Abstract
Обычные методы экспериментальной манипуляции микроводорослей использовали большие объемы культуры (20 мл до 5 л), так что культура может быть половинной дискретизации в течение всего эксперимента 1-7. Подвыборка больших объемов может быть проблематичным по нескольким причинам: 1) он вызывает изменение общего объема и площади поверхности: объемное соотношение культуры в ходе эксперимента; 2) псевдо-репликации (то есть, повторить образцы из той же лечения колбу 8) часто используется вместо истинных дубликатов (то есть, отбора проб из повторных процедур); 3) продолжительность эксперимента ограничена общего объема; и 4) аксенными культуры или обычный бактериальный микрофлора трудно поддерживать во время длительных экспериментов, загрязнение обычно происходит во время подвыборки.
Использование микротитровальных планшетах позволяет 1 тома мл культуры, который будет использоваться для каждого повторить, причем до 48 отдельных процедур в рамках12.65 х 8.5 х 2.2 см тарелка, тем самым уменьшая экспериментальном объеме и позволяет для широкого тиражирования без подвыборки какого-либо лечения. Кроме того, этот метод может быть изменен, чтобы соответствовать различные экспериментальных форматов, включая: бактериально-водорослевые сокультурах, водорослей физиологии испытаний, и токсин скрининга 9-11. Индивидуальные скважины со водоросли, бактерии и / или сопутствующих культур можно попробовать для многочисленных лабораторных процедур, включая, но не ограничиваясь: вода-амплитудно-импульсной модуляцией (водно-PAM) флюометрия, микроскопия, бактериальный колониеобразующих единица (КОЕ) графы и проточной цитометрии. Сочетание формате микропланшетный и водно-PAM флуорометрии позволяет несколько быстрых измерений фотохимического выхода и других фотохимических параметров с низкой изменчивости между образцами, высокой воспроизводимости и избежать многих подводных камней подвыборки в бутыль или коническую колбу в течение эксперимента ,
Introduction
Фитопланктон физиология традиционно изучались в мезо-масштабных экспериментов, начиная от 20 мл в конические колбы до 5 л в бутылях 1-7. Этот экспериментальный масштаб требуется субдискретизации экспериментального контроля, как жертвуя одинаковых образцов для каждой временной точки создает неуправляемый экспериментальную установку.
Возможность увеличить количество независимых экспериментов, а с помощью того же суточный пространство инкубатора путем миниатюризации экспериментальную объем для водорослей экспериментов физиологии будет уменьшить или устранить ограничения подвыборки и псевдо-репликации из больших объемов. Формат микропланшетный была разработана для водорослей биопробы с использованием объема культуры в 1 мл для экспериментально манипулируя водорослей в различных условиях. Этот небольшой экспериментальный объем позволяет количество повторов должно быть увеличено, повышает экспериментальную воспроизводимость из-за уменьшения изменчивости между повторными образцов иэксперименты, и позволяет вести репликацию при сохранении экспериментальные элементы управления (то есть, аксенными культур водорослей) для 140 дней (рисунок 2) 12.
Этот формат микротитрационного планшета легко адаптирован для различных экспериментальных вопросов, таких как: браузер бактерии имеют симбиотические, нейтральную или патогенного взаимодействия с его водорослей хоста? Это добавление соединение, стимулирующее или токсичных для водоросли? Эти и другие вопросы могут быть решены в быстром высокой пропускной способом, используя этот новый формат 9-11.
Микропланшетном культура пластина 48 также позволяет каждому 1 мл хорошо, чтобы быть независимым экспериментальная установка, что выборка в одном временной точке. Различные параметры можно попробовать из этого объема 1 мл, включая, но не ограничиваясь ими: флуоресценции хлорофилла и фотохимических параметров с использованием воды, импульсно-модулированные по амплитуде (водно-PAM) флуорометрию (см Материалы и таблицу оборудования) 13. ВОДА-PAM флюометрия является быстрым и неинвазивным методом, который может быть использован для контроля экспериментов, выполненных с водорослей 13. Это позволяет проводить измерения продуктивности фотосинтеза и ФС здоровья из небольшого объема культуры (150 - 300 мкл культуры разводили в среде до 2 - объем 4 мл водно-PAM) 14,15. В дополнение к воде-PAM флуорометрии, эта установка может быть использована для измерения различных других параметров, включая, но не ограничиваясь ими: микроскопии для визуализации бактерии, прикрепленные к клеток водорослей и изменений в морфологии клеток водорослей; бактериальная колония блок формирования (КОЕ); и проточной цитометрии для водорослей кровяных клеток и выработки подгруппах.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Расчеты для экспериментальной установки
- Рассчитайте объем водорослей и / или бактериальных культур, необходимых для управления, которые будут необходимы в течение всего эксперимента с помощью уравнения 1:
Где у равно числу элементов управления, необходимых в день и Z равно числу дней. - Рассчитайте объем водорослей и / или бактериальных культур, необходимых для совместных культурах для эксперимента с помощью уравнения 2:
ПРИМЕЧАНИЕ: Можно заменить эксперименты "Сотрудничество культуры" с любого экрана соединения; просто настроить конечного соединения, растворителя и водорослей концентрации для подгонки экспериментальных дизайн. - Использовать уравнения 1 и 2 для расчета конечного объема в начале экспоненциальной культуры водорослей (обычно 5 дней за ~ 10 4 клеток / мл, но это должно быть определено performiнг кривую роста водорослей), необходимое для эксперимента (этот объем необходим для стадии 2.3), используя уравнение 3:
- Использование уравнений 1 и 2 для вычисления конечного объема 10 4 КОЕ / мл бактериальной культуры (или желаемой концентрации инокуляции), необходимой для эксперимента (этот объем необходим для стадии 4.2), используя уравнение 4:
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте дополнительные 10 мл с шагом 1,3 и 1,4 для учета пипетки ошибку и любые испытания, которые выполняются (например, воду-PAM, проточной цитометрии, микроскопия и т.д.) на 0 D. Увеличение этого объема, если это необходимо для подгонки экспериментальных дизайн.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для пример расчета 8-дневного эксперимента можно найти в Разделе 10. См дополнительный стол для СМИ рецептов.
