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Bioengineering

एक उच्च throughput का प्रयोग करें doi: 10.3791/52467 Published: December 1, 2014

Summary

इस तरीके से कागज के लक्ष्य को आम तौर पर मानव supragingival दंत पट्टिका में पहचान की प्रजातियों होते हैं कि बहु प्रजातियों biofilms के विकास के लिए एक microfluidic प्रणाली के उपयोग का वर्णन करने के लिए है। तरीके biofilm वास्तुकला, biofilm व्यवहार्यता, और डाला जाता संस्कृति पर निर्भर या संस्कृति स्वतंत्र विश्लेषण के लिए फसल biofilm के लिए एक दृष्टिकोण का वर्णन करने के लिए।

Abstract

आमतौर पर इन विवो मौखिक biofilms भीतर का पता चला कई प्रजातियों होते हैं कि बहु प्रजातियों biofilms के विकास की सुविधा है, जो इन विट्रो प्रणालियों में कुछ उच्च throughput कर रहे हैं। इसके अलावा, बजाय कृत्रिम मीडिया की, पोषक तत्व स्रोत के रूप में प्राकृतिक मानव लार का उपयोग करता है कि एक प्रणाली है, इन विवो समुदायों कि नकल सेलुलर और biofilm से विशिष्ट गुणों की अभिव्यक्ति का समर्थन करने के क्रम में विशेष रूप से वांछनीय है। हम मानव मौखिक गुहा के समान शर्तों के तहत, दंत पट्टिका supragingival करने, जाति की संरचना करने के लिए सम्मान के साथ, तुलना कर रहे हैं कि बहु प्रजातियों मौखिक biofilms के विकास के लिए एक विधि का वर्णन। विशेष रूप से, इस तरीके लेख एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध microfluidic प्रणाली से निकाली गई बहु प्रजातियों मौखिक biofilms के विकास को सुविधाजनक बनाने के लिए अनुकूलित और जमा लार के भीतर उगाया जा सकता है कि कैसे का वर्णन करेंगे। इसके अलावा, कैसे प्रणाली का वर्णन के एक confoca साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता हैएल लेजर स्कैनिंग खुर्दबीन प्रस्तुत किया जाएगा वास्तु और व्यवहार्यता विश्लेषण के लिए 3-डी biofilm पुनर्निर्माण उत्पन्न करने के लिए। (स्ट्रेप्टोकोकस, नेइसेरिया, Veillonella, Gemella, और Porphyromonas सहित) microfluidic प्रणाली में biofilms के भीतर हो जाना कि सूक्ष्मजीवों की व्यापक विविधता को देखते हुए, एक प्रोटोकॉल भी आगे उपसंस्कृति या डीएनए निष्कर्षण और विश्लेषण के लिए biofilm कोशिकाओं फसल के लिए कैसे का वर्णन प्रस्तुत किया जाएगा। microfluidic biofilm प्रणाली और वर्तमान राज्य के अत्याधुनिक डेटा का विश्लेषण दोनों की सीमाओं को संबोधित किया जाएगा। अंत में, यह इस लेख मौखिक biofilms के अध्ययन में सुधार और microfluidic मंच के साथ एकीकृत किया जा सकता है कि अतिरिक्त प्रौद्योगिकियों के विकास में सहायता करेगा कि एक आधारभूत तकनीक प्रदान करेगा कि कल्पना की है।

Introduction

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Biofilms वास्तुकला सतहों एक पर एकत्रित कर रहे हैं कि बैक्टीरिया की जटिल समुदायों कर रहे हैं। इन समुदायों के लिए आम तौर पर biofilm दो में एक-दूसरे के साथ बातचीत है कि कई प्रजातियों के होते हैं। ओरल biofilms, सबसे नेत्रहीन विशिष्ट किया जा रहा दंत पट्टिका, एक मानव में लगातार समस्या और श्रेणी विभाजन के विविध बहु प्रजातियों समुदायों 3 की पीढ़ी में उनके अनियंत्रित विकास के परिणाम हैं। इन विविध समुदायों के घटक बैक्टीरिया उनके मुक्त अस्थायी (planktonic) समकक्षों 4-6 से antimicrobials के लिए प्रतिरोधी 1000 गुना तक हो सकता है। अमेरिका में प्रतिवर्ष दंत चिकित्सक कार्यालय में 500 मिलियन से अधिक का दौरा, और एक लगभग $ 108,000,000,000 के इलाज या periodontal को रोकने के लिए: दंत क्षय और periodontal रोग का कारण बन सकता है, जो इन मौखिक biofilm समुदायों का इलाज करने में विफलता, एक महत्वपूर्ण सार्वजनिक स्वास्थ्य बोझ में बदल गया है रोग और दंत क्षय 7।

