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एक छोटी मात्रा Bioassay जल-पल्स आयाम संग्राहक (जल-पीएएम) Fluorometry का प्रयोग बैक्टीरियल / Phytoplankton सह संस्कृति का आकलन करने के लिए

Published: March 11, 2015 doi: 10.3791/52455
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, University of Alberta

Abstract

संस्कृति प्रयोग 1-7 भर subsampled जा सकता है कि इतने सूक्ष्म शैवाल की प्रयोगात्मक हेरफेर के लिए पारंपरिक तरीकों, संस्कृति की बड़ी मात्रा में (5 एल के लिए 20 मिलीग्राम) कार्यरत है। बड़ी मात्रा के subsampling कई कारणों के लिए समस्याग्रस्त किया जा सकता है: 1) यह कुल मात्रा और सतह के क्षेत्र में परिवर्तन का कारण बनता है: प्रयोग के दौरान संस्कृति की मात्रा के अनुपात; 2) छद्म प्रतिकृति (यानी, एक ही इलाज कुप्पी 8 से नमूने) अक्सर बल्कि सच प्रतिकृति (दोहराने के उपचार से यानी, नमूना) की तुलना में कार्यरत है दोहराने; 3) प्रयोग की अवधि कुल मात्रा द्वारा सीमित है; और 4) axenic संस्कृतियों या सामान्य बैक्टीरिया microbiota संदूषण सामान्यतः subsampling के दौरान होता है के रूप में लंबी अवधि के प्रयोगों के दौरान बनाए रखने के लिए मुश्किल है।

microtiter प्लेट के उपयोग के भीतर अप करने के लिए 48 अलग-अलग उपचार के साथ एक मिलीलीटर संस्कृति से प्रत्येक के लिए प्रयोग की जाने वाली संस्करणों को दोहराने में सक्षम बनाता हैएक 12.65 एक्स 8.5 एक्स 2.2 सेमी की थाली, जिससे प्रयोगात्मक मात्रा कम है और किसी भी उपचार subsampling बिना व्यापक नकल के लिए अनुमति देता है। 9-11 स्क्रीनिंग जीवाणु-काई के सह संस्कृतियों, काई के शरीर क्रिया विज्ञान परीक्षण, और विष: इसके अतिरिक्त, इस तकनीक प्रयोगात्मक सहित प्रारूपों के एक किस्म फिट करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। एक alga, जीवाणु और / या सह संस्कृतियों के साथ व्यक्तिगत कुओं तक ही सीमित सहित कई प्रयोगशाला प्रक्रियाओं के लिए नमूना है, लेकिन नहीं किया जा सकता है: जल पल्स आयाम संग्राहक (जल-पीएएम) fluorometry, माइक्रोस्कोपी, बैक्टीरियल कॉलोनी बनाने इकाई (CFU) मायने रखता है और प्रवाह cytometry। microtiter प्लेट स्वरूप और पानी पीएएम fluorometry के संयोजन प्रकाश रासायनिक उपज और नमूने, उच्च reproducibility के बीच कम परिवर्तनशीलता के साथ अन्य प्रकाश रासायनिक मापदंडों के एकाधिक तेजी से मापन के लिए अनुमति देता है और एक प्रयोग के पाठ्यक्रम पर एक काबोइ या शंक्वाकार फ्लास्क subsampling के कई नुकसान से बचा जाता है ।

Introduction

Phytoplankton फिजियोलॉजी पारंपरिक रूप से शंक्वाकार बोतल में 20 मिलीलीटर से carboys 1-7 में 5 एल को लेकर मेसो-पैमाने पर प्रयोग में अध्ययन किया गया है। हर समय बिंदु के लिए दोहराने के नमूनों का त्याग एक असहनीय प्रयोगात्मक सेटअप बनाता है के रूप में यह प्रायोगिक पैमाने पर, प्रयोगात्मक निगरानी के लिए subsampling की आवश्यकता है।

कम या बड़ी मात्रा से subsampling और छद्म प्रतिकृति की सीमाओं को समाप्त होगा काई के शरीर क्रिया विज्ञान के प्रयोगों के लिए प्रयोगात्मक मात्रा miniaturizing द्वारा एक ही दीन का इनक्यूबेटर अंतरिक्ष का उपयोग करते समय क्षमता स्वतंत्र प्रयोगों की संख्या में वृद्धि करने के लिए। एक microtiter प्लेट स्वरूप प्रयोगात्मक चर परिस्थितियों में शैवाल जोड़ तोड़ के लिए एक 1 मिलीलीटर संस्कृति मात्रा का उपयोग काई bioassays के लिए विकसित किया गया है। इस छोटे प्रयोगात्मक मात्रा प्रतिकृति की संख्या में वृद्धि की जानी करने के लिए अनुमति देता है, की वजह से दोहराने के नमूने और के बीच एक कम परिवर्तनशीलता के लिए प्रयोगात्मक reproducibility के बढ़ जाती है(चित्रा 2) 12 से 140 दिनों के लिए प्रयोगात्मक नियंत्रण (यानी, axenic काई संस्कृतियों) को बनाए रखते हुए प्रयोगों, और सच प्रतिकृति की अनुमति देता है।

इस microtiter प्लेट स्वरूप आसानी से इस तरह के रूप में, प्रयोगात्मक सवालों की एक किस्म के लिए अनुकूलित है: एक जीवाणु इसकी काई के मेजबान के साथ एक, सहजीवी तटस्थ या रोगजनक बातचीत के लिए है? एक alga के लिए एक यौगिक उत्तेजक के अलावा या विषैला होता है? इन और अन्य सवालों के इस नए प्रारूप 9-11 का उपयोग कर एक तेजी से उच्च throughput ढंग से संबोधित किया जा सकता है।

एक 48 अच्छी तरह से microtiter संस्कृति की थाली प्रत्येक 1 मिलीलीटर अच्छी तरह से एक ही समय बिंदु पर नमूना है कि एक स्वतंत्र प्रयोगात्मक स्थापना होने के लिए अनुमति देता है। विभिन्न मापदंडों सहित इस 1 मिलीलीटर मात्रा से नमूना है, लेकिन सीमित नहीं किया जा सकता है: जल पल्स आयाम संग्राहक (जल-पीएएम) fluorometry (सामग्री और उपकरण तालिका देखें) 1 का उपयोग क्लोरोफिल प्रतिदीप्ति और प्रकाश रासायनिक मापदंडों3। जल-पीएएम fluorometry शैवाल 13 के साथ प्रदर्शन प्रयोगों पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक तेजी से और गैर इनवेसिव तकनीक है। 14,15 (जल-पीएएम के लिए 4 मिलीलीटर मात्रा - - एक से 2 मध्यम में पतला संस्कृति के 300 μl 150) यह एक छोटी सी संस्कृति मात्रा से संश्लेषक दक्षता और PSII स्वास्थ्य की माप की अनुमति देता है। जल-पीएएम fluorometry के अलावा, इस स्थापना सहित अन्य मानकों की एक किस्म को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन सीमित नहीं: शैवाल कोशिकाओं और काई सेल आकृति विज्ञान में परिवर्तन से जुड़ी बैक्टीरिया कल्पना करने के लिए माइक्रोस्कोपी; यूनिट (CFU) की गिनती के गठन बैक्टीरियल कॉलोनी; और काई सेल मायने रखता है और पहचान के उप-जनसंख्या के लिए प्रवाह cytometry।

