多重化アプリケーションのための蛍光タンパク質との遺伝バーコーディング
Summary
Since the discovery of the green fluorescent protein gene, fluorescent proteins have impacted molecular cell biology. This protocol describes how expression of distinct fluorescent proteins through genetic engineering is used for barcoding individual cells. The procedure enables tracking distinct populations in a cell mixture, which is ideal for multiplexed applications.
Abstract
Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery of fluorescent proteins and their genes have enabled the engineering of protein fusions for localization, the analysis of transcriptional activation and translation of proteins of interest, or the general tracking of individual cells and cell populations. The use of fluorescent protein genes in combination with retroviral technology has further allowed the expression of these proteins in mammalian cells in a stable and reliable manner. Shown here is how one can utilize these genes to give cells within a population of cells their own biosignature. As the biosignature is achieved with retroviral technology, cells are barcoded ´indefinitely´. As such, they can be individually tracked within a mixture of barcoded cells and utilized in more complex biological applications. The tracking of distinct populations in a mixture of cells is ideal for multiplexed applications such as discovery of drugs against a multitude of targets or the activation profile of different promoters. The protocol describes how to elegantly develop and amplify barcoded mammalian cells with distinct genetic fluorescent markers, and how to use several markers at once or one marker at different intensities. Finally, the protocol describes how the cells can be further utilized in combination with cell-based assays to increase the power of analysis through multiplexing.
Introduction
そのような蛍光分光法などの技術、蛍光顕微鏡およびフローサイトメトリーは、すべてが、蛍光に広く、生化学的、生物医学的、及び化学的用途において利用性を依存している。蛍光、内因性または標識を介して、タンパク質発現パターンおよびプロファイル、細胞の運命、タンパク質相互作用及び生物学的機能1-9の分析のために利用され、されているかどうかの生体分子相互作用及び立体配座の変化を検出するための蛍光/蛍光共鳴エネルギー移動を介して10-13。 オワンクラゲの緑色蛍光タンパク質（GFP）14の単離以来、他の刺胞動物、特にサンゴからの追加の天然に存在する蛍光タンパク質の発見は、大部分が識別可能な励起/発光スペクトルを有する既存の蛍光タンパク質の数が増加している。一緒に彼らの遺伝子に変異を導入し15-19とこれら、HAVEさらに、顕微鏡を利用する研究者に利用可能な蛍光タンパク質の真のパレットを取得し、可能性を拡大し、フローサイトメトリーとその研究のために他の蛍光ベースの技術。
並行して、独立しているが、レトロウイルス技術の開発が大幅に哺乳動物細胞における異所性の遺伝情報20-23の安定な発現を促進した。その技術は、細胞型および組織24-28の広い数に、またはトランスジェニック動物の産生のために29〜31の蛍光タンパク質の遺伝子を導入するために使用されていることは驚くべきことではない。レトロウイルスの性質に続いて、異所性蛍光タンパク質の遺伝情報は、セル32のゲノム内に導入され、細胞がever'は`蛍光性になる。このプロパティは、細胞の運命の、または細胞集団内の単一セルの追跡を可能にした。今蛍光細胞は、このようにアックイいます独自のbiosignatureを赤とバーコードのように定義することができます。そのユニークなbiosignatureは、他の細胞からそれを識別し、重要なのは、遺伝的に識別可能な吸収/発光スペクトルを有する異なる蛍光タンパク質を発現するように操作された細胞と区別します。そのような多能性33に向けて初期化因子の追跡などの生物学的用途、核小体局在34の解明のための核内要因の分析、転写の研究35またはニューロンネットワークアーキテクチャ36の研究のための神経細胞の遺伝的標識のための蛍光レポータープラスミドの構築、同じ実験のセットアップのために、異なる蛍光タンパク質遺伝子を悪用している多くのわずか4例です。
