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Biology

Code-barres génétique avec protéines fluorescentes pour des applications multiplexés

Published: April 14, 2015
doi:
10.3791/52452
, , , , , , ,
1Department of Biology,San Diego State University

Summary

Since the discovery of the green fluorescent protein gene, fluorescent proteins have impacted molecular cell biology. This protocol describes how expression of distinct fluorescent proteins through genetic engineering is used for barcoding individual cells. The procedure enables tracking distinct populations in a cell mixture, which is ideal for multiplexed applications.

Abstract

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery of fluorescent proteins and their genes have enabled the engineering of protein fusions for localization, the analysis of transcriptional activation and translation of proteins of interest, or the general tracking of individual cells and cell populations. The use of fluorescent protein genes in combination with retroviral technology has further allowed the expression of these proteins in mammalian cells in a stable and reliable manner. Shown here is how one can utilize these genes to give cells within a population of cells their own biosignature. As the biosignature is achieved with retroviral technology, cells are barcoded ´indefinitely´. As such, they can be individually tracked within a mixture of barcoded cells and utilized in more complex biological applications. The tracking of distinct populations in a mixture of cells is ideal for multiplexed applications such as discovery of drugs against a multitude of targets or the activation profile of different promoters. The protocol describes how to elegantly develop and amplify barcoded mammalian cells with distinct genetic fluorescent markers, and how to use several markers at once or one marker at different intensities. Finally, the protocol describes how the cells can be further utilized in combination with cell-based assays to increase the power of analysis through multiplexing.

Introduction

Les technologies telles que la spectroscopie de fluorescence, microscopie par fluorescence et la cytométrie en flux, toutes reposent sur la fluorescence, une propriété largement exploitée dans les applications biochimiques, biomédicales et chimiques. La fluorescence, si intrinsèque ou par un étiquetage, a été exploitée pour l'analyse du profil des protéines d'expression et profilés, le destin des cellules, les interactions entre protéines et les fonctions biologiques 9.1, et par fluorescence / Förster transfert d'énergie de résonance pour la détection d'interactions biomoléculaires et des changements conformationnels 10-13. Depuis l'isolement de la Aequorea victoria protéine fluorescente verte (GFP) 14, la découverte des protéines fluorescentes naturels supplémentaires provenant d'autres cnidaires, en particulier les coraux, a largement augmenté le nombre de protéines fluorescentes existantes avec des spectres d'excitation / émission distinguer. Ceux-ci, ainsi que l'introduction de mutations dans leurs gènes 15-19, VHAe élargi les possibilités, obtenir une véritable palette de protéines fluorescentes disponibles pour les scientifiques qui exploitent la microscopie, cytométrie en flux et d'autres technologies basées sur la fluorescence pour leur recherche.

En parallèle, bien que de façon indépendante, le développement de la technologie rétroviral a considérablement facilité l'expression stable de l'information génétique dans des cellules de mammifères ectopique 20-23. Il ne est donc pas surprenant que cette technologie a été utilisée pour transférer des gènes de protéines fluorescentes dans un large nombre de types cellulaires et tissus 24-28 ou pour la production d'animaux transgéniques 29-31. Suite à la nature des rétrovirus, de l'information génétique de la protéine fluorescente ectopique est introduit dans le génome de la cellule 32 et la cellule devient fluorescent pour ever' `. Cette propriété a permis le suivi du destin cellulaire, ou d'une seule cellule dans une population de cellules. La cellule a donc maintenant fluorescente acquiRED sa propre biosignature et peut être défini comme un code à barres. Son biosignature unique identifie des autres cellules, et surtout, le distingue des cellules génétiquement manipulées pour exprimer différentes protéines fluorescentes avec des spectres d'absorption / émission distinguables. Applications biologiques tels que le suivi des facteurs de reprogrammation vers la pluripotence 33, l'analyse des facteurs subnucléaires pour l'élucidation de localisation nucléolaire 34, la construction de plasmides rapporteurs fluorescents pour les études de la transcription 35 ou l'étiquetage génétique de neurones pour l'étude de l'architecture de réseau neuronal 36 , ne sont que quatre exemples de nombreux qui ont exploité différents gènes de la protéine fluorescente pour le même dispositif expérimental.

La cytométrie en flux a été largement utilisé pour l'analyse de processus biologiques au niveau de la cellule unique, comme l'expression du gène, le cycle cellulaire, l'apoptose et la signalisation par phosphoryleation 37-43 .Le expression stable de gènes de protéines fluorescentes dans les cellules de mammifères a encore amélioré l'utilité de la cytométrie en flux pour l'analyse cellulaire 38,44 et interactions ligand-récepteur 45. Renforcement des capacités ont permis cytométrie en flux pour devenir une méthode largement utilisée pour à haut débit et à haute teneur de dépistage 46. Malgré le nombre de fluoromètres maintenant élargi et technologies robotiques que les systèmes de lecteur de quelques plaques, l'imagerie et peuvent cytométrie en flux, il semble y avoir un manque dans la conception expérimentale qui peut exploiter et adapter ces capacités technologiques accrues.