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Protocol

प्रायोगिक सेटअप के लिए 1. गणना

  1. काई और / या समीकरण एक का उपयोग करके पूरे प्रयोग के लिए आवश्यक हो जाएगा कि नियंत्रण के लिए आवश्यक बैक्टीरियल संस्कृतियों की मात्रा की गणना:
    1 समीकरण
    Y दिन और जेड प्रति जरूरत नियंत्रण की संख्या के बराबर होती कहां दिनों की संख्या के बराबर होती है।
  2. 2 समीकरण का उपयोग करके प्रयोग के लिए सह संस्कृतियों के लिए आवश्यक हैं कि शैवाल और / या बैक्टीरियल संस्कृतियों की मात्रा की गणना:
    2 समीकरण
    नोट: यह किसी भी यौगिक स्क्रीन के साथ 'के सह-संस्कृति' के प्रयोगों को बदलने के लिए संभव है; बस प्रयोगात्मक डिजाइन फिट करने के लिए विलायक अंतिम यौगिक, और काई सांद्रता समायोजित करें।
  3. के लिए जल्दी-घातीय काई संस्कृति की अंतिम मात्रा की गणना करने के समीकरण 1 और 2 का उपयोग करें (आमतौर पर 5 दिनों ~ 10 4 कोशिकाओं / एमएल लेकिन इस performi द्वारा निर्धारित किया जाना चाहिए(यह मात्रा 3 समीकरण का उपयोग कर कदम 2.3) के लिए आवश्यक है प्रयोग के लिए आवश्यक एनजी एक काई के विकास की अवस्था):
    3 समीकरण
  4. समीकरण 4 का उपयोग (यह मात्रा 4.2 कदम के लिए आवश्यक है) के प्रयोग के लिए आवश्यक 10 4 CFU / एमएल जीवाणु संस्कृति (या वांछित टीका एकाग्रता) की अंतिम मात्रा की गणना करने के समीकरण 1 और 2 का उपयोग करें:
    समीकरण 4
    नोट: त्रुटि pipetting के लिए खाते में करने के लिए कदम 1.3 और 1.4 में अतिरिक्त 10 एमएल और प्रदर्शन कर रहे हैं कि किसी भी परीक्षण का उपयोग करें (प्रवाह cytometry, जैसे, पानी पीएएम, माइक्रोस्कोपी, आदि) 0 डी पर। प्रयोगात्मक डिजाइन फिट करने के लिए यदि आवश्यक हो तो इस मात्रा बढ़ाएँ।
    नोट: एक 8 दिन प्रयोग का एक उदाहरण गणना की धारा 10 को देखने के लिए मीडिया के व्यंजनों के लिए पूरक तालिका देखें।

प्रायोगिक सेटअप के लिए 2. बढ़ते Algal प्रकोष्ठों

  1. पृथक या एक प्राप्तसक्रिय रूप से axenic काई संस्कृति बढ़ रही है।
  2. Aseptically हस्तांतरण एक एक सुनिश्चित करने बाँझ काई मध्यम (जैसे, एल 1 या इसी तरह के समुद्री शैवाल मध्यम, सामग्री और उपकरण देखें तालिका) में काई संस्कृति की अंतिम मात्रा का 10%,: ताजा माध्यम में काई संस्कृति के 9 कमजोर पड़ने। कि तनाव के लिए पहले से निर्धारित विकास की स्थिति का उपयोग कर एक दीन का इनक्यूबेटर में पतला शैवाल बढ़ो (जैसे, एक 16 के साथ 18 डिग्री सेल्सियस: 8 घंटा प्रकाश: अंधेरे चक्र आमतौर पर इस्तेमाल किया जाता है)।
  3. शैवाल की अंतिम मात्रा है कि 9 कमजोर पड़ने और: संस्कृति जल्दी-घातीय चरण, री-संस्कृति पर पहुँच गया है जब एक ही बाँझ काई के माध्यम में शैवाल (जैसे, एल 1 या इसी तरह के समुद्री शैवाल मध्यम), अंतिम एकाग्रता एक एक है सुनिश्चित गणना वी ए (1.3 चरण) के बराबर है।
    नोट: यह इन संस्कृतियों axenic हैं सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है। (एक सामान्य समुद्री बैक्टीरियल माध्यम पर जैसे, मरीन एक 20 μl विभाज्य चढ़ाना द्वारा संदूषण के लिए सभी काई मीडिया और काई के शेयर बोतलें टेस्टशोरबा 2216 में 1.5% अगर या समान) के साथ पूरक।
  4. जल्दी-घातीय चरण (~ 10 4 कोशिकाओं / एमएल) के लिए काई संस्कृति विकसित।
    नोट: हर काई तनाव संवर्धन शर्तों के आधार पर एक अद्वितीय विकास की अवस्था है। प्रारंभिक घातीय चरण (~ / एमएल 10 4 कोशिकाओं) (यानी प्रवाह cytometry या माइक्रोस्कोपी का उपयोग) सेल घनत्व के आधार पर एक काई के विकास की अवस्था के प्रदर्शन से निर्धारित किया जा सकता है।

3. टीका के लिए बैक्टीरियल कोशिकाओं की तैयारी

  1. (चुना बैक्टीरियल मध्यम और विकास की स्थिति में वृद्धि वक्र कर रही द्वारा स्थिर चरण में जीवाणु के जीवाणु एकाग्रता (CFU / एमएल) और ऑप्टिकल घनत्व (ओवर ड्राफ्ट) पूर्व निर्धारित करती है उदाहरण के लिए, 25 डिग्री सेल्सियस और 160 rpm पर 2216 समुद्री शोरबा, या इसी के समान)। कदम 3.7 में सही ढंग से कोशिकाओं को कमजोर करने के लिए बाद में कोशिकाओं (कदम 3.3) विकसित करने के लिए इस जानकारी का उपयोग करें और।
  2. Aseptically उदाहरण के लिए एक 1.5% अगर प्लेट (2216 कोमल समुद्री शोरबा से एक पृथक और हौसले से उगाया बैक्टीरियल कॉलोनी हस्तांतरणजैसे जीवाणु तरल मध्यम (5 एमएल में 1.5% अगर या इसी तरह के समुद्री बैक्टीरियल ठोस मध्यम) के साथ mented, समुद्री शोरबा 2216 या इसी तरह के समुद्री बैक्टीरियल मध्यम)।
  3. (- जीवाणु पर निर्भर करता है, 36 घंटा ~ 12) एक रोलिंग ड्रम या प्रकार के बरतन पर स्थिर चरण के लिए जीवाणु आगे बढ़ें। शैवाल कोशिकाओं जल्दी-घातीय चरण (~ 10 4 कोशिकाओं / एमएल) पर पहुंच गया है कि एक ही समय में - जीवाणु स्थिर चरण (10 9 CFU / एमएल ~ 10 8) तक पहुँच जाता है, ताकि प्रयोग की योजना बनाएँ।
  4. एक विंदुक का प्रयोग, मध्यम में टेस्ट ट्यूब से जुड़ी किसी भी biofilm नीचे धो लें। पिपेट एक बाँझ 1.5 एमएल microtube में अच्छी तरह से मिश्रित जीवाणु संस्कृति के 1 मिलीलीटर। 14,000 एक्स जी पर एक मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।
  5. निकालें और गोली (बैक्टीरियल कोशिकाओं) में खलल न डालें बिना सतह पर तैरनेवाला (बैक्टीरिया मीडिया) के निपटान के। (गोली) के साथ microtube बाँझ काई मीडिया (जैसे, एल 1 या समान) के 1 मिलीलीटर जोड़ें। भंवर microtube काई के मीडिया में गोली resuspend।
  6. दूसरे धोने:3.5 कदम दोहराएँ।
    नोट: इस के पोषक तत्व की संरचना को बदल सकता है के रूप में यह अच्छी तरह से पहले उनके साथ शैवाल inoculating कोशिकाओं से बैक्टीरियल मीडिया, सेल कतरे, उत्सर्जित प्रोटीन और छोटे अणुओं के सभी हटाने के क्रम में काई के मीडिया के साथ बैक्टीरियल कोशिकाओं को धोने के लिए महत्वपूर्ण है काई मीडिया स्क्रीन करने के लिए बायोएक्टिव अणुओं परिचय या।
  7. क्रमानुसार वांछित अंतिम बैक्टीरियल एकाग्रता (CFU / एमएल) की तुलना में अधिक ध्यान केंद्रित 100 गुना है कि एक अंतिम एकाग्रता के लिए, काई के मीडिया में धोया बैक्टीरियल कोशिकाओं पतला। 4.2 कदम के लिए काई के मीडिया में धोया और पतला किया गया है कि कोशिकाओं से युक्त microtube बचाओ।
    नोट: 0 डी पर बैक्टीरिया के लिए शैवाल का अनुपात 1: एक एक होने के आधार पर प्रयोग की योजना बनाएँ। कदम 3.7 में प्रारंभिक कोशिकाओं क्रमानुसार 10 6 CFU / एमएल पतला होना चाहिए ताकि प्रयोग के लिए यह वांछित प्रारंभिक जीवाणु एकाग्रता ऐसा करने के लिए, 10 4 CFU / एमएल है।