2. Рост клеток водорослей для экспериментальной установки
- Изолировать или получитьактивно растет аксенными культуры водорослей.
- Асептических передачи 10% от конечного объема водорослей культуры в стерильной среде водорослей (например, L1, или аналогичный морских водорослей среднего см Материалы и оборудование таблицу), что обеспечивает в разведении 1: 9 из водорослей культуры в свежую среду. Растут разбавленный водоросль в суточном инкубатора с использованием заранее определенных условиях для роста данного вируса (например, 18 ° C с 16: 8 ч света: темно цикл обычно используется).
- Когда культура достигла раннего экспоненциальной фазе, повторное культуру водоросли в той же стерильной среде водорослей (например, L1, или аналогичный морских водорослей среда), обеспечить конечную концентрацию в разведении 1: 9, а конечный объем водорослей равна V A (шаг 1,3).
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы эти культуры являются аксенными. Проверьте все водорослевые СМИ и водорослей акций бутылки для заражения при посеве 20 мкл аликвоты на общей морской бактериальной среды (например, морскиеБульон 2216, дополненной 1,5% агара или аналогичный). - Растут культуры водорослей рано экспоненциальной фазы (~ 10 4 клеток / мл).
ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый водорослей штамм имеет уникальную кривую роста в зависимости от условий культивирования. В начале экспоненциальной фазы (~ 10 4 клеток / мл) может быть определена путем выполнения кривую роста водорослей на основе плотности клеток (т.е. с использованием проточной цитометрии или микроскопии).
3. Подготовка бактериальных клеток для прививки
- Предварительно определяют концентрацию бактерий (КОЕ / мл) и оптической плотности (OD) бактерии в стационарной фазе, делая кривую роста в выбранных бактериальных средних и условий роста (например, морской бульон 2216 при 25 ° С и 160 оборотах в минуту, или аналогичный). Используйте эту информацию для выращивания клеток (шаг 3,3), а затем разбавить клетки правильно в шаге 3.7.
- Соблюдая правила асептики, передать выделенный и свежих продуктов, выращенных бактерий колонии от 1,5% агаром (например, морской бульоне 2216 эластичнойтаджи с 1,5% агара или аналогичного морской бактериальной твердой среде) в 5 мл бактериальной жидкой среде (например, морские Отвар 2216 или аналогичный морской бактериальная среда).
- Выращивают бактерии в стационарной фазе на постоянной барабана или шейкере (~ 12 - 36 ч, в зависимости от бактерии). План эксперимента, так что бактерия достигает стационарной фазы (~ 10 8 - 10 9 КОЕ / мл) в то же время, что водорослевые клетки достигли ранней экспоненциальной фазы (~ 10 4 клеток / мл).
- С помощью пипетки, запивать любой биопленки, прикрепленный к пробирке в среду. Внесите 1 мл хорошо смешанной бактериальной культуры в стерильную 1,5 мл микропробирок. Центрифуга в течение 1 мин при 14000 х г.
- Снимите и выбросьте супернатант (бактериальный СМИ), не нарушая гранул (бактериальные клетки). Добавить 1 мл стерильной водорослей информации (например, L1 или аналогичный) для микропробирок (с таблеткой). Vortex микропробирку ресуспендировать осадок в водорослевых СМИ.
- Во-вторых стирка:повторите шаг 3,5.
ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно, чтобы вымыть бактериальных клеток цветение массовой информации в целях полного удаления всех бактерий СМИ, клеток детрита, выделяемых белков и малых молекул из клеток до посева водорослей с ними, так как это может изменить питательных веществ состав Водорослевая СМИ или вводить биологически активные молекулы на экране. - Серийно разбавить промывают бактериальных клеток в средах водорослей, до конечной концентрации, которая в 100 раз более концентрированным, чем желаемой конечной концентрации бактерий (КОЕ / мл). Сохранить микропробирки, содержащей клетки, которые были вымыты и разводили в водорослей сред для стадии 4.2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Планирование эксперимент, основанный на том, соотношение 1: 1 водорослей бактериям 0 D. Для этого нужные начальную концентрацию бактерий в эксперименте 10 4 КОЕ / мл, так что на этапе 3,7 начальные клетки должны быть серийно разводили в 10 6 КОЕ / мл.
4. Подготовка Бактерии для экспериментоваль Setup
- Подготовка 4 стерильные автоклавного стеклянные конические колбы и маркировать их: а) «контроль колбу водорослей, B) 'разбавленный бактериальной акций колбу', С) бактериальный управления колбу", г) "совместное культуральной колбы».
- Развести бактериальной суспензии от шаг 3,7 1:99 с стерильных средах водорослей до конечного объема V = B (этап 1.4). Сделать разбавление в колбе помечены разбавленной бактериальной складе (шаг 4,1).
Примечание: В предыдущем примере (этап 4.2), это разбавление 1:99 дает конечную концентрацию 10 4 КОЕ / мл. Swirl колбу для смешивания клеток. - Внесите управления V (шаг 1.1) из разбавленного бактериальной складе и положил его в бактериальной колбу управления.