कठिनाइयों पर काबू पाने के लिए उनके मनोबल लगातार प्रयोगशाला संस्कृतियों के साथ काम करने का आकर्षक आसानी। "8 -Smith द्वारा sapped है क्योंकि सामग्री"> "कई सूक्ष्म जीव विज्ञानियों प्राकृतिक परिस्थितियों में माइक्रोबियल व्यवहार का अध्ययन की वकालत करते हैं, उनमें से कुछ ऐसा करते हैं। यह वह जगह है।

वर्तमान में, मौखिक biofilm अनुसंधान में विवो की और इन विट्रो दृष्टिकोण में एक किस्म का उपयोग किया जाता है, अपने स्वयं के लाभ के साथ और प्रत्येक 9,10 नुकसान। इन विट्रो अक्सर स्थापित करने के लिए अपेक्षाकृत आसान कर रहे हैं लेकिन नैदानिक ​​की कमी हो सकती है कि मॉडल biofilm सिस्टम का उपयोग दृष्टिकोण / वास्तविक दुनिया प्रासंगिकता 10,11। में vivo दृष्टिकोण आम तौर पर मानव मौखिक पर्यावरण के कुछ पहलुओं को पुन: पेश है, लेकिन फिर से सीमाओं से ग्रस्त होने के कारण पशुओं के बीच शरीर रचना विज्ञान, शरीर विज्ञान, सूक्ष्म जीव विज्ञान और इम्यूनोलॉजी में मतभेद और 12 मनुष्य हो सकता है कि पशु मॉडल प्रणाली पर भरोसा करते हैं, 13। यह मौखिक biofilms कि ध्यान दिया जाना चाहिएयह भी मानव स्वयंसेवकों के मुंह के भीतर एक स्टेंट में आयोजित तामचीनी सतहों पर विकसित की है, लेकिन इस दृष्टिकोण वर्तमान में अपेक्षाकृत महंगी और श्रम प्रधान 14,15 किया जा सकता है। अंत में, उपन्यास एजेंट या मौखिक स्वास्थ्य सेवा में सुधार के लिए प्रौद्योगिकियों नियंत्रित नैदानिक ​​परीक्षण शर्तों 11 के तहत मानव में परीक्षण कर रहे हैं। वर्तमान में, नए मौखिक स्वास्थ्य सेवा एजेंटों की पहचान करने और मूल्यांकन के लिए एक बार इस्तेमाल किया काम करने का ढंग पहली प्रयोगशाला अध्ययन संभावित प्रभावकारिता विचार, और फिर जानवरों के अध्ययन और प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में 9 की सफलता का मूल्यांकन करने के लिए चिकित्सकों को काम पर कि "क्षेत्र परीक्षण" प्रदर्शन करने के लिए प्रदर्शन करने के लिए है, 16,17। दुर्भाग्य से, प्रयोगशाला अध्ययन के एक बड़े पदचिह्न पर कब्जा कि मॉडल प्रणाली पर भरोसा करते हैं, का उपयोग करने के लिए तकनीकी रूप से चुनौती दे रहे हैं, और अक्सर 10,18 अर्थ संभावित वास्तविक दुनिया प्राप्त करने के लिए कुछ प्रजातियों में से एक या अधिक से अधिक समुदायों सरलीकृत होते हैं। दंत पट्टिका biofilms एक compl में कई प्रजातियों और फार्म में होते हैं यह देखते हुए किपूर्व कृत्रिम मीडिया एक वास्तविक दुनिया परिदृश्य 10,19 में उन लोगों के लिए एक समान तरीके से व्यवहार करते हैं कि समुदायों को उत्पन्न करने की संभावना नहीं है में एक होते हैं कि biofilms या कुछ प्रजातियों के विकास, लार परिवेश बह। समय, लागत, प्रशिक्षण आवश्यकताओं, और वास्तविक दुनिया पर्यावरण की तुलना में प्रयोगशाला मॉडल biofilm प्रणालियों के गरीब प्रतिनिधि प्रकृति का पता करने के लिए, हमने हाल ही में एक उच्च throughput और पर्यावरण की दृष्टि से सार्थक biofilm प्रणाली 20 (चित्रा 1) विकसित की है। एक inoculum के रूप में मध्यम और इलाज जमा मानव बैक्टीरिया कोशिका युक्त लार (सीसीएस) के रूप में सेल मुक्त जमा मानव लार (सीएफएस) के उपयोग से सिस्टम को लाभ। विशिष्ट, इस प्रणाली को भी microfluidic प्रौद्योगिकी, एक लेजर confocal खुर्दबीन स्कैनिंग, और संस्कृति स्वतंत्र बैक्टीरियल विविधता विश्लेषण प्रौद्योगिकी को जोड़ती है। इस प्रकार, मॉडल प्रणाली एक inoculum 37 में बहु प्रजातियों biofilms विकसित करने के रूप में पर्यावरण की दृष्टि से सार्थक (का उपयोग कर लार है फिल्टर निष्फल बह में सी °लार) और मौखिक biofilms जल्दी supragingival पट्टिका 20 में पाए जाने वाले के abundances प्रतिनिधि में स्ट्रेप्टोकोकस, नेइसेरिया, Veillonella, और Porphyromonas प्रजातियों सहित प्रजातियों () होते हैं।