प्रयोग के लिए 4. तैयार कर रहा है जीवाणुअल सेटअप

  1. 4 बाँझ autoclaved कांच शंक्वाकार बोतल तैयार करने और उन्हें लेबल: एक) 'काई नियंत्रण कुप्पी', ख) 'पतला बैक्टीरियल शेयर कुप्पी', ग) 'बैक्टीरिया नियंत्रण कुप्पी', और घ) 'के सह-संस्कृति कुप्पी'।
  2. से जीवाणु निलंबन पतला अंतिम मात्रा = वी बी (1.4 कदम) के लिए बाँझ काई के मीडिया के साथ 3.7 1:99 कदम। कुप्पी में लेबल पतला बैक्टीरियल शेयर (कदम 4.1) में कमजोर पड़ने बनाओ।
    नोट: पिछले उदाहरण (4.2 कदम) में, इस 1:99 कमजोर पड़ने 10 4 CFU / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता देता है। भंवर फ्लास्क कोशिकाओं मिश्रण करने के लिए।
  3. पिपेट वी नियंत्रण पतला जीवाणु स्टॉक से (1.1 कदम) और बैक्टीरियल नियंत्रण कुप्पी में डाल दिया।
  4. बैक्टीरियल नियंत्रण कुप्पी में बाँझ काई के माध्यम के पिपेट वी नियंत्रण (यह एक 1: 1 के कमजोर पड़ने)। भंवर फ्लास्क कोशिकाओं मिश्रण और कदम 7.3 के लिए अलग सेट करने के लिए।
  5. पतला जीवाणु स्टॉक से पिपेट वी सह संस्कृतिकदम 6.1 के लिए अलग कुप्पी सेट, सह संस्कृति फ्लास्क फ्लास्क।
    नोट: एक बार में एक ही शैवाल पर एकाधिक सह संस्कृतियों कर जब यह व्यक्तिगत रूप से प्रत्येक तनाव के लिए वी सह संस्कृति को फिर से गणना और फिर कदम दोहराने के लिए आवश्यक है (यानी, दो अलग अलग बैक्टीरिया के सह संस्कृति एक नियंत्रण के साथ आइसोलेट्स) अलग से एक सह संस्कृति के लिए 4.5। यह समीकरण 5 में दिखाया दोनों सह संस्कृतियों शामिल करने के लिए 1.3 चरण में गणना वी ए बढ़ाने के लिए भी आवश्यक है:
    5 समीकरण

प्रायोगिक सेटअप के लिए शैवाल की तैयारी 5.

  1. कोशिकाओं में अच्छी तरह से मिश्रित दिखाई देते हैं जब तक धीरे एक चौड़े मुंह विंदुक टिप के साथ (2.4 कदम से) जल्दी-घातीय काई संस्कृति मिश्रण।
  2. काई नियंत्रण कुप्पी के लिए काई के शेयर बोतल से पिपेट वी नियंत्रण। धीरे से एक 10 एमएल पिपेट का उपयोग विंदुक। तब प्रतिदिन इनक्यूबेटर में काई के शेयर बोतल वापसी।
  3. पिपेट वी शेष भागकाई नियंत्रण फ्लास्क बाँझ काई के माध्यम के rol (यह एक 1: 1 के कमजोर पड़ने)। कदम 7.4 के लिए आवश्यक है, जब तक प्रतिदिन इनक्यूबेटर में कुप्पी और जगह मिश्रण करने के लिए भंवर।

6. की तैयारी प्रायोगिक सह संस्कृति

  1. धीरे कदम 4.5 से बैक्टीरियल सह संस्कृति कुप्पी में काई के शेयर कुप्पी से वी सह संस्कृति विंदुक। कदम 7.5 के लिए जब तक जरूरत प्रतिदिन इनक्यूबेटर सह संस्कृति कुप्पी लौटें।
    नोट: बैक्टीरियल नियंत्रण में जीवाणुओं की एकाग्रता प्रयोगात्मक सह संस्कृति में बैक्टीरियल एकाग्रता के बराबर होना चाहिए। इसी तरह, काई के नियंत्रण में शैवाल की एकाग्रता प्रयोगात्मक सह संस्कृति में शैवाल की एकाग्रता के बराबर होना चाहिए। एक ही प्रारंभिक बैक्टीरियल और काई सांद्रता होने से, जनसंख्या घनत्व प्रयोग भर में तुलना की जा सकती।

7. microtiter प्लेट्स की स्थापना

  1. चित्रा 1 के अनुसार एक बाँझ 48 अच्छी तरह से microtiter प्लेट फूट डालो।बाँझ मंदक या गैर संश्लेषक या तो नमूने युक्त बाहरी कुओं से ऊपर लेबल।
    नोट: थाली कुओं की यादृच्छिकीकरण उसी दिन लिया नमूने के लिए किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, वृत्त का चतुर्थ भाग एक प्रयोग में एक डी पर जांचा जाएगा; 4 और सी 2 - - चित्र 1 में दिखाया के रूप में 4. बाँझ समाधान के साथ भरा थाली की परिधि छोड़ दो यादृच्छिक किया जाना चाहिए कि कुओं बी 2 कर रहे हैं।

चित्र 1
। के रूप में निम्नानुसार एक 48 अच्छी तरह से microtiter प्लेट वेल्स में नमूना नियुक्ति की चित्रा 1. योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व भरे जाने के लिए कर रहे हैं: कॉलम 1 और 6, ए एफ के माध्यम से कुओं ( सर्किल 1 )) पीबीएस (या अन्य बाँझ समाधान / मीडिया 1x 1 मिलीलीटर से भर रहे हैं। पंक्तियाँ एक और एफ, कुओं 2-8 ( सर्किल दो ) 1 मिलीलीटर बैक्टीरियल नियंत्रण से भर रहे हैं; roWS बी और ई कुओं 2-8 ( सर्किल 3 ) 1 मिलीलीटर काई के नियंत्रण से भर रहे हैं; पंक्तियों सी और डी, कुओं 2-8 ( सर्किल 4 ) 1 मिलीलीटर सह संस्कृति से भर रहे हैं। 4, इस प्लेटें भर में बेतरतीब है और तदनुसार लेबल किया जाना चाहिए - थाली चार quadrants (ए 2, ए 5, डी 2, और D5) इन quadrants 1 प्रत्येक विशिष्ट नमूने दिनों कर रहे हैं में विभाजित है। प्रत्येक दिन के भीतर हम काई नियंत्रण (randomizing की सलाह सर्किल 5 ) और सह संस्कृति ( सर्किल 6 एक यादृच्छिक संख्या जनरेटर का उपयोग) कुओं। काई संस्कृतियों का छायांकन को रोकने के लिए 1x पीबीएस और / या जीवाणु नियंत्रण कुओं पर ढक्कन लेबल।