- Пипетка V контроль стерильной среде водорослей в бактериальную колбу управления (это разведение 1: 1). Swirl колбу для смешивания клетки и отложите в сторону для шага 7.3.
- Внесите V совместно культуры из разбавленного бактериальной складеколбы со-культуры колбу, установите колбу в сторону для шага 6.1.
Примечание: При выполнении нескольких сопутствующих культур на той же водоросли сразу (т.е. совместное культивирование два различных бактериальных изолятов с одним контролем), необходимо повторно вычислить V совместное культивирование для каждого штамма индивидуально, а затем повторить шаг 4,5 для каждого совместного культивирования отдельно. Необходимо также повысить V вычисленное на этапе 1,3, чтобы включать как со-культуры показано в уравнении 5:
5. Подготовка водорослей экспериментальной установки
- Аккуратно перемешайте раннего экспоненциальный культуры водорослей (из шага 2.4) с кончика пипетки широким горлом, пока клетки появляются хорошо перемешивается.
- Внесите V управление с водорослей фондовом бутылку к водорослей колбу управления. Осторожно пипетки с использованием 10 мл пипетки. Затем верните водорослей акций бутылку в суточном инкубатора.
- Внесите V продROL стерильной среде водорослей с контрольной водорослей колбу (это разведение 1: 1). Вихревой смешивать колбы и место в суточном инкубатора, пока он не понадобится для шага 7.4.
6. Подготовка экспериментальной Co-культура
- Аккуратно пипетки В CO-культуру от водорослей фондовом колбу в бактериальную сокультуры колбу со стадии 4.5. Вернуться Сотрудничество культуры колбу суточного инкубатора пока нет необходимости для шага 7.5.
ПРИМЕЧАНИЕ: концентрация бактерий в бактериальной контроля должна быть равна концентрации бактерий в экспериментальной совместной культуре. Аналогичным образом, концентрация водорослей в контроле водорослей должна быть равна концентрации водорослей в экспериментальной совместной культуре. При наличии одинаковых исходных бактерий и цветения концентрации, плотность населения можно сравнить в течение всего эксперимента.
7. Настройка микротитровальные планшеты
- Разделите стерильный планшет 48-а, как показано на Рисунке 1.Добавьте выше внешних лунки, содержащие либо стерильный разбавитель или нефотосинтезирующей образцы.
Примечание: Рандомизация лунок планшета можно сделать на образцах, взятых в тот же день. Например, квадрант 1 будет попробовать в 1 г в эксперименте; лунки, которые должны быть рандомизированные являются В2 - 4 и C2 - 4. Оставьте периметр пластины, заполненной стерильного раствора, как показано на фиг.1.
. Рисунок 1. Схематическое изображение размещения образца в планшет для микротитрования 48-луночного Wells должны быть заполнены следующим образом: столбцы 1 и 6, колодцы через F ( 
) Наполнены 1 мл 1X PBS (или другого стерильного раствора / сред). Строки A и F, колодцы 2 - 8 ( 
) Заполнены 1 мл бактериальной контроля; ROWS B и E скважин 2 - 8 ( 
) Заполнены 1 мл водорослей контроля; Строки C и D, скважины 2 - 8 ( 
) Наполнены 1 мл со-культуры. Пластина разделена на 4 квадранта (А2, А5, D2, и D5), эти секторы, каждый в определенные дни отбора проб 1 - 4, то это должно быть рандомизированные в течение пластин и маркированы соответственно. В каждый день мы советуем рандомизации контроль водорослей ( 
) И совместное культивирование ( 
) скважины с помощью генератора случайных чисел. Этикетка крышку над 1х PBS и / или бактериальных лунок контроля для предотвращения затенения водорослей культур.
- Внесите 1 мл 1x раствор фосфатного буфера (PBS, рН 7,4) или другой стерильный раствор в соответствующие лунки как показано на рисунке 1. Выполните это медленно и с большой осторожностью. PBS будет чанGE ионная сила водорослей и / или со-культуральной среды, если она брызжет в другие лунки так тщательно обработать.
- Внесите 1 мл бактериальной культуры управления в скважинах помечены бактериальной контроль (рисунок 1). Вихревой бактерий колбу перед отбором каждой пластины, чтобы избежать бактериального оседание.
- Внесите 1 мл культуры водорослей управления в лунки меченых водорослей контроль, используя широкий кончик рот пипеткой (рисунок 1). Вихревой водорослей колбу так же регулярно, как бактериальной колбу. Если водоросли, как правило, либо пан, либо плавать, вихрем же регулярно, как необходимо для поддержания визуально равномерное культуры.
- Используя широкий кончик рот пипеткой, пипетки 1 мл совместного культивирования в соответствующие лунки (рис 1). Вихревой ко-культуры колбу так же регулярно, как водорослей колбу.
- Уплотнение каждой пластины с парафином и место в суточной инкубаторе при желаемой температуре и суточного цикла света (18 ° С с 16: 8 ч света: темно цикла обычно используется). Оставлятьпластины в суточном инкубатора до готовности принять PAM показания (раздел 8). Гарантировать, что все пластины ориентированы в том же направлении, чтобы обеспечить последовательное освещенности.
- Возьмем 20 мкл аликвоты из PBS, водорослей информации, водорослей и водорослей наличии контроля и падение пластины на соответствующем неселективного среды (например, морской бульон 2216, дополненной 1,5% агара) и инкубируют пластинки в 18 - 25 ° С в течение 72 ч для проверки загрязнения. Если рост появляется в любом из растворов, которые не должны содержать бактерии, то эти данные не должны быть использованы.
