Målet med denne fremgangsmåter papir er å beskrive bruken av et mikrofluidsystem for utvikling av multi-arter biofilmer som inneholder arter vanligvis identifisert i human supragingival dental plakk. Metoder for å beskrive biofilm arkitektur, biofilm levedyktighet, og en tilnærming til å høste biofilm for kulturavhengig eller kulturuavhengig analyser er uthevet.
Det er få høy gjennomstrømming in vitro-systemer som letter utviklingen av flerbestands biofilmer som inneholder mange arter som vanligvis oppdages innenfor in vivo muntlige biofilm. Videre er et system som bruker naturlig menneskelig spytt som næringskilde, i stedet for kunstige medier, særlig ønskelig for å støtte uttrykket av cellulære og biofilmspesifikke egenskaper som etterligner in vivo lokalsamfunn. Vi beskriver en fremgangsmåte for utvikling av multi-art orale biofilmer som er sammenlignbare med hensyn til sammensetning art, å supragingival dental plakk, under betingelser som ligner på den menneskelige munnhulen. Konkret vil dette metoder artikkelen beskriver hvordan en kommersielt tilgjengelig microfluidic system kan tilpasses til rette for utvikling av flerbestands muntlige biofilmer avledet fra og vokst innenfor samlet spytt. Videre kan en beskrivelse av hvordan systemet brukes i forbindelse med en confocal laser scanning mikroskop for å generere 3D-biofilm rekonstruksjoner for arkitektoniske og levedyktighet analyser vil bli presentert. Gitt den brede mangfold av mikroorganismer som vokser innenfor biofilmer i microfluidic system (inkludert Streptococcus, Neisseria, Veillonella, Gemella, og Porphyromonas), vil en protokoll også bli presentert som beskriver hvordan du høste biofilmceller for ytterligere subkultur eller DNA-ekstraksjon og analyse. Grensene til både microfluidic biofilm system og dagens state-of-the-art dataanalyser vil bli behandlet. Til syvende og sist, er det for seg at denne artikkelen vil gi en baseline teknikk som vil forbedre studie av oral biofilm og hjelp i utviklingen av flere teknologier som kan integreres med microfluidic plattform.
Biofilmer er arkitektonisk komplekse samfunn av bakterier som aggregeres på overflater 1. Disse samfunnene typisk inneholde mange arter som samhandler med hverandre innenfor biofilm to. Muntlige biofilmer, den mest visuelt iøynefallende være plakk, er et vedvarende problem hos mennesker og deres ukontrollerte utviklingsresultater i generering av taksonomisk diverse flerartssamfunn tre. Komponent bakterier av disse ulike samfunnene kan være opptil 1000 ganger mer motstandsdyktig mot antibiotika enn sine frittflytende (planktoniske) kolleger 4-6. Unnlatelse av å behandle disse muntlige biofilmsamfunn, noe som kan føre til karies og periodontal sykdom, har resultert i en betydelig offentlig helsebelastning: over 500 millioner besøk til tannlegen kontoret per år i USA, og en ca $ 108 000 000 000 for å behandle eller forebygge periodontal sykdom og tannråte 7.