  1. पिपेट 1 मिलीलीटर 1x फॉस्फेट बफर समाधान (पीबीएस, पीएच 7.4) या चित्र 1 में संकेत के रूप में उपयुक्त कुओं में अन्य बाँझ समाधान। धीरे धीरे और सावधानी के साथ इस प्रदर्शन करते हैं। पीबीएस होगा चानजीई काई और / या सह-संस्कृति के माध्यम से शक्ति ईओण यह अन्य कुओं इसलिए सावधानी से संभाल में splatters है।
  2. पिपेट कुओं में बैक्टीरियल नियंत्रण संस्कृति के 1 मिलीलीटर जीवाणु नियंत्रण (चित्रा 1) लेबल। बैक्टीरियल बसने से बचने के लिए प्रत्येक थाली pipetting से पहले बैक्टीरियल कुप्पी भंवर।
  3. पिपेट एक एक चौड़े मुंह विंदुक टिप (चित्रा 1) का उपयोग काई के नियंत्रण में लेबल कुओं में शैवाल नियंत्रण संस्कृति के मिलीलीटर। बैक्टीरियल कुप्पी के रूप में के रूप में नियमित रूप से काई कुप्पी भंवर। शैवाल सिंक या फ्लोट करने के लिए जाता है तो एक नेत्रहीन वर्दी संस्कृति को बनाए रखने के लिए आवश्यक है, के रूप में के रूप में नियमित रूप से ज़ुल्फ़।
  4. एक चौड़े मुंह विंदुक टिप, पिपेट उपयुक्त कुओं में सह संस्कृति के 1 मिलीलीटर (चित्रा 1) का उपयोग करना। काई कुप्पी के रूप में के रूप में नियमित रूप से सह संस्कृति कुप्पी घूमता।
  5. वांछित तापमान और दीन का प्रकाश चक्र में एक दीन का इनक्यूबेटर में parafilm और जगह के साथ एक थाली सील (: 8 घंटा प्रकाश: एक 16 के साथ 18 डिग्री सेल्सियस अंधेरे चक्र आमतौर पर इस्तेमाल किया जाता है)। छुट्टीतैयार है जब तक प्रतिदिन इनक्यूबेटर में प्लेटें पीएएम रीडिंग (धारा 8) लेने के लिए। सुनिश्चित करें कि सभी प्लेटों सुसंगत प्रकाश जोखिम के लिए अनुमति देने के लिए एक ही दिशा में उन्मुख होते हैं।
  6. पीबीएस, काई मीडिया, काई के शेयर और काई के नियंत्रण से एक 20 μl विभाज्य लो और एक उपयुक्त गैर चयनात्मक माध्यम पर थाली ड्रॉप (उदाहरण के लिए, 1.5% अगर साथ पूरक समुद्री शोरबा 2216) और 18 प्लेटें सेते हैं - 72 के लिए 25 डिग्री सेल्सियस घंटा संदूषण के लिए परीक्षण करने के लिए। विकास बैक्टीरिया शामिल नहीं होना चाहिए कि समाधान में से किसी में दिखाई देता है, तो इन आंकड़ों नहीं किया जाना चाहिए।
  7. पढ़ने प्रयोगात्मक 0 डी पीएएम fluorometry (कदम 8.1 देखें) के लिए काई नियंत्रण और सह संस्कृति बोतल से शेष नमूना का उपयोग कर पीएएम fluorometry रीडिंग ले। किसी भी अन्य 0 डी माप भी शेष काई नियंत्रण, बैक्टीरियल नियंत्रण और सह संस्कृति के नमूनों के साथ किया जाना चाहिए।

शेयर नमूनों से 8. लेते हुए पीएएम Fluorometry रीडिंग

  1. जल-पीएएम शून्यरीडिंग 8 लेने से पहले एक साफ क्युवेट में बाँझ काई के मीडिया के साथ।
  2. पिपेट प्रयोग में इस्तेमाल एक ही काई के माध्यम की 2.7 मिलीग्राम से युक्त एक साफ क्युवेट में काई के नियंत्रण या सह-संस्कृति बोतल से 300 μl। एक चौड़े मुंह विंदुक टिप के साथ धीरे नमूना और मंदक मिलाएं।
  3. पोंछ बंद एक ऊतक के साथ क्युवेट के बाहर से सभी उंगलियों के निशान जल-पीएएम में क्युवेट रखने से पहले।
  4. जल-पीएएम में क्युवेट रखें। टोपी के साथ नमूना कवर और इसे करने के लिए 3 मिनट के लिए डार्क अनुकूल अनुमति देते हैं। तमोनुकूलन टाइम्स शैवाल की प्रजातियों के आधार पर भिन्न है और प्रयोग में इस्तेमाल विशिष्ट शैवाल के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए। काई प्रतिदिन इन्क्यूबेटरों 16,17 के अंधेरे चक्र के मध्य के दौरान पानी-पीएएम रीडिंग लेने से लंबा तमोनुकूलन टाइम्स (> 20 मिनट) से बचें।
  5. अंधेरे रूपांतरण के बाद, एफ 0 बटन मारा। एक काई के माध्यम में: प्रतिदीप्ति रीडिंग 3900 से ऊपर हैं, तो नमूना एक पतला। एक अतिरिक्त 3 मिनट और Tak के लिए डार्क अनुकूलईए नया पढ़ने। एफ 0 और एफ एम रीडिंग 3900 से नीचे हैं जब तक काई के माध्यम में 1: एफ 0 या एफ एम रीडिंग 3900 के ऊपर अभी भी कर रहे हैं, तो नमूना एक पतला करने के लिए जारी है।
    नोट: काई नमूना एक पतला है अगर उदाहरण के लिए: अंतिम प्रतिदीप्ति रिकॉर्डिंग जब इन dilutions के लिए खाते में करने के लिए सुनिश्चित करें कि कमजोर पड़ने ट्यूब करने के लिए अच्छी तरह से प्रारंभिक स्थानांतरण के दौरान 9, तो 500 में से काई प्रतिदीप्ति पढ़ने प्रतिलोम से गुणा किया जाना चाहिए कमजोर पड़ने कारक की और ट्यूब की वास्तविक प्रतिदीप्ति (इस मामले में 10 में) तो 5000 है।
  6. एफ 0 की स्थापना के बाद, एफ एम रीडिंग लेने के लिए सैट बटन मार से हर 90 सेकंड पढ़ने saturating नाड़ी (सैट-पल्स) ले। रीडिंग के बीच समय अंतराल काई के तनाव के आधार पर समायोजित किया जा सकता है। त्यागें नमूना।
  7. शेष नमूनों के लिए 8.6 - दोहराएँ 8.1 कदम।

Microtiter प्लेटों से 9. लेते हुए पीएएम Fluorometry रीडिंग

  1. लेबलकाई के नियंत्रण और कुओं C2 के लिए 4 - - बैक्टीरियल सह संस्कृति के लिए 4 (चित्रा 1 में थाली लेआउट देखें) कुओं बी 2 के लिए> 3 एमएल मात्रा के 6 बाँझ नमूना ट्यूबों।
  2. विभाज्य प्रत्येक ट्यूब में बाँझ काई के माध्यम के 2.7 मिलीलीटर।
  3. प्रतिदिन इनक्यूबेटर में ट्यूबों की जगह है और उन्हें शैवाल 30 मिनट के लिए कम से विकसित किया गया था के तापमान को acclimate करने के लिए अनुमति देते हैं।
  4. इनक्यूबेटर से microtiter प्लेट हटाने से पहले सक्रिय रूप से कमजोर पड़ने ट्यूबों के लिए कुओं से संस्कृति के हस्तांतरण, जबकि केवल 9.5 कदम (पन्नी को दूर एल्यूमीनियम पन्नी (या समान) के साथ थाली कवर द्वारा सीमित है अंधेरा आदत कुओं में प्रकाश है कि प्रवेश सुनिश्चित - 9.7)।
  5. Aseptically धीरे-धीरे ऊपर और नीचे pipetting द्वारा एक चौड़े मुंह विंदुक टिप के साथ अच्छी तरह से (बी 2) अच्छी तरह से पहले microtiter प्लेट मिश्रण।
  6. (एक चौड़े मुंह विंदुक टिप के साथ अपनी इसी नमूना ट्यूब के लिए 300 μl अच्छी तरह से बी 2 (चित्रा 1) से इनक्यूबेटर और aseptically हस्तांतरण से कमजोर पड़ने ट्यूब प्राप्तकाई के माध्यम में नमूना) के 9 कमजोर पड़ने: यह एक एक है।
  7. शेष कुओं के लिए 9.6 (B3,4 और सी 2 - - 4) दोहराएँ 9.5 कदम।
  8. एल्यूमीनियम पन्नी के साथ नमूना ट्यूब कवर किया और पानी-पीएएम के लिए तैयार है जब तक प्रतिदिन इनक्यूबेटर में उन्हें वापस।
  9. 8.7 - चरणों 8.1 में वर्णित के रूप में पानी-पीएएम रीडिंग प्रदर्शन करते हैं। इनक्यूबेटर को लौटने से पहले parafilm के साथ microtiter प्लेट सील।
  10. प्रयोग की अवधि के लिए योजना बनाई समय अंतराल पर रीडिंग दोहराएँ। आवृत्ति और नमूने की लंबाई प्रयोग की शुरुआत में योजना बनाई जानी चाहिए।

10 नमूना प्रयोग

नमूना प्रयोग एक जीवाणु (Phaeobacter gallaeciensis BS107) और एक microalga (Emiliania huxleyi तनाव (CCMP3266)) की एक 10 दिन के सह संस्कृति है। यह एक काई नियंत्रण, बैक्टीरियल नियंत्रण, और एक जीवाणु-काई प्रयोगात्मक सह संस्कृति भी शामिल है।