- Возьмите Пэм флюорометрия показания с помощью оставшейся выборки из водорослей управления и взаимодействия культур колбах для экспериментального 0 D PAM флуорометрии измерений (см шаг 8,1). Любые другие измерения 0 D также должен быть выполнен с оставшейся контроля водорослей, бактериального контроля и образцов со-культуры.
8. Принимая PAM флюорометрия чтения со склада образцов
- Ноль водно-PAMстерильными водорослей СМИ в чистой кюветы перед снятием показаний 8.
- Пипетка 300 мкл из водорослей управления или со-культуральных колбах в чистую кювету, содержащую 2,7 мл того же водорослей среды, используемой в эксперименте. Смешайте образец и разбавителя нежно с широким наконечником рот пипеткой.
- Протирки все отпечатки пальцев с внешней стороны кюветы с тканью перед установкой кювету в водно-PAM.
- Поместите кювету в воду-PAM. Обложка образца с крышкой и дайте ему приспособиться к темноте в течение 3 мин. Темные времена адаптации варьируются в зависимости от вида водорослей и должно быть определено для конкретного водоросли, используемой в эксперименте. Избегайте длительных темные времена адаптации (> 20 мин), принимая показания ВОДА-PAM в середине темного цикла водорослей суточных инкубаторов 16,17.
- После темной адаптации, нажмите F 0 кнопку. Если показания флуоресценции выше 3900, разведите образец 1: 1 в водорослей среде. Приспособиться к темноте еще в течение 3 мин и TakEA новое прочтение. Если показания F 0 или F M по-прежнему выше 3900, по-прежнему, чтобы разбавить образец 1: 1 в водорослей среде до тех пор показания F 0 и F M не ниже 3900.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь в том, чтобы учесть эти растворы при записи окончательного флуоресценции: например, если водорослей образец разбавляют 1: 9 во время первоначальной передачи от скважины до разбавления трубки, то флуоресценции водорослей чтение 500 должна быть умножена на обратную фактора разбавления (в данном случае 10) и фактическим флуоресценции трубки, то 5000. - После установки F 0, взять насыщающего импульса (сб-Pulse) Чтение каждые 90 сек, нажав кнопку сб снимать показания F M. Временной интервал между показаниями может быть отрегулирована в зависимости от штамма водорослей. Отменить образец.
- Повторите шаги 8,1 - 8,6 для остальных образцов.
9. Принимая PAM флюорометрия чтения из микротитровальные планшеты
- Этикетка6 стерильные пробирки с образцами из> 3 мл объема для скважин B2 - 4 для водорослей контроля и скважин С2 - 4 для бактериальной совместного культивирования (см схему пластины на рисунке 1).
- Аликвоты 2,7 мл стерильной среды водорослей в каждую пробирку.
- Место труб в суточном инкубатора и позволяют им привыкнуть к температуре водоросли был выращен в течение 30 мин.
- Перед снятием планшет из инкубатора обеспечить проникновение света в темные приспособиться скважин ограничивается накрывая планшету алюминиевой фольгой (или аналогичный), только снять фольгу, а активно передачи культуры от скважин до разбавления труб (шаги 9,5 - 9,7).
- Асептических смешать первый планшет и (а В2) с широким наконечником пипетки во рту, медленно пипетированием вверх и вниз.
- Получите разведения труб из инкубатора и в асептических условиях передачи 300 мкл из хорошо В2 (рисунок 1) к соответствующему пробирку с наконечником широкий рот пипеткой (это разведение 1: 9 образца в среде водорослей).
- Повторите шаги 9,5 - 9,6 для остальных скважин (B3,4 и С2 - 4).
- Обложка пробирки с образцами с алюминиевой фольгой и не возвращать их в суточном инкубатора до готовности водно-PAM.
- Выполните показания ВОДА-PAM, как описано в шагах 8,1 - 8,7. Печать планшет с парафином, прежде чем вернуться его в инкубатор.
- Повторите показания через запланированные интервалы времени в течение всего срока эксперимента. Частота и продолжительность отбора проб должен быть запланирован в начале эксперимента.
10. Образец Эксперимент
Эксперимент образец 10 день со-культуры бактерий (Phaeobacter gallaeciensis BS107) и микроводоросли (штамм Emiliania huxleyi (CCMP3266)). Она включает в себя контроль водорослей, бактерий контроль, и бактериально-водорослевые экспериментальный Сотрудничество культуры.
- Рассчитать объемы бактерий и цветения запасов, необходимых (шаги 1.1 - 1,4)
- Подготовка водорослей состава, а V A 40 мл, путем инокуляции 4 мл водорослей в 36 мл среды, и инкубировали до начала экспоненциальный рост не будет достигнут с плотности клеток ~ 10 4 клеток / мл (шаги 2,1 - 2,4).
- Подготовка бактериальной запаса колбу путем разбавления 400 мкл 10 6 КОЕ / мл бактерий, полученных в разделе 3 к V B 40 мл водорослей сред (конечная концентрация бактерий будет 10 4 КОЕ / мл).
- Передача половины (20 мл) бактериальной наличии в бактериальной колбу управления и добавить 20 мл водорослей сред, чтобы бактериальный контроль. Передача половины (20 мл) водорослей акции, чтобы водорослей колбу управления и добавить 20 мл водорослей СМИ, чтобы составить водорослей контроль (раздел 5). Перевести оставшиеся 20 мл бактериальной складе в сокультуры колбу и смешать с остальными 20 мл водорослей складе установить совместно культуры (Раздел6).