इस काम के नव विकसित मॉडल प्रणाली के उपयोग का वर्णन करता है कि जब विचार, विशेष रूप से ध्यान देने की एक लेजर confocal खुर्दबीन स्कैनिंग (CLSM) microfluidics के एकीकरण, और संस्कृति स्वतंत्र विविधता विश्लेषण प्रौद्योगिकियों को दिया जाना चाहिए। हमारे शोध समूह द्वारा इन प्रौद्योगिकियों का मिलन जानबूझकर किया गया था और न केवल नव विकसित मॉडल प्रणाली के लिए एक उच्च throughput क्षमता कहते हैं, लेकिन यह भी सवाल आसानी से अन्य प्रणालियों के साथ पहले संबोधित नहीं किया जा सकता है कि कहा जा करने की अनुमति देता है। यह biofilms के तीन आयामी विश्लेषण के लिए अनुमति देता है के रूप में सबसे पहले, CLSM पारंपरिक माइक्रोस्कोपी से अधिक अलग फायदे हैं। Biofilms विषम बुद्धि के रूप में अक्सर नाचीज, यह अत्यंत महत्वपूर्ण हैएच जाति की संरचना और स्थानिक स्थिति के लिए सम्मान के साथ-साथ शारीरिक स्थितियों biofilm 6,21 के भीतर विभिन्न स्थानिक स्थानों पर लगाया जा रहा है। तीन आयामी प्रतिपादन सॉफ्टवेयर और छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर, biofilm वास्तुकला, घटक प्रजातियों के बीच स्थानिक रिश्तों, और रोगाणुरोधी हत्या की हद के साथ संगीत कार्यक्रम में 22-24 का विश्लेषण किया जा सकता है। इस तरह की क्षमताओं मानक प्रेषित प्रकाश या epifluorescence माइक्रोस्कोपी का उपयोग संभव नहीं हैं। यह सावधानी से नियंत्रित परिस्थितियों (प्रवाह, तापमान, पीएच, आदि) के तहत biofilms के अध्ययन के लिए सक्षम बनाता है और केवल तरल 25-27 की छोटी मात्रा की आवश्यकता के रूप में आगे, microfluidics सूक्ष्म जीव विज्ञान के क्षेत्र में विशेष ध्यान हुई। उस हासिल रूप में तुलना का एक बिंदु के रूप में, एक समान प्रवाह दर और कतरनी में 20 घंटे के लिए एक प्रवाह सेल मॉडल प्रणाली (यकीनन कई मौखिक biofilm अध्ययन के लिए मुख्य आधार मॉडल माना जाता है कि एक प्रणाली) के भीतर मानव लार में एक मौखिक biofilm बढ़ रहा हैmicrofluidic युक्ति 28-31 में 800 μl के लिए विरोध के रूप में एक microfluidic प्रणाली में, कम से कम 200 मिलीलीटर की आवश्यकता है। इस प्रकार, एक microfluidic मॉडल biofilm प्रणाली परिभाषित शर्तों के तहत मात्रा सीमित सामग्री के अध्ययन के लिए सक्षम बनाता है। अंत में, pyrosequencing प्रौद्योगिकी एक समुदाय विश्लेषण करने के लिए सामग्री की ही छोटी मात्रा की आवश्यकता के लिए पिछले