  1. एक कदम (आवश्यक बैक्टीरियल और काई के शेयरों की मात्रा की गणना।1-1.4)
    समीकरण 10
  2. 36 मिलीलीटर माध्यम में शैवाल के 4 मिलीलीटर inoculating द्वारा, काई के शेयर, 40 मिलीलीटर की एक वी ए को तैयार है और जल्दी-घातीय वृद्धि ~ 10 4 कोशिकाओं / एमएल (2.1 कदम - 2.4) के एक सेल घनत्व के साथ हासिल की है, जब तक incubated।
  3. (10 4 CFU / एमएल हो जाएगा बैक्टीरिया के अंतिम एकाग्रता) काई के मीडिया के साथ 40 मिलीलीटर की एक वी बी करने के लिए धारा 3 में प्राप्त 10 6 CFU / एमएल बैक्टीरिया के 400 μl गिराए द्वारा बैक्टीरियल शेयर कुप्पी तैयार करें।
  4. स्थानांतरण जीवाणु नियंत्रण फ्लास्क बैक्टीरियल शेयर के आधे (20 एमएल) और बैक्टीरियल नियंत्रण बनाने के लिए काई मीडिया के 20 मिलीलीटर जोड़ें। स्थानांतरण आधे (20 मिलीग्राम) काई काई नियंत्रण कुप्पी को शेयर और काई के नियंत्रण (धारा 5) बनाने के लिए काई मीडिया के 20 मिलीलीटर जोड़ें। सह संस्कृति की स्थापना के लिए सह संस्कृति फ्लास्क बैक्टीरियल शेयर की शेष 20 मिलीलीटर स्थानांतरण और काई के शेयर की शेष 20 मिलीलीटर के साथ मिश्रण (धारा6)।
  5. दो पूर्व लेबल microtiter प्लेट (चित्रा 1), अच्छी तरह से प्रति एक मिलीलीटर में 1x पीबीएस (7.4 पीएच), नियंत्रण, और सह संस्कृति पिपेट। 0 डी माप (CFU मायने रखता है, पानी पीएएम (धारा 8), काई सेल आकृति विज्ञान का सूक्ष्म अवलोकन, और फ्लो के लिए काई सेल नियतन) बनाने के लिए शेष नियंत्रण और सह संस्कृतियों के 3 मिलीलीटर का प्रयोग करें।
  6. 0 डी माप (धारा 8) ले जाया गया के रूप में एक ही समय में हमेशा 10 घ के लिए एक दिन में एक बार काई नियंत्रण और सह संस्कृति के लिए पानी-पीएएम रीडिंग ले, और।

रुचि के 11 अन्य मानकों

  1. बैक्टीरियल CFU एकाग्रता का निर्धारण: बाँझ 1x पीबीएस (या समान) में जीवाणु नियंत्रण और सह संस्कृति के एक धारावाहिक कमजोर पड़ने प्रदर्शन, तो 1.5% अगर (या समान) के साथ पूरक समुद्री शोरबा 2216 पर थाली ड्रॉप और बढ़ने कि CFU की संख्या का निरीक्षण प्रत्येक अच्छी तरह से 18 के लिए जीवाणु CFU / एमएल निर्धारित करने के लिए।
  2. काई सेल एकाग्रता का मूल्यांकन करने के लिए: काई के नियंत्रण और सह तय कर लोglutaraldehyde के एक 0.15% अंतिम एकाग्रता के साथ संस्कृति। -80 डिग्री सेल्सियस पर 10 तरल नाइट्रोजन में अंधेरा है, तो फ्लैश फ्रीज में न्यूनतम, और दुकान के लिए सेते हैं। प्रक्रिया एक प्रवाह कोशिकामापी (FACS Calibur या समान) पर सभी नमूनों शैवाल कोशिकाओं की गिनती करने के लिए।
  3. काई संस्कृतियों और माइक्रोस्कोपी (यानी, प्रकाश माइक्रोस्कोपी, epifluorescence, या इसी तरह) का उपयोग बैक्टीरियल-काई के सह संस्कृति: काई सेल आकृति विज्ञान का निरीक्षण करें।

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Representative Results

जल-पीएएम fluorometry रीडिंग।

जल-पल्स आयाम संग्राहक (पीएएम) fluorometry प्रतिदीप्ति (क्लोरोफिल सामग्री के लिए एक प्रॉक्सी) और काई संस्कृतियों का संश्लेषक उपज (PSII स्वास्थ्य) निर्धारित करने के लिए एक त्वरित और कारगर तरीका है। पीएएम WinControl सॉफ्टवेयर के लिए कच्चे डेटा मूल्यों का एक स्प्रेडशीट (निम्नलिखित अंधेरे अनुकूलित काई के नमूने के लिए बुनियादी मानकों हैं) उत्पन्न करता है:

काले अनुकूलित कोशिकाओं के एफ 0 = प्रतिदीप्ति

एफ एम = अधिकतम प्रतिदीप्ति प्रकाश उत्सर्जक डायोड saturating के बाद (एलईडी) नाड़ी

एक अंधेरे अनुकूलित नमूना 19 एफ / वी एफ एम = (एफ एम एफ 0) / एफ एम = संभावित क्वांटम उपज

पीएएम fluorometry कई का उपयोग करता है और अल का प्रकाशतंत्र और स्वास्थ्य के बारे में जानकारी का एक बहुत कुछ दे सकते हैंGAE। इसके अलावा, प्रकाश अनुकूलित नमूनों का परीक्षण जब महत्वपूर्ण हैं कि अन्य मानकों रहे हैं। आगे इन पढ़ने के लिए इन समीक्षाओं 13,16,20-23 में विस्तार से चर्चा कर रहे हैं। ये आंकड़े प्रारंभिक काई प्रतिदीप्ति के रेखांकन (एफ 0), अधिकतम काई प्रतिदीप्ति (एफ एम), और संभावित क्वांटम उपज (; आंकड़े 2 और 3 एफ वी / एफ एम) उत्पन्न करने के लिए एक स्प्रेडशीट या रेखांकन सॉफ्टवेयर को हस्तांतरित किया जा सकता है । काई प्रतिदीप्ति और एफ वी / एफ एम यह करने के लिए अकेले (नियंत्रण) बड़े हो alga की तुलना द्वारा जीवाणु से प्रभावित हैं कैसे चित्रा 3 दर्शाती में रेखांकन 10 दिन की सह संस्कृति प्रयोग भर सह संस्कृति में जीवाणु के साथ विकसित किया जा रहा (चित्रा -3 सी)। इस उदाहरण में, एक दो नमूना टी परीक्षण सांख्यिकीय प्रत्येक दिन पर दो उपचार के बीच मापदंडों तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। इसी तरह, प्रयोगों के लिए, जिसमें दो से अधिक उपचार एक एनोवा सका मौजूद हैं,इस्तेमाल किया गया। Saturating प्राथमिक PSII इलेक्ट्रॉन स्वीकर्ता क्यूए पूरी तरह से कम हो जाता है और PSII प्रतिक्रिया केंद्र P680 से किसी भी अधिक इलेक्ट्रॉनों को स्वीकार नहीं कर सकते हैं, और इस तरह के रूप में, सभी प्रतिक्रिया केन्द्रों 'कर रहे हैं, जिसका मतलब है नाड़ी एलईडी के बाद (3B चित्रा) पढ़ने एफ एम सीधे लिया जाता है 17 'बंद कर दिया। यह एक अधिकतम करने के लिए प्रतिदीप्ति उत्सर्जन लाने, प्रकाश ऊर्जा के प्रकाश रासायनिक उपयोग hinders। यह तो अधिकतम प्रतिदीप्ति (एफ एम) पढ़ने देता है। सह सुसंस्कृत जीवाणु के साथ अकेले बढ़ रही है (नियंत्रण) की तुलना में जब चित्रा -3 सी 5 डी और 10 डी के बीच PSII स्वास्थ्य में एक नाटकीय गिरावट दिखाता है। मानक त्रुटि सलाखों के एक ही माता पिता का बैक्टीरियल और काई संस्कृतियों से स्वतंत्र प्रयोगों हैं जो तीन प्रतियों से microtiter कुओं से निकाली गई है। यह repli के रूप में इस्तेमाल किया जा करने के लिए स्वतंत्र प्रयोगों की अनुमति देता है के रूप में लगातार छोटे मानक त्रुटि काई bioassays के लिए microtiter प्लेट स्वरूप की मजबूती और reproducibility की पुष्टिमोहनभोग और प्रयोग की अवधि से अधिक प्रयोगात्मक इकाई subsample की आवश्यकता समाप्त।