- Внесите 1x PBS (рН 7,4), органов управления и совместного культивирования в двух предварительно помечены микротитрационных планшетах (рисунок 1), 1 мл на лунку. Используйте 3 мл других элементов управления и сопутствующих культур, чтобы сделать 0 d измерений (КОЕ рассчитывает, вода-PAM (раздел 8), микроскопическую водорослей морфологии клеток и водорослей фиксации клеток для проточной цитометрии).
- Возьмите показания ВОДА-PAM для контроля водорослей и совместного культивирования раз в день в течение 10 D, и всегда в то же время, что и 0 D были проведены измерения (раздел 8).
11. Другие параметры, представляющие интерес
- Определить бактерий КОЕ концентрации: выполнить серийное разведение бактериальной управления и взаимодействия культуры в стерильной 1X PBS (или аналогичный), то падение пластину на морской бульоне 2216 с добавлением 1,5% агара (или аналогичный) и наблюдать количество КОЕ, которые растут Для определения бактериальных КОЕ / мл для каждой лунке 18.
- Для оценки концентрации водорослей клеток: исправить водорослей контроль и сотрудничествуКультура с 0,15% конечной концентрации глутарового альдегида. Выдержите в течение 10 мин в темноте, то флэш-заморозить в жидком азоте, и хранить при температуре -80 ° C. Процесс все образцы на поток цитометр (FACS Calibur или аналогичный) для подсчета клеток водорослей.
- Соблюдайте водорослей морфологии клеток: водорослей культур и бактериально-водорослевые сотрудничество культуры с помощью микроскопа (т.е. световая микроскопия, эпифлуоресцентной или подобное).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Показания флюорометрия ВОДА-PAM.
ВОДА-амплитудно-импульсной модуляцией (PAM) флюометрия является быстрым и эффективным методом для определения флуоресценции (прокси для содержания хлорофилла) и фотосинтетический выход (ФС II здоровью) водорослей культур. Программное обеспечение PAM WinControl генерирует таблицу значений исходные данные для (Ниже приведены основные параметры для темных адаптированы образцов водорослей):
F 0 = флуоресценции адаптируются к темноте клеток
F м = максимальная флуоресценция после насыщения светоизлучающих диодов (LED) импульса
F v / F м = (F м -F 0) / F м = потенциал квантовый выход из темного адаптированы образца 19
PAM флюометрия имеет множество применений и может дать много информации о фотосистемы и здоровье альGAE. Кроме того, существуют и другие параметры, которые имеют важное значение при проверке света приспособлен образцы. Для дальнейшего чтения они подробно обсуждаются в этих обзорах 13,16,20-23. Эти данные могут быть переданы в электронную таблицу или графический программного обеспечения для создания графики начальной флуоресценции водорослей (F 0), максимальное водорослей флуоресценции (F м), а потенциал квантовый выход (F V / F м; фиг.2 и 3) , Графики на рисунке 3 изображают как водорослей флуоресценции и F v / F м находятся под влиянием бактерий путем сравнения водоросль, выращенного в одиночку (ДУ) для него выращивается с бактерией в совместной культуре в течение 10-дневного эксперимента сокультуры (фиг.3С). В этом примере, т-тест двух образцов был использован для сравнения параметров статистически между двумя лечения на каждый день. Аналогичным образом, в экспериментах, в которых более чем две процедуры присутствуют, дисперсионный анализ могбыть использованы. F м чтении (3В) берется непосредственно после насыщающего LED импульс, что означает, первичный PSII акцептором электронов QA полностью сводится и не может принимать какие-либо больше электронов от ФС реакционного центра Р680, и, таким образом, все реакции центры ' закрытая "17. Это препятствует фотохимический использование световой энергии, в результате чего излучение флуоресценции до максимума. Это затем дает максимума флуоресценции (F M) чтение. 3С иллюстрирует резкое снижение ФС здоровья между 5 г и 10 г при совместном культивировании с бактерией по сравнению с растущей в одиночку (контроль). Стандартные планки погрешностей получены из трех параллельных микротитратора, которые являются независимыми эксперименты из тех же родительских бактериальных и водорослевых культур. Последовательно маленький стандартная ошибка подтверждает надежность и воспроизводимость формате микротитрационных планшетов для водорослей биопроб, так как позволяет независимых экспериментов, которые будут использоваться в качестве RepliКейтс и исключает необходимость подвыборки Экспериментальная установка по продолжительности эксперимента.