एक दशक में अनुकूलित और भी दुर्लभ biofilm प्रजातियों की पहचान प्राप्त करने के लिए अनुक्रमण की गहराई को नियंत्रित करने के लिए पर्याप्त रूप से बहुमुखी है किया गया है। ऐसे जीवाणु टैग इनकोडिंग FLX amplicon pyrosequencing (bTEFAP) के रूप में इस तकनीक का उपयोग करते हैं, biofilms के पारिस्थितिकी के विषय में प्रासंगिक प्रश्नों के लिए अनुमति दी गई है 32,33 संबोधित किया जाना है। इस तरह के सवालों pyrosequencing क्योंकि समय और प्लाज्मिड पुस्तकालयों और डेटा 33,34 प्राप्त करने के लिए आवश्यक जटिल तकनीकी और विश्लेषणात्मक चरणों बनाने के लिए आवश्यक लागत के लिए उपलब्ध नहीं था जब अतीत में कठिनाइयों imbued। संस्कृति स्वतंत्र एपी के साथ बेशक, एक महान लाभऐसे pyrosequencing के रूप में proaches, पारंपरिक प्रयोगशाला मीडिया (यानी व्यवहार्य लेकिन गैर कृषि योग्य प्रजाति) के भीतर अलगाव में उगाया नहीं किया जा सकता कि बैक्टीरियल प्रजातियों हो गई है और पहचान मॉडल प्रणाली के भीतर और समुदाय में उनके रिश्तेदार बहुतायत, 36 35 मात्रा निर्धारित किया जा सकता है । के रूप में जल्दी 1963 के रूप में परिप्रेक्ष्य जोड़ने के लिए, देर से सिगमंड Socransky मानव मौखिक मसूड़ों दरार से अलग सामग्री में बैक्टीरिया का लगभग 50% प्रयोगशाला विकास की स्थिति में 37 का उपयोग कर सुसंस्कृत नहीं किया जा सका है कि अनुमान है।

इस तरीके कागज के उद्देश्य के तहत एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध microfluidic (Bioflux) प्रणाली में मौखिक बहु प्रजातियों biofilms विकसित करने के लिए दृष्टिकोण का वर्णन करने के लिए है: (मैं) की स्थिति मानव मौखिक गुहा के प्रतिनिधि और (ii) एक प्रजाति संरचना और बहुतायत के साथ कि supragingival पट्टिका के बराबर है। इसके अलावा, दोनों फ्रीवेयर और वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर का उपयोग कर, हम कैसे बुनियादी biofilm पर प्रकाश डालावास्तुकला उपायों biofilm बायोमास, खुरदरापन, और व्यवहार्यता यों के लिए दृष्टिकोण पर ध्यान देने के साथ, CLSM डेटा से प्राप्त किया जा सकता है (लाइव / मृत धुंधला पर आधारित)। अंत में, bTEFAP द्वारा विविधता के विश्लेषण के लिए biofilm सामग्री फसल के लिए आवश्यक कदम वर्णित हैं।

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Protocol

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इस