningerne ledsaget med antistoffer, perler og pletter ^39,52,55, og kan reducere antallet af skærme, der kræves for høj throughput applikationer. Vi har for nylig beskrevet, hvordan retroviral teknologi kan forbedre multiplexing gennem fluorescerende genetiske stregkoder for biologiske anvendelser, ved at udtrykke et assay tidligere udviklet til at overvåge HIV-1-protease aktivitet ^56,57 med forskellige klinisk fremherskende varianter ^58. Metoden forklares i en mere beskrivende måde med fokus på, hvordan du vælger og forstærke genetisk fluorescerende stregkodede celler og hvordan man producerer paneler af klonpopulationer udtrykker forskellige fluorescerende proteiner og / eller forskellige fluorescens intensiterne. Paneler af cellepopulationer skelnes baseret på deres fluorescerende egenskaber forbedre multipleksede kapaciteter, som yderligere kan udnyttes i kombination med cellebaserede assays, der tackle forskellige biologiske spørgsmål. Protokollen beskriver også, hvordan at konstruere et panel af stregkodede celler, der bærer en af de cellebaserede assays, der tidligere er udviklet i laboratoriet, som eksempel ^59. Denne protokol er således ikke til formål at vise veletablerede retroviral / lentiviral teknologi for genoverførsel, værdien af fluorescerende proteiner eller anvendelser af flowcytometri ^60,48, men snarere for at vise styrke magt kombinere tre for multiplex applikationer.

Protocol

1. Fremstilling af pattedyrsceller, Viral Produktion og transduktion for Genetisk Barcoding Plate 2,5 x 10 6 adhærente celler i en 10 cm plade (eller ca. 50-60% konfluens) en dag før transfektion i Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM) med 10% føtalt kalveserum (FCS). For retroviral brug produktionsforpakning cellelinie af valg, såsom Phoenix-GP (en slags gave fra Gary Nolan, Stanford University). BEMÆRK: pakkende cellelinie stabilt udtrykker gag og pol proteiner til retroviral par…

Representative Results

Multiplexing fluorescerende genetisk barkode celler med henblik på biologiske anvendelser kan kun opnås, når de enkelte klonpopulationer er blevet genereret. Multiplexing er mest effektiv, når stregkodede befolkninger har klare tydelige fluorescerende egenskaber med minimal spektral overlapning. Den i figur 1 viste med klonale populationer af mammale SupT1 celler eksempel illustrerer, at stregkodede celler med mCherry og cyan fluorescerende protein (CFP), kan let analyseres samtidigt uden at miste d…

Discussion

Her to veletablerede procedurer er blevet kombineret; genteknologi gennem retroviral teknologi og detektering af fluorescerende proteiner anvender flowcytometri. Fluorescerende protein-baseret genetisk stregkoder til fremstilling af unikke cellelinjer tilvejebringer en robust og enkel måde for multipleksede applikationer. Generering gensplejsede stregkodede celler gennem retroviral teknologi, er i første omgang en langvarig proces, men gør det muligt at opnå, når de er etableret, en pålidelig og stabil kilde til c…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
10mL syringes	BD	309604	used for filtering the virus
0.45µm plytetrafluoroethylen filter	pall corporation	4219	used for filtering the virus
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Corning	45000-304	cell growth media for HEK 293T cells
PEI (Polyethylenimine)	poly sciences	23966-2	2mg/mL concentration used
Hanging bucket centrifuge (refrigerated)	Eppendorf	5805 000.017	used for spin infection
PBS (phosphate buffered saline)	Corning	21-040-CV	used for washing of cells
Polybrene (hexadimethreen bromide)	Sigma-Aldrich	107689	Used to increase viral infection efficiency.  Used at a 5µg/mL concentration.
FACSAria	BD Biosciences		instrument used for sorting cell populations
FACSCanto	BD Biosciences		instrument used for cell analysis
Phoenix-GP	Gift from Gary Nolan		cell line used to produced retroviral particles
Fetal calf serum	Mediatech	MT35015CV	used for cell growth and sorting
SupT1 cells	ATCC	CRL-1942	Human T lymphoblasts
HEK 293T cells	ATCC	CRL-11268	Human Embryonic Kidney cells that also contain the SV40 large T-antigen
RPMI 1640	Corning	10-040-CV	cell growth media for SupT1 cells