Рисунок 2. Представитель ВОДА-PAM флюорометрия графики 140 г роста кривой аксенными Emiliania huxleyi (CCMP3266). (A) Литература для начальной флуоресценции водорослей (F 0), (B) максимальное водорослей флуоресценции (F м), и ( C) потенциал квантовый выход (F v / F м) для E. huxleyi показаны черными кругами. Линия наилучшего соответствия для F 0 и F м было нормально журнала 3 параметров (Sigmaplot) R 2 = 0,94, 0,95 соответственно. Потенциал квантовый выход (F v / F т) безразмерный выражение фотосинтеза здоровья, которая рассчитывается как (F M - F 0) / F м, Линия наилучшего соответствия для F V / F м кривая 3 фактора полином R 2 = 0,6. Усы представляют стандартную ошибку между трех лунок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 3. Представитель ВОДА-PAM флюорометрия графики 10 г сокультивирования эксперимента Emiliania huxleyi (CCMP3266) с Phaeobacter gallaeciensis BS107. (A) начальная водорослей флуоресценции (F 0), (B) максимальное флуоресценции водорослей (F м) и (C) потенциал квантовый выход (F v / F м) выведена по Controл водорослей (светлые кружки) и водоросли совместно культивировали с бактерией (черные кружки). Потенциал квантовый выход (F v / F т) безразмерный выражение фотосинтеза здоровья, которая рассчитывается как (F M - F 0) / F м. Столбики ошибок обозначают стандартное отклонение между трех лунок. Звездочка (*) обозначает дни, в которые параметры для управления и совместного культивирования лечения отличались значительно. Различия между группами для всех дней были статистически не значимая для 10 г во всех трех параметров (10 г исключением - F 0: т-тест, DF = 2,5, т-коэффициент = -15, р = 0,0017 *, F м: Т- тест, DF = 2,1, т-коэффициент = -16.15, р = 0,003 *; F v / F м:. т-тест, DF = -18,68, трет-отношение = 2,0, р = 0,0028 *) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть Более крупная версия этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Рост водорослей в миниатюрном формате.
Миниатюризация водорослей культур объема культуры в 1 мл в микротитрационного планшета позволяет репликации в эксперименте должна быть увеличена. Важно, чтобы водоросль здоровым в течение эксперимента; выполнить кривую роста (рис 2), используя формат планшет для оценки различных водорослей СМИ, чтобы обеспечить потребности в питании водоросли будут выполнены. Кроме того, это может быть важно для оптимизации суточного цикла (светлые и темные периоды) и температуры. Правильное оптимизация для данного водоросли могут позволить для поддержания здорового культуры водорослей на пике флуоресценции для 26 г и по выявлению потенциальной квантовый выход после 140 дней (рисунок 2).
Минимизация испарений эффекты.
Важно, чтобы свести к минимуму воздействие испарений анализов на основе жидких как "краевого эффекта" обычно Observed, где есть больше испарения в скважинах на краю микротитрационного планшета, чем в скважинах, расположенных ближе к середине пластины. В то время как испарение наблюдалось на краю тарелки, скорость испарения не ограничивает экспериментальную длительность, здоровых культур водорослей, пик флуоресценции при 26 г была сохранена в этом формате (рисунок 2). Чтобы свести к минимуму любые потенциальные «краевой эффект», 1x PBS (рН 7,4), или другой стерильный раствор, аликвоты в лунки вдоль всех четырех краев (столбцы А и Н, строки 1 и 6, Рисунок 1).
Освещение в суточном инкубатора.
Планшеты для микротитрования все должны иметь одинаковую ориентацию в суточном инкубатора. Например, в продольном направлении ориентации микротитрационных планшетах в термостате означает, что пластины расположены вдоль короткой оси. Если используется эта ориентация, водорослевые культуры вдоль длинной оси BG (Рисунок 1), может experiencEA небольшой свет и градиент температуры из-за изменения расстояния от источника света (лампочка источником как свет и тепло). Это наблюдалось влиять температуры пробы водорослей в крайности их температурного диапазона. Следовательно, это вряд ли повлияет на большинство водорослей, выращенных при их оптимальной температуре. Чтобы свести к минимуму влияние этого света и температурного градиента убедитесь, что крупные бутылки не создает теней, место пластины на сопоставимом расстоянии от огней, используйте оттенок ткани, чтобы уменьшить уровень освещенности при необходимости и проверьте интенсивность света через длинной оси Суточный инкубатор для того, чтобы он проходит равномерно.
Адаптация к темноте водорослей образцов водно-PAM флуорометрии.
Перед проведением ВОДА-PAM чтений важно, чтобы приспособиться к темноте водорослей образцы так, что ФС II реакции центров полностью открыты, и свет, вызванной transthylakoidal градиента рН полностью рассеиваться, гонам дает истинную Ф О и М значения F, из которых для расчета F V / F м. Отбор проб водоросль из анализа для измерения ВОДА-PAM в середине темной фазы суточного цикла (т.е., в течение 16: 8 ч свет: темнота цикла, сеанс выборки 2 ч будет выполнена из Т (темно) = 3 - 5 ч) делает темные время на адаптацию короче (3 - 5 мин) по сравнению с серединой световом цикле (T (света) = 7 - 9 часов), когда адаптация к темноте длиннее (> 20 мин) 17. Темное время адаптации водоросли также будет варьироваться в зависимости от видов водорослей, условий роста и легких условий его естественного ареала обитания.
Чувствительность показаний флюорометрия ВОДА-PAM.
ВОДА-PAM был разработан, чтобы быть сверхчувствительные флуорометр способен обнаруживать F, F 0 и F м от низких образцов хлорофилла, такие как поверхности океана воды 16. Следовательно, идеально подходит для miniatuавторизованного биоанализ, где образцы могут быть разведены. Из-за этой чувствительности важно понимать, что ВОДА-PAM машина имеет верхний предел показаний флуоресценции (то есть, F, F 0 и / или F м), если образец не достаточно разбавляют (рисунок 4). В программном обеспечении WinControl максимальные значения первым заметным после нажатия F 0 и чтение F 0 (непосредственно после адаптации к темноте). Следовательно F и F м находятся на максимальном значении 4056 (рис 4, вып. 2286). Максимальные значения F и F м в зависимости от типа водорослей среде, которая используется для калибровки водно-PAM, но образцы выше предела обнаружения могут быть легко идентифицированы, поскольку повторные показания с тем же максимальным значением произойти, пока образец не является достаточно разбавляют , После разведении 1: 1 в водорослей сред, менее концентрированный образец темно-адаптированы снова и измерение F 0 повторяли. F значениеppears быть правильно измерить, но F м все еще читает максимальное значение 4056 (рисунок 4, нет. 2287). Этот образец снова разводили 1: (рис. 4, ни 2288) 1, в средствах массовой информации водорослей снова и темно-адаптированных еще в течение 3 мин перед тем, другой F 0 чтение и были получены достоверные данные, так что следующее измерение (F), принимается и F V / F м Расчет действует. В этом примере, образец разбавляют в два раза в соотношении 1: 1 со средой, которая должна быть учтена при расчете F M и F 0. Важно отметить, что F V / F м, как прямой функции F 0 и F м, неправильно рассчитан, если образцы слишком концентрируют несмотря на то, безразмерная выражение фотосинтеза здоровья.