フローサイトメトリー広く、遺伝子発現、細胞周期、アポトーシス、及びホスホリルを介したシグナル伝達のような単一細胞レベルでの生物学的プロセスの分析に利用されているATION 37-43は、哺乳動物細胞中の蛍光タンパク質遺伝子の.theの安定な発現は、細胞分析38,44およびリガンド-受容体相互作用45のフローサイトメトリーの有用性が増強されている。拡張機能は、フローサイトメトリーは、ハイスループットおよびハイコンテントスクリーニング46のために広く利用される方法論になることを可能にした。できるカップルのプレートリーダーシステム、イメージングおよびフローサイトメトリー蛍光計とロボット技術の今拡張した数にもかかわらず、これらの強化された技術力を活用し、合うことができる実験的なデザインの欠如があるように思われる。
、高速で信頼性の高い、簡単かつ堅牢な細胞ベースの方法が大幅にさらにハイスループット能力を高める多重化アプリケーションのために必要とされる。これは、多重化された形式で、エンジニアリング、細胞ベースのアッセイは、ハイスループットスクリーニング39,47-50のパワーを高めることができる創薬の分野において特にそうである</sup>。は、1つのサンプル中の同時分析を可能にするように多重化は、さらに高いスループット能力51-54を高める。蛍光遺伝子バーコードは、エレガント多重化を可能にするだけでなく、一度に操作、時間のかかるプロトコルの必要性を回避する、抗体、ビーズや汚れ39,52,55に伴うコストを削減し、高に必要なスクリーンの数を減らすことができるだけでなくスループットのアプリケーション。我々は最近、以前に別の臨床的に普及している変異体58とHIV-1プロテアーゼ活性56,57を監視するために開発されたアッセイを発現させることによって、生物学的用途のために、蛍光遺伝子バーコードを介して多重化を向上させることができる方法のレトロウイルス技術が記載されている。方法は、遺伝的に、蛍光バーコードのセルを選択し、増幅する方法に焦点を当て、より説明的な方法で説明した方法を異なる蛍光タンパク質および/または異なる蛍光intensitを発現するクローン集団のパネルを生産するさIES。それらの蛍光特性に基づいて識別可能な細胞集団のパネルは、異なる生物学的問題に取り組むための細胞ベースのアッセイと組み合わせて利用することができる多重化能力を高める。プロトコルはまた、例えば59のように、以前に研究室で開発されたセルベースアッセイの1を保有するバーコード細胞のパネルを設計する方法について説明します。このプロトコルは、このように遺伝的伝達のための十分に確立されたレトロウイルス/レンチウイルス技術、60,48サイトメトリー蛍光タンパク質またはフローのアプリケーションの価値を示すためではなく、多重化されたアプリケーションのための3つを組み合わせて強化する力を示すことを意図するものではない。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、2つのよく確立された手順がまとめられました。レトロウイルス技術、フローサイトメトリーを用いて蛍光タンパク質を検出することにより遺伝子工学。ユニークな細胞株の生産のための蛍光タンパク質ベースの遺伝的バーコードは、多重化されたアプリケーションのための堅牢かつ簡単な方法を提供します。レトロウイルス技術による遺伝子操作されたバーコード細胞を生成する…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、レトロウイルス粒子の生産のためのフェニックスGPパッケージング細胞株を提供するためにスタンフォード大学から博士ギャリーノーランに感謝したいと思います。私たちは、TDトマトを提供するために、カリフォルニア州サンディエゴの大学の博士ロジャーツィンに感謝。我々はまた、彼らのサービスと助けをサンディエゴ州立大学フローサイトメトリーコアファシリティに感謝したいと思います。
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 10mL syringes | BD | 309604 | used for filtering the virus |
| 0.45µm plytetrafluoroethylen filter | pall corporation | 4219 | used for filtering the virus |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Corning | 45000-304 | cell growth media for HEK 293T cells |
| PEI (Polyethylenimine) | poly sciences | 23966-2 | 2mg/mL concentration used |
| Hanging bucket centrifuge (refrigerated) | Eppendorf | 5805 000.017 | used for spin infection |
| PBS (phosphate buffered saline) | Corning | 21-040-CV | used for washing of cells |
| Polybrene (hexadimethreen bromide) | Sigma-Aldrich | 107689 | Used to increase viral infection efficiency. Used at a 5µg/mL concentration. |
| FACSAria | BD Biosciences | instrument used for sorting cell populations | |
| FACSCanto | BD Biosciences | instrument used for cell analysis | |
| Phoenix-GP | Gift from Gary Nolan | cell line used to produced retroviral particles | |
| Fetal calf serum | Mediatech | MT35015CV | used for cell growth and sorting |
| SupT1 cells | ATCC | CRL-1942 | Human T lymphoblasts |
| HEK 293T cells | ATCC | CRL-11268 | Human Embryonic Kidney cells that also contain the SV40 large T-antigen |
| RPMI 1640 | Corning | 10-040-CV | cell growth media for SupT1 cells |
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