चित्र 2
Axenic Emiliania huxleyi (CCMP3266) के 140 डी विकास की अवस्था के चित्रा 2. प्रतिनिधि जल-पीएएम fluorometry रेखांकन। प्रारंभिक काई प्रतिदीप्ति के लिए (ए) रीडिंग (एफ 0), (ख) अधिकतम काई प्रतिदीप्ति (एफ एम), और ( ई के लिए सी) संभावित क्वांटम उपज (एफ वी / एफ एम) huxleyi काले हलकों के रूप में दिखाया जाता है। एफ 0 और एफ एम के लिए सबसे अच्छा फिट की लाइन क्रमशः सामान्य प्रवेश 3 पैरामीटर (SigmaPlot) आर = 0.94 2, 0.95 था। संभावित क्वांटम उपज (एफ वी / एफ एम) के रूप में गणना की है जो संश्लेषक स्वास्थ्य, के एक आयामरहित अभिव्यक्ति है (एफ एम - एफ 0) / एफ एम। एफ वी / एफ एम की अवस्था के लिए सबसे अच्छा फिट की लाइन एक तीन कारक बहुपद आर = 0.6 2 था। त्रुटि सलाखों तीन प्रतियों कुओं के बीच मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
Phaeobacter gallaeciensis BS107 साथ Emiliania huxleyi (CCMP3266) की एक 10 डी सह संवर्धन प्रयोग चित्रा 3. प्रतिनिधि जल-पीएएम fluorometry रेखांकन। (ए) के प्रारंभिक काई प्रतिदीप्ति (एफ 0), (ख) अधिकतम काई प्रतिदीप्ति (एफ एम) , और (सी) संभावित क्वांटम उपज (एफ वी / एफ एम) विवाद के लिए रेखांकन कर रहे हैंएल काई (खुला हलकों) और शैवाल एक जीवाणु (काले हलकों) के साथ सह सुसंस्कृत। संभावित क्वांटम उपज (एफ वी / एफ एम) के रूप में गणना की है जो संश्लेषक स्वास्थ्य, के एक आयामरहित अभिव्यक्ति है (एफ एम - एफ 0) / एफ एम। त्रुटि सलाखों तीन प्रतियों कुओं के बीच मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करते हैं। तारांकित (*) नियंत्रण और सह संस्कृति उपचार के लिए मानकों में काफी मतभेद है जिस पर दिनों अर्थ। सभी दिनों के लिए उपचार के बीच मतभेद सभी तीन मानकों में 10 घ (10 डी के लिए छोड़कर गैर महत्वपूर्ण थे - एफ 0: DF = 2.5, टी अनुपात = -15, पी = 0.0017 टी परीक्षण *, एफ एम: टी परीक्षण, DF = 2.1, टी अनुपात = -16.15, पी = 0.003 *, एफ वी / एफ एम। टी परीक्षण, लोमो -18.68, टी अनुपात = 2.0, पी = 0.0028 *) = कृपया यहाँ क्लिक करें देखने के लिए इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण।

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Discussion

एक छोटी प्रारूप में algal विकास।

एक प्रयोग के भीतर प्रतिकृति बढ़ा जा करने के लिए एक microtiter प्लेट में एक 1 मिलीलीटर संस्कृति मात्रा करने के लिए काई संस्कृतियों के miniaturization अनुमति देता है। यह शैवाल एक प्रयोग भर स्वस्थ है सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है; शैवाल के पोषण आवश्यकताओं को मिले हैं सुनिश्चित करने के लिए, विभिन्न काई मीडिया का आकलन करने के microtiter प्लेट स्वरूप का उपयोग कर एक विकास की अवस्था (चित्रा 2) प्रदर्शन करते हैं। इसके अतिरिक्त, यह प्रतिदिन चक्र (प्रकाश और अंधेरे की अवधि) और तापमान का अनुकूलन करने के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है। एक दिया शैवाल के लिए उचित अनुकूलन 26 डी के लिए पीक प्रतिदीप्ति पर स्वस्थ काई संस्कृतियों को बनाए रखने के लिए और 140 दिन (चित्रा 2) के बाद संभावित क्वांटम उपज का पता लगाने के लिए अनुमति दे सकते हैं।

बाष्पीकरणीय प्रभाव को कम।

यह एक 'बढ़त के प्रभाव' के रूप में तरल आधारित assays के बाष्पीकरणीय प्रभाव को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है ओ सामान्यतः हैbserved थाली के मध्य की ओर स्थित कुओं में से microtiter प्लेट के किनारे पर कुओं में अधिक से अधिक वाष्पीकरण है, जहां। वाष्पीकरण प्लेटों के किनारे पर देखा गया है, वहीं वाष्पीकरण की दर इस प्रारूप में बनाए रखा गया है 26 डी (चित्रा 2) में चोटी प्रतिदीप्ति के साथ, स्वस्थ काई संस्कृतियों के रूप में प्रयोगात्मक अवधि सीमा नहीं है। किसी भी संभावित 'धार' प्रभाव को कम से कम करने के लिए, 1x पीबीएस (7.4 पीएच), या अन्य बाँझ समाधान, सभी चार किनारों (कॉलम एक और एच, पंक्तियाँ एक और 6, चित्रा 1) के साथ कुओं में aliquoted है।

एक दीन का इनक्यूबेटर भीतर प्रकाश।

Microtiter प्लेटें सभी प्रतिदिन इनक्यूबेटर में एक ही अभिविन्यास होनी चाहिए। उदाहरण के लिए, एक मशीन में microtiter प्लेट के उन्मुखीकरण लंबाई प्लेटें कम धुरी के साथ रखा जाता है कि इसका मतलब है। इस उन्मुखीकरण के लिए इस्तेमाल किया जाता है, तो लंबे अक्ष बीजी साथ काई संस्कृतियों (चित्रा 1) अनुभवी कर सकते हैंकारण प्रकाश स्रोत से दूरी में बदलाव के लिए ईए मामूली प्रकाश और तापमान ढाल (प्रकाश बल्ब की रोशनी और गर्मी दोनों का एक स्रोत है)। यह उनकी तापमान रेंज के चरम पर शैवाल पर तापमान assays के प्रभावित करने के लिए मनाया गया है। नतीजतन यह उनकी अधिकतम तापमान में वृद्धि हुई सबसे शैवाल को प्रभावित करने की संभावना नहीं है। यदि आवश्यक हो तो प्रकाश के स्तर को कम करने के लिए छाया कपड़े का उपयोग करें, रोशनी से लगातार दूरी पर, बड़ी बोतलों छायांकन पैदा नहीं कर रहे हैं, उस जगह प्लेटें सुनिश्चित इस प्रकाश और तापमान ढाल के प्रभाव को कम करने और की लंबी अक्ष भर में प्रकाश की तीव्रता की जांच करने के लिए प्रतिदिन इनक्यूबेटर यह समान रूप से यात्रा करता है कि यह सुनिश्चित करने के लिए।

जल-पीएएम fluorometry के लिए काई के नमूनों की तमोनुकूलन।

आयोजित करने से पहले पानी-पीएएम यह करने के लिए महत्वपूर्ण है रीडिंग डार्क अनुकूल PSII प्रतिक्रिया केन्द्रों पूरी तरह से खुला और प्रकाश प्रेरित transthylakoidal पीएच ढाल पूरी तरह से व्यस्त है, वें रहे हैं इतना है कि काई के नमूनेअमेरिकी एफ वी / एफ एम की गणना करने से जो सच एफ ओ और एफ एम मूल्यों दे रही है। 8 घंटा प्रकाश: एक 16 के लिए, यानी प्रतिदिन चक्र (के अंधेरे चरण के बीच में पानी-पीएएम मापन के लिए परख से शैवाल नमूना) अंधेरे चक्र, एक दो घंटा नमूना सत्र टी (अंधेरे से प्रदर्शन किया जाएगा = 3 - तमोनुकूलन रह गया है जब 9 घंटा) (> 20 मिनट) 17 - = 7 - (प्रकाश चक्र (टी (प्रकाश के बीच तुलना के साथ 5 मिनट) 3) 5 घंटा) तमोनुकूलन समय कम कर देता है। शैवाल के अंधेरे रूपांतरण समय भी काई प्रजातियों, विकास की स्थिति और उसके प्राकृतिक निवास स्थान रेंज के प्रकाश की स्थिति पर निर्भर करता है अलग अलग होंगे।