Рисунок 4. WinControl дисплей нескольких чтениях ВОДА-PAM флюорометрия Ан водорослей образце последовательно разбавляют до достижения правильного разведения. Эта цифра показывает водорослей показания флуоресценции достижении верхнего предела ВОДА-PAM машины (красное поле), и те, где соответствующего разведения образца была достигнута (зеленый флажок). Кроме того, эта цифра показывает некоторые из других переменных, что этот метод вычисляет, но они не обсуждаются здесь подробно (см отзывы 13,16,20-22). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Бактериального загрязнения.
Во всех водорослей экспериментов, водорослей управления необходимы в качестве основы водорослей здоровья, поэтому крайне важно, что он остается свободным бактериального загрязнения в течение всего эксперимента. Бактериальное загрязнение не происходит легко, как нетвыбор (например, антибиотиков) и фотосинтеза постоянно производит новые органического углерода для роста бактерий. Два наиболее важных способов, чтобы избежать загрязнения является обеспечение стерильности всех решений (например, водорослей СМИ, 1x PBS, pH 7,4) и оборудования при Т = 0 D эксперимента и поддерживать асептики при работе с микротитрационных планшетов. Эксперимент следует контролировать на загрязнение в каждый момент времени путем посева 20 мкл аликвоты от всех водорослей скважин управления. Если загрязнение наблюдается в любом из водорослей скважин управления, то эти показания флуорометрии ВОДА-PAM Следует отметить и исключены из анализа данных. Если раствор, используемый для настройки эксперимент вызывает весь эксперимент быть загрязнены, то отказаться от эксперимента и все загрязненные реагенты и начать все заново. Бактериальные управления и бактериально-водорослевые сокультурах также может стать загрязненной и агар плиты, используемые для бактериальных КОЕ пунктам должны быть проверены для альтернативной колонии morpholлогии. Хорошо к хорошо перекрестное загрязнение может произойти при удалении крышки микротитрационных пластин, но легко избежать, не наклоняя или встряхивания пластин и с использованием асептической техники в ламинарном боксе или вблизи пламени.
Будущих приложений.
Этот небольшой объем биоанализ обеспечивает быстрый метод скрининга для микроводорослей путем объединения формат микротитрационного планшета с водой-PAM флуорометрии. Примеры будущих приложений различны, и может включать изображений PAM флуорометрию, который дает представление о вариации клеток клеток ФС охраны здоровья населения, как это выполняет PAM флуорометрию на отдельных клеток 24. Биологический анализ также может быть объединена с микроскопии и проточной цитометрии, как описано выше. Другая комбинация с потенциалом, чтобы обеспечить дальнейшее понимание является окрашивание клеток для проточной цитометрии и микроскопии для выяснения морфологические изменения в субпопуляций водорослей культуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cu. ft. Diurnal incubator (6012-1) | Caron Corporate | 112310-6012-1-11 | www.caronproducts.com |
| Nunc EasYFlask 25 cm2, Vent/Close Cap, 7 ml working volume, 200/cs | Thermo Fisher Scientific | N156340 | www.fishersci.ca |
| Multiwell TC Plates – 48-well | BD Biosciences Discovery Labware | 353078 | www.bdbiosciences.com |
| P1000 Gilson The Pipetting Standard—Gilson's Pipetman | Mandel Scientific Company Inc. | GF-F123602 | www.mandel.ca |
| P10mL Gilson The Pipetting Standard—Gilson's Pipetman | Mandel Scientific Company Inc. | GF-F161201 | www.mandel.ca |
| Wide Orifice Tips nonsterile [100–1,250 µl] | VWR International | 89079-468 | www.ca.vwr.com |
| Ultrafine Tips nonsterile [100–1,250 µl] | VWR International | 89079-470 | www.ca.vwr.com |
| Finntip 10 ml [Vol: 1 - 10 ml] | Thermo Fisher Scientific | 9402151 | www.fishersci.ca |
| WATER-Pulse Amplitude Modulation (Water-ED) | Heinz Walz GmbH, Effeltrich, Germany | EDEE0232 | www.walz.com |
| 15 mm diameter quartz glass cuvette (WATER-K) | Caron Corporate | www.caronproducts.com | |
| Sodium chloride (crystalline/certified ACS), Fisher Chemical | Thermo Fisher Scientific | Thermo Fisher Scientific | www.fishersci.ca |
| BD Difco Marine Broth 2216 | BD Biosciences Discovery Labware | BD Biosciences Discovery Labware | www.bdbiosciences.com |
| BD Bacto Agar | BD Biosciences Discovery Labware | BD Biosciences Discovery Labware | www.bdbiosciences.com |
| L1 Medium Kit, 50 L | NCMA [National Center for Marine Algae and Microbiota | NCMA [National Center for Marine Algae and Microbiota | www.ncma.bigelow.org |
References
- Scarratt, M. G., Marchetti, A. Assessing microbial responses to iron enrichment in the Subarctic Northeast Pacific: Do microcosms reproduce the in situ condition? Deep Sea Res Part II Top. Stud. Oceanogr. 53 (20-22), 2182-2200 (2006).