innhold ">" Mens mange mikrobiologer argumentere studere mikrobiell oppførsel under naturlige forhold, noen av dem gjøre det. Dette er fordi deres moral for å overvinne vanskelighetene er stadig tappet av den attraktive enkel å jobbe med laboratoriekulturer. "-Smith 8.I dag, er oral biofilm forskning utført ved hjelp av en rekke in vivo og in vitro tilnærminger, hver med sine egne fordeler og ulemper 9,10. In vitro nærmer ofte bruker modellbiofilmsystemer som er relativt enkelt å sette opp, men kan mangle klinisk / virkelige verden relevans 10,11. In vivo tilnærminger vanligvis stole på dyremodellsystemer som kan gjengi visse aspekter ved den menneskelige muntlig miljø, men igjen lider av begrensninger på grunn av forskjeller i anatomi, fysiologi, mikrobiologi og immunologi mellom dyr og mennesker 12, 13. Det bør bemerkes at orale biofilmerkan også utvikles på emaljerte overflater holdt i en stent i munn av frivillige mennesker, men denne tilnærmingen er i dag relativt kostbart og arbeidskrevende 14,15. Til syvende og sist, er nye midler eller teknologier for å forbedre munnpleie testet på mennesker under kontrollerte kliniske studier forhold 11. I dag er en ofte brukt modus operandi for å identifisere og evaluere nye orale helsetjenester agenter for å først utføre laboratoriestudier for å skjelne potensiell effekt, og deretter utføre dyreforsøk og "feltforsøk" som ansetter leger for å vurdere effekten av teknologien 9, 16,17. Dessverre, laboratoriestudier har en tendens til å stole på modellsystemer som opptar en stor plass, er teknologisk utfordrende å bruke, og inneholder ofte forenklet samfunn av ett eller høyst noen få arter å utlede potensiell virkelige verden betyr 10,18. Gitt at dental plakk biofilmer inneholde flere arter og form i en komplex flyter spytt miljøet, utvikle biofilm som inneholder ett eller noen få arter i kunstige medier vil neppe kunne gi lokalsamfunn som oppfører seg på en lignende måte som de i et realistisk scenario 10,19. For å adressere tid, kostnader, krav til opplæring, og de fattige representant natur laboratorium modellbiofilmsystemer i forhold til den virkelige verden miljø, vi har nylig utviklet en høy gjennomstrømming og miljø germane biofilm system 20 (figur 1). Systemet tilbyr bruk av mobilfrie pooled menneskelig spytt (CFS) som medium og ubehandlet sammenslått humant bakteriecellen holdig spytt (CCS) som inokulum. Unikt, kombinerer systemet også microfluidic teknologi, et konfokal laser scanning mikroskop, og kulturuavhengig bakteriell mangfold analyse-teknologi. Således er modellsystemet miljømessig germane (ved hjelp av spytt som inokulum til å vokse multiarts biofilmer ved 37 ° C i filter-sterilisert strømmerspytt) og den muntlige biofilmer inneholde arter (inkludert Streptococcus, Neisseria, Veillonella og Porphyromonas arter) i hopetall er representative for de som finnes i tidlig supragingival plakett 20.
Når de vurderer at dette arbeidet beskriver bruk av den nyutviklede modellsystemet, må spesiell oppmerksomhet gis til sammenslåing av et konfokal laser scanning mikroskop (CLSM) MicroFluidics, og kulturuavhengig mangfold analyseteknologier. Unionen av disse teknologiene ved vår forskningsgruppe var tilsiktet og ikke bare legger en høy gjennomstrømming evne til den nyutviklede modellsystemet, men tillater også spørsmål som skal stilles som ikke kunne være lett adressert før med andre systemer. For det første har CLSM distinkte fordeler i forhold til tradisjonell mikroskopi som gjør det mulig for tredimensjonal analyse av biofilmer. Ofte lite verdsatt, dette er ekstremt viktig som biofilm er heterogene viddh hensyn på artssammensetning og romlig posisjon, så vel som de fysiologiske betingelser som pålegges på forskjellige romlige steder i biofilmen 6,21. I konsert med tredimensjonal gjengivelse programvare og programvare for bildeanalyse, biofilm arkitektur, romlige relasjoner mellom komponent arter, og omfanget av antimikrobiell drap kan analyseres 22-24. Slike evner er ikke mulig å bruke standard overført lys eller epifluorescence mikroskopi. Deretter har MicroFluidics fått særlig oppmerksomhet innen mikrobiologi som gjør det mulig å studere biofilmer under nøye kontrollerte betingelser (strømning, temperatur, pH, etc.) og krever bare små volumer av væske 25-27. Som et utgangspunkt for sammenligning, vokser en oral biofilm i humant spytt i en strømningscelle modell system (et system som uten tvil betraktes som bærebjelken modell for mange orale biofilm studier) i 20 timer ved en tilsvarende strømningshastighet og skjærkraft som det som ble oppnåddi et mikrofluidsystem krever minst 200 ml, i motsetning til 800 ul i mikrofluid enheten 28-31. Dermed gjør en mikrofluid modell biofilm system studiet av kvantitet begrenset materiale under definerte forhold. Endelig har Pyrosekvensering teknologi blitt optimalisert i det siste tiåret til å kreve bare små mengder av materialet for å utføre en analyse fellesskap og er tilstrekkelig allsidig til å kontrollere dybden av sekvensering for å oppnå identiteten til og med sjeldne biofilm arter. Bruk av denne teknologien, som bakteriell tag-kodet FLX amplicon Pyrosekvensering (bTEFAP), har gjort det mulig for relevante spørsmål om økologi av biofilm tas opp 32,33. Slike spørsmål yret vanskeligheter i det siste når Pyrosekvensering var ikke tilgjengelig på grunn av tid og kostnader som kreves for å skape plasmid biblioteker og de komplekse teknologiske og analytiske trinnene som kreves for å utlede data 33,34. Selvfølgelig en stor fordel med kulturuavhengig apgangsmåter, slik som Pyrosekvensering, som er den bakterielle arter som ikke kan dyrkes i isolasjon i konvensjonell laboratoriemedier (dvs. levedyktige, men ikke dyrkbare arter) kan dyrkes og identifisert i modellsystemet og deres relative overflod i fellesskap kvantifisert 35, 36 . For å legge perspektiv, så tidlig som i 1963 anslått sen Sigmund Socransky at ca. 50% av bakteriene i materialet isolert fra human oral gingival sprekken ikke kan dyrkes ved hjelp av laboratorievekstbetingelser 37.