जल-पीएएम fluorometry रीडिंग की संवेदनशीलता।

जल-पीएएम ऐसे समुद्र की सतह के पानी के रूप में 16 एफ, कम क्लोरोफिल के नमूनों से एफ 0 और एफ एम पता लगाने में सक्षम एक ultrasensitive fluorometer होने के लिए डिजाइन किया गया था। नतीजतन यह आदर्श एक miniatu के लिए अनुकूल हैनमूने पतला किया जा सकता है, जहां rized bioassay। इस संवेदनशीलता के कारण यह पानी-पीएएम मशीन प्रतिदीप्ति रीडिंग के एक ऊपरी सीमा (यानी, एफ, एफ 0 और / या एफ एम) नमूना पर्याप्त पतला नहीं है अगर (चित्रा 4) है कि समझने के लिए महत्वपूर्ण है। WinControl सॉफ्टवेयर के भीतर अधिकतम मान एफ 0 दबाने और एफ 0 (सीधे तमोनुकूलन के बाद) को पढ़ने के बाद ध्यान देने योग्य पहली रहे हैं। नतीजतन एफ और एफ एम अधिकतम मूल्य 4056 (चित्रा 4, नहीं। 2286) पर हैं। एफ और एफ एम की अधिकतम मानों जल-पीएएम जांच करने के लिए प्रयोग किया जाता है कि काई के माध्यम के प्रकार पर निर्भर करती है, लेकिन नमूना पर्याप्त पतला है जब तक एक ही अधिकतम मूल्य के साथ दोहराया रीडिंग होते हैं क्योंकि सीमा का पता लगाने के ऊपर नमूने आसानी से पहचाना जा सकता है । एक एक के बाद: काई के मीडिया में एक कमजोर पड़ने, कम केंद्रित नमूना फिर से काले अनुकूलित है और एफ 0 माप दोहराया गया था। एफ मूल्य एकppears सही ढंग से मापा जा सकता, लेकिन एफ एम अभी भी अधिकतम मूल्य 4056 (चित्रा 4, नहीं। 2287) पढ़ रहा है। (। 2288 चित्रा 4, नहीं): यह नमूना फिर से एक पतला था एक और एफ 0 पढ़ने लेने से पहले फिर से और अंधेरे में एक अतिरिक्त 3 मिनट के लिए अनुकूलित काई के मीडिया में एक और वैध रीडिंग प्राप्त किया गया है, तो अगले माप (एफ) लिया जाता है और एफ वी / एफ एम गणना मान्य है। एफ एम और एफ 0 की गणना में सकारात्मक असर होने की जरूरत है, जो मध्यम के साथ एक अनुपात: इस उदाहरण में, नमूना एक एक में दो बार पतला था। यह नमूने भी संश्लेषक स्वास्थ्य का एक आयामरहित अभिव्यक्ति होने के बावजूद केंद्रित कर रहे हैं, तो गलत तरीके से गणना की है एफ 0 और एफ एम का एक सीधा समारोह के रूप में, कि एफ वी / एफ एम नोट करना महत्वपूर्ण है।

चित्रा 4
एक काई नमूना सही कमजोर पड़ने को प्राप्त करने के लिए पतला किया जा रहा क्रमिक रूप से कई पानी-पीएएम fluorometry रीडिंग के चित्रा 4. WinControl प्रदर्शन। यह आंकड़ा प्रदर्शित करता है काई प्रतिदीप्ति जल-पीएएम मशीन (लाल बॉक्स) की ऊपरी सीमा तक पहुंच गया रीडिंग और उन जहां एक नमूने के लिए उपयुक्त कमजोर पड़ने (हरे बॉक्स) हासिल किया गया है। (13,16,20-22 समीक्षा देखें) इसके अलावा, यह आंकड़ा इस विधि की गणना करता है कि अन्य चर के कुछ दर्शाया गया है, लेकिन इनमें से यहां विस्तार से चर्चा नहीं कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

विषाणु दूषण।

सभी काई के प्रयोगों में, काई के नियंत्रण काई के स्वास्थ्य का एक आधार रेखा के रूप में आवश्यक हैं, तो यह है कि यह प्रयोग भर में जीवाणु संक्रमण से मुक्त रहता है कि जरूरी है। वहाँ कोई नहीं है के रूप में जीवाणु संक्रमण आसानी से होता है(जैसे एंटीबायोटिक दवाओं के रूप में) के चयन और प्रकाश संश्लेषण लगातार बैक्टीरिया विकास के लिए नई जैविक कार्बन पैदा करता है। संक्रमण से बचने के लिए दो सबसे महत्वपूर्ण तरीके से सभी समाधान microtiter प्लेट से निपटने जबकि (जैसे, काई मीडिया, 1x पीबीएस, पीएच 7.4) के प्रयोग के टी = 0 डी में और उपकरण और सड़न रोकनेवाला तकनीक बनाए रखने के लिए की बाँझपन सुनिश्चित करने के लिए है। प्रयोग सभी काई नियंत्रण कुओं से एक 20 μl विभाज्य चढ़ाना द्वारा हर समय बिंदु पर संदूषण के लिए निगरानी की जानी चाहिए। संदूषण तो काई नियंत्रण कुओं में से किसी से मनाया जाता है, तो उन पानी-पीएएम fluorometry रीडिंग का उल्लेख किया और डेटा विश्लेषण से बाहर रखा जाना चाहिए। प्रयोग की स्थापना करने के लिए इस्तेमाल एक समाधान पूरे प्रयोग के दूषित होने का कारण बनता है, तो प्रयोग और सभी दूषित अभिकर्मकों त्यागने और फिर से शुरू करते हैं। बैक्टीरियल नियंत्रण और जीवाणु-काई के सह संस्कृतियों भी दूषित हो सकता है और बैक्टीरियल CFU गिनती के लिए प्रयोग किया जाता है अगर प्लेट वैकल्पिक कॉलोनी morphol के लिए निगरानी की जानी चाहिएogies। अच्छी तरह से अच्छी तरह से microtiter प्लेट ढक्कन हटाने, लेकिन आसानी से नहीं झुकने या प्लेटों के झटकों और एक लौ एक लामिना का प्रवाह हुड में या निकट सड़न रोकनेवाला तकनीक को रोजगार से बचा जाता है जब पार संक्रमण हो सकता है।