- Bidle, K. D., Haramaty, L., Barcelos E Ramos, J., Falkowski, P. Viral activation and recruitment of metacaspases in the unicellular coccolithophore, Emiliania huxleyi. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (14), 6049-6054 (2007).
- Moore, L. R., Goericke, R., Chisholm, S. W. Comparative physiology of Synechococcus and Prochlorococcus: influence of light and temperature on growth, pigments, fluorescence and absorptive. Mar. Ecol. Prog. Ser. 116, (1995).
- Iglesias-Rodriguez, M. D., Halloran, P. R. Phytoplankton calcification in a high-CO2 world. Science. 320 (5874), 336-340 (2008).
- Chen, M., Tang, H., Ma, H., Holland, T. C., Ng, K. Y. S., Salley, S. O. Effect of nutrients on growth and lipid accumulation in the green algae Dunaliella tertiolecta. Bioresour. Technol. 102 (2), 1649-1655 (2011).
- Lv, J. -M., Cheng, L. -H., Xu, X. -H., Zhang, L., Chen, H. -L. Enhanced lipid production of Chlorella vulgaris by adjustment of cultivation conditions. Bioresour. Technol. 101 (17), 6797-6804 (2010).
- Geider, R., Graziano, L., McKay, R. M. Responses of the photosynthetic apparatus of Dunaliella tertiolecta (Chlorophyceae) to nitrogen and phosphorus limitation. Eur. J. Phycol. 33 (4), 315-332 (1998).
- MacIntyre, H. L., Cullen, J. J. Using Cultures to Investigate the Physiological Ecology of Microalgae. Algal Cult. Tech. , 287-326 (2005).
- Blaise, C., Vasseur, P. Algal microplate toxicity test. Small-scale Freshw. Toxic. Investig. Vol. 1 Toxic. Test Methods. , 137-179 (2005).
- Skjelbred, B., Edvardsen, B., Andersen, T. A high-throughput method for measuring growth and loss rates in microalgal cultures. J. Appl. Phycol. 24, 1589-1599 (2012).
- Nagai, T., Taya, K., Annoh, H., Ishihara, S. Application of a fluorometric microplate algal toxicity assay for riverine periphytic algal species. Ecotoxicol. Environ. Saf. 94, 37-44 (2013).
- Seyedsayamdost, M. R., Case, R. J., Kolter, R., Clardy, J. The Jekyll-and-Hyde chemistry of Phaeobacter gallaeciensis. Nat. Chem. 3 (4), 331-335 (2011).
- Schreiber, U., Schliwa, U., Bilger, W. Continuous recording of photochemical and non-photochemical chlorophyll fluorescence quenching with a new type of modulation fluorometer. Photosynth. Res. 10 (1-2), 51-62 (1986).
- Jones, R. J., Ward, S., Amri, A. Y., Hoegh-Guldber, O. Changes in quantum efficiency of photosystem II of symbiotic dinoflagellates of corals after heat stress, and of bleached corals sampled after the 1998 Great Barrier Reef mass bleaching event. Mar. Freshw. Res. 51 (345), 659-668 (1998).
- Beer, S., Larsson, C., Poryan, O., Axelsson, L. Photosynthetic rates of Ulva (Chlorophyta) measured by pulse amplitude modulated fluorometry. Eur. J. Phycol. 35 (1), 69-74 (2000).
- WATER-PAM Chlorophyll Fluorometer. Instrument Description and Information for Users. , Heinz Walz GmbH. Germany. Available at: http://www.walz.com/downloads/manuals/water-pam/waterp3e.pdf (2013).
- Maxwell, K., Johnson, G. M., Heers, J. Chlorophyll fluorescence--a practical guide. J. Exp. Bot. 51 (345), 659-668 (2000).
- Herigstad, B., Hamilton, M., Heersink, J. How to optimize the drop plate method for enumerating bacteria. J. Microbiol. Methods. 44 (2), Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11165341 121-129 (2001).
- Kooten, O., Snel, J. The use of chlorophyll fluorescence nomenclature in plant stress physiology. Photosynth. Res. 25 (3), Available at: http://www.springerlink.com/index/r3689k5w72782r50.pdf 147-150 (1990).
- Maxwell, K., Johnson, G. N. Chlorophyll fluorescence--a practical guide. J. Exp. Bot. 51 (345), 659-668 (2000).
- Schreiber, U. Pulse-Amplitude-Modulation (PAM) Fluorometry and Saturation Pulse Method: An Overview. Chlorophyll a Fluoresc. A Signat. Photosynth. , 279-319 (2004).
- Roháček, K., Barták, M. Technique of the modulated chlorophyll fluorescence: basic concepts, useful parameters, and some applications. Photosynthetica. 37 (3), 339-363 (1999).
- Da Silva, J. M., da Silva, A. B., Pádua, M. Modulated chlorophyll a fluorescence: a tool for teaching photosynthesis. J. Biol. Educ. 41 (4), 178-183 (2007).
- Vieira, S., Ribeiro, L., Jesus, B., Cartaxana, P., da Silva, J. M. Photosynthesis assessment in microphytobenthos using conventional and imaging pulse amplitude modulation fluorometry. Photochem. Photobiol. 89 (1), 97-102 (2013).