Målet med denne fremgangsmåter papir er å beskrive tilnærming for å utvikle orale multiarts biofilmer i en kommersielt tilgjengelig mikrofluid (Bioflux) system i henhold til: (i) betingelser er representative for den menneskelige munnhulen og (ii) med en art sammensetning og mengde at kan sammenlignes med supragingival plaque. Videre bruker både freeware og kommersiell programvare, merker vi hvordan grunnleggende biofilmarkitektur tiltak kan være avledet fra CLSM data, med fokus på metoder for å kvantifisere biofilm biomasse, råhet, og levedyktighet (basert på Levende / Døde farging). Endelig er de trinnene som kreves for å høste biofilm materiale for mangfold analyse av bTEFAP beskrevet.
Dette metoder papiret fremhever de grunnleggende trinnene som kreves for å installere og kjøre en microfluidic system på en måte å gi rom for utvikling av muntlige flerbestands biofilmer avledet fra sammenslått humant spytt og dyrket i filter-sterilisert 25% samlet menneskelig spytt. Tilnærminger for å karakterisere biofilm er gitt, men det bør bli husket at disse beskrives tilnærminger er modifiserbare og flere teknologier som, for eksempel, kan flekker eller etiketter bli innført. Som en sak av et eksempel,…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker William Nance (University of Michigan) for å få hjelp i utforming av biofilm vekst protokoller og John Battista (Flyteteksturer, San Francisco, California) for å få råd om teknologiske problemstillinger knyttet til Bioflux system. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (NIH: R21DE018820 til AHR) og University of Michigan oppstart midler til AHR
SUPPLIES AND EQUIPMENT | AVAILABLE FROM COMPANY | CATALOG NUMBER |
Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 |
Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-49D |
Dithiothreitol (White Crystals or Powder/Electrophoresis), Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP172-5 |
Sorval ultracentrifuge (SS-34 compatible) | Thermoscientific | Unit-dependent |
Thermo Scientific SS-34 Rotor | Thermoscientific | 28-020 |
Thermo Scientific Type 1 Reagent Grade Deionized Water | Thermo Scientific Inc | 23-290-065 |
Nalgene Rapid-Flow Filter Units and Bottle Top Filters, PES Membrane, Sterile. | VWR | 73520-986 |
Glycerol | Thermo Fisher Scientific Inc | NC0542269 |
BioFlux microfluidic system | Fluxion | Bioflux 200 system |
Bioflux 24-channel plate | Fluxion | 910-0004 |
PBS (Gibco) | Thermo Fisher Scientific Inc | 10010023 |
LIVE/DEAD stain (Invitrogen) | Invitrogen | L7012 |
Confocal Laser Scanning Microscope | Lecia | SPE or eqivalent system |
Epifluorescence Microscope | Multiple choices | Multiple choices |
Pyrosequencing facilities | Multiple choices | Multiple choices |
Decon SaniHol 70 Ethanol Solution | Fisher Scientific | 04-355-122 |
Ultra Low Temperature Freezer -80°C | Multiple choices | Multiple choices |
Tips (20, 200, and 1000uL) | Multiple choices | Multiple choices |
Single Channel Variable Volume Pipettors (20, 200, 1000uL) | Multiple choices | Multiple choices |
SOFTWARE | ||
Bioflux dedicated software | Bioflux | |
Imaris | Bitplane | |
Leica SPE | Leica | |
ImageJ | Freeware (http://imagej.nih.gov/ij/) | |
COMSTAT/COMSTAT 2 | Freeware (http://www.comstat.dk/) |