Méthodologies à base de cellules rapides, fiables, simples et robustes sont nécessaires pour des applications radicalement multiplexés qui améliorent la capacité à haut débit. Cela est particulièrement vrai dans le domaine de la découverte de médicaments où les dosages à base de cellules ingénierie dans un format multiplexé peuvent améliorer la puissance de criblage à haut débit 39,47-50 </sup>. Multiplexage, car il permet des analyses simultanées dans un échantillon, améliore encore les capacités à haut débit de 51 à 54. Codes-barres génétique fluorescent permet non seulement de multiplexage élégant, mais aussi, une fois conçu, contourne la nécessité de protocoles de longs, de réduire les coûts accompagnés avec des anticorps, des perles et des taches 39,52,55, et peut réduire le nombre d'écrans nécessaires à haute les demandes de débit. Nous avons récemment décrit comment la technologie retroviral peut améliorer multiplexage par codes à barres génétique fluorescent pour des applications biologiques, en exprimant un dosage précédemment développé pour surveiller le VIH-1 l'activité de protease avec différentes variantes 56,57 cliniquement 58 prévalents. La méthodologie est expliquée de manière plus descriptive en se concentrant sur la façon de sélectionner et amplifier les cellules fluorescentes génétiquement code-barres et comment produire des panneaux de populations clonales exprimant des protéines fluorescentes distinctes et / ou différente fluorescence intensits. Panneaux de populations cellulaires distinctes en fonction de leurs caractéristiques fluorescentes améliorer les capacités multiplexées, qui peut encore être exploité en combinaison avec les tests cellulaires qui abordent différentes questions biologiques. Le protocole décrit également comment concevoir un panneau de cellules portant un code à barres des tests cellulaires précédemment développés dans le laboratoire, à titre d'exemple 59. Ce protocole est donc pas destinée à présenter la technologie bien établie rétroviral / lentiviral pour le transfert génétique, la valeur des protéines fluorescentes ou les applications de la cytométrie de flux 60,48, mais plutôt de démontrer l'amélioration de la puissance de combiner les trois pour les applications multiplexées.

Protocol

1. Préparation de cellules de mammifères, la production virale et la transduction des codes à barres génétique Plate 2,5 x 10 6 cellules adhérentes dans une plaque de 10 cm (soit environ 50-60% de confluence) un jour avant la transfection dans du milieu Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) avec 10% de sérum de veau foetal (SVF). Pour une utilisation en production rétrovirale emballage lignée cellulaire de choix tels que Phoenix-GP (une sorte cadeau de Gary Nolan, l'Université de Stanfor…

Representative Results

Multiplexage fluorescente cellules génétiquement barres pour le but d'applications biologiques ne peut être atteint une fois populations clonales individuelles ont été générés. Le multiplexage est plus efficace lorsque les populations code-barres ont des caractéristiques fluorescentes claires et distinctes avec chevauchement spectral minimal. L'exemple de la figure 1 avec les populations clonales de cellules de mammifères SupT1 illustre que les cellules à code-barres avec mCherry et c…

Discussion

Voici deux procédures bien établies ont été combinées; génie génétique grâce à la technologie rétroviral et la détection des protéines fluorescentes utilisant la cytométrie de flux. Fluorescent codes-barres génétique à base de protéines pour la production de lignées de cellules uniques fournit un moyen simple et robuste pour les applications multiplexées. Générer des cellules génétiquement modifiées à code-barres grâce à la technologie rétroviral, est d'abord un processus de longue halei…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous tenons à remercier le Dr Garry Nolan de l'Université Stanford pour fournir la lignée cellulaire d'emballage Phoenix GP pour la production de particules rétrovirales. Nous remercions le Dr Roger Tsien à l'Université de Californie à San Diego pour fournir td tomate. Nous tenons également à remercier le Fonds de San Diego State University cytométrie de flux de base pour leur service et de l'aide.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
10mL syringes BD   309604 used for filtering the virus
0.45µm plytetrafluoroethylen filter pall corporation 4219 used for filtering the virus
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) Corning 45000-304 cell growth media for HEK 293T cells
PEI (Polyethylenimine) poly sciences 23966-2  2mg/mL concentration used
Hanging bucket centrifuge (refrigerated) Eppendorf  5805 000.017 used for spin infection
PBS (phosphate buffered saline) Corning 21-040-CV used for washing of cells
Polybrene (hexadimethreen bromide) Sigma-Aldrich 107689 Used to increase viral infection efficiency.  Used at a 5µg/mL concentration. 
FACSAria BD Biosciences instrument used for sorting cell populations
FACSCanto BD Biosciences instrument used for cell analysis
Phoenix-GP Gift from Gary Nolan cell line used to produced retroviral particles
Fetal calf serum Mediatech MT35015CV  used for cell growth and sorting
 SupT1 cells ATCC CRL-1942 Human T lymphoblasts
HEK 293T cells ATCC CRL-11268 Human Embryonic Kidney cells that also contain the SV40 large T-antigen
RPMI 1640 Corning 10-040-CV cell growth media for SupT1 cells
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References

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Smurthwaite, C. A., Williams, W., Fetsko, A., Abbadessa, D., Stolp, Z. D., Reed, C. W., Dharmawan, A., Wolkowicz, R. Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications. J. Vis. Exp. (98), e52452, doi:10.3791/52452 (2015).
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