भविष्य के अनुप्रयोगों।

इस छोटी सी मात्रा bioassay जल-पीएएम fluorometry के साथ एक microtiter प्लेट प्रारूप के संयोजन के द्वारा सूक्ष्म शैवाल के लिए एक तेजी से स्क्रीनिंग तरीका प्रदान करता है। भविष्य अनुप्रयोगों के उदाहरण विभिन्न रहे हैं, और यह व्यक्ति की कोशिकाओं पर 24 पीएएम fluorometry प्रदर्शन के रूप में एक बड़ी आबादी के भीतर PSII स्वास्थ्य की सेल सेल विभिन्नता में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है जो इमेजिंग पीएएम fluorometry, शामिल हो सकते हैं। bioassay भी माइक्रोस्कोपी के साथ संयुक्त हो और पहले से चर्चा के रूप में प्रवाह cytometry कर सकते हैं। आगे अंतर्दृष्टि प्रदान करने की क्षमता के साथ एक और संयोजन फ्लो और काई संस्कृति के उप-जनसंख्या के भीतर रूपात्मक बदलाव के स्पष्ट करने के लिए माइक्रोस्कोपी के लिए सेल धुंधला है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 cu. ft. Diurnal incubator (6012-1) Caron Corporate 112310-6012-1-11 www.caronproducts.com
Nunc EasYFlask 25 cm2, Vent/Close Cap, 7 ml working volume, 200/cs Thermo Fisher Scientific N156340 www.fishersci.ca
Multiwell TC Plates – 48-well BD Biosciences Discovery Labware 353078 www.bdbiosciences.com
P1000 Gilson The Pipetting Standard—Gilson's Pipetman Mandel Scientific Company Inc. GF-F123602 www.mandel.ca
P10mL Gilson The Pipetting Standard—Gilson's Pipetman Mandel Scientific Company Inc. GF-F161201 www.mandel.ca
Wide Orifice Tips nonsterile [100–1,250 µl] VWR International 89079-468 www.ca.vwr.com
Ultrafine Tips nonsterile [100–1,250 µl] VWR International 89079-470 www.ca.vwr.com
Finntip 10 ml [Vol: 1 - 10 ml] Thermo Fisher Scientific 9402151 www.fishersci.ca
WATER-Pulse Amplitude Modulation (Water-ED) Heinz Walz GmbH, Effeltrich, Germany EDEE0232 www.walz.com
15 mm diameter quartz glass cuvette (WATER-K) Caron Corporate www.caronproducts.com
Sodium chloride (crystalline/certified ACS), Fisher Chemical Thermo Fisher Scientific Thermo Fisher Scientific www.fishersci.ca
BD Difco Marine Broth 2216 BD Biosciences Discovery Labware BD Biosciences Discovery Labware www.bdbiosciences.com
BD Bacto Agar BD Biosciences Discovery Labware BD Biosciences Discovery Labware www.bdbiosciences.com
L1 Medium Kit, 50 L NCMA [National Center for Marine Algae and Microbiota NCMA [National Center for Marine Algae and Microbiota www.ncma.bigelow.org

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References

  1. Scarratt, M. G., Marchetti, A. Assessing microbial responses to iron enrichment in the Subarctic Northeast Pacific: Do microcosms reproduce the in situ condition? Deep Sea Res Part II Top. Stud. Oceanogr. 53 (20-22), 2182-2200 (2006).
  2. Bidle, K. D., Haramaty, L., Barcelos E Ramos, J., Falkowski, P. Viral activation and recruitment of metacaspases in the unicellular coccolithophore, Emiliania huxleyi. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (14), 6049-6054 (2007).
  3. Moore, L. R., Goericke, R., Chisholm, S. W. Comparative physiology of Synechococcus and Prochlorococcus: influence of light and temperature on growth, pigments, fluorescence and absorptive. Mar. Ecol. Prog. Ser. 116, (1995).
  4. Iglesias-Rodriguez, M. D., Halloran, P. R. Phytoplankton calcification in a high-CO2 world. Science. 320 (5874), 336-340 (2008).
  5. Chen, M., Tang, H., Ma, H., Holland, T. C., Ng, K. Y. S., Salley, S. O. Effect of nutrients on growth and lipid accumulation in the green algae Dunaliella tertiolecta. Bioresour. Technol. 102 (2), 1649-1655 (2011).
  6. Lv, J. -M., Cheng, L. -H., Xu, X. -H., Zhang, L., Chen, H. -L. Enhanced lipid production of Chlorella vulgaris by adjustment of cultivation conditions. Bioresour. Technol. 101 (17), 6797-6804 (2010).
  7. Geider, R., Graziano, L., McKay, R. M. Responses of the photosynthetic apparatus of Dunaliella tertiolecta (Chlorophyceae) to nitrogen and phosphorus limitation. Eur. J. Phycol. 33 (4), 315-332 (1998).
  8. MacIntyre, H. L., Cullen, J. J. Using Cultures to Investigate the Physiological Ecology of Microalgae. Algal Cult. Tech. , 287-326 (2005).
  9. Blaise, C., Vasseur, P. Algal microplate toxicity test. Small-scale Freshw. Toxic. Investig. Vol. 1 Toxic. Test Methods. , 137-179 (2005).
  10. Skjelbred, B., Edvardsen, B., Andersen, T. A high-throughput method for measuring growth and loss rates in microalgal cultures. J. Appl. Phycol. 24, 1589-1599 (2012).
  11. Nagai, T., Taya, K., Annoh, H., Ishihara, S. Application of a fluorometric microplate algal toxicity assay for riverine periphytic algal species. Ecotoxicol. Environ. Saf. 94, 37-44 (2013).
  12. Seyedsayamdost, M. R., Case, R. J., Kolter, R., Clardy, J. The Jekyll-and-Hyde chemistry of Phaeobacter gallaeciensis. Nat. Chem. 3 (4), 331-335 (2011).
  13. Schreiber, U., Schliwa, U., Bilger, W. Continuous recording of photochemical and non-photochemical chlorophyll fluorescence quenching with a new type of modulation fluorometer. Photosynth. Res. 10 (1-2), 51-62 (1986).
  14. Jones, R. J., Ward, S., Amri, A. Y., Hoegh-Guldber, O. Changes in quantum efficiency of photosystem II of symbiotic dinoflagellates of corals after heat stress, and of bleached corals sampled after the 1998 Great Barrier Reef mass bleaching event. Mar. Freshw. Res. 51 (345), 659-668 (1998).
  15. Beer, S., Larsson, C., Poryan, O., Axelsson, L. Photosynthetic rates of Ulva (Chlorophyta) measured by pulse amplitude modulated fluorometry. Eur. J. Phycol. 35 (1), 69-74 (2000).
  16. WATER-PAM Chlorophyll Fluorometer. Instrument Description and Information for Users. , Heinz Walz GmbH. Germany. Available at: http://www.walz.com/downloads/manuals/water-pam/waterp3e.pdf (2013).
  17. Maxwell, K., Johnson, G. M., Heers, J. Chlorophyll fluorescence--a practical guide. J. Exp. Bot. 51 (345), 659-668 (2000).
  18. Herigstad, B., Hamilton, M., Heersink, J. How to optimize the drop plate method for enumerating bacteria. J. Microbiol. Methods. 44 (2), Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11165341 121-129 (2001).
  19. Kooten, O., Snel, J. The use of chlorophyll fluorescence nomenclature in plant stress physiology. Photosynth. Res. 25 (3), Available at: http://www.springerlink.com/index/r3689k5w72782r50.pdf 147-150 (1990).
  20. Maxwell, K., Johnson, G. N. Chlorophyll fluorescence--a practical guide. J. Exp. Bot. 51 (345), 659-668 (2000).
  21. Schreiber, U. Pulse-Amplitude-Modulation (PAM) Fluorometry and Saturation Pulse Method: An Overview. Chlorophyll a Fluoresc. A Signat. Photosynth. , 279-319 (2004).
  22. Roháček, K., Barták, M. Technique of the modulated chlorophyll fluorescence: basic concepts, useful parameters, and some applications. Photosynthetica. 37 (3), 339-363 (1999).
  23. Da Silva, J. M., da Silva, A. B., Pádua, M. Modulated chlorophyll a fluorescence: a tool for teaching photosynthesis. J. Biol. Educ. 41 (4), 178-183 (2007).
  24. Vieira, S., Ribeiro, L., Jesus, B., Cartaxana, P., da Silva, J. M. Photosynthesis assessment in microphytobenthos using conventional and imaging pulse amplitude modulation fluorometry. Photochem. Photobiol. 89 (1), 97-102 (2013).

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पर्यावरण विज्ञान अंक 97 Phytoplankton सूक्ष्म शैवाल सह संस्कृति बैक्टीरिया पानी पल्स आयाम संग्राहक (जल-पीएएम) fluorometry संश्लेषक उपज क्लोरोफिल microtiter प्लेट परख उच्च throughput bioassay
एक छोटी मात्रा Bioassay जल-पल्स आयाम संग्राहक (जल-पीएएम) Fluorometry का प्रयोग बैक्टीरियल / Phytoplankton सह संस्कृति का आकलन करने के लिए
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Bramucci, A. R., Labeeuw, L.,… More

Bramucci, A. R., Labeeuw, L., Mayers, T. J., Saby, J. A., Case, R. J. A Small Volume Bioassay to Assess Bacterial/Phytoplankton Co-culture Using WATER-Pulse-Amplitude-Modulated (WATER-PAM) Fluorometry. J. Vis. Exp. (97), e52455, doi:10.3791/52455 (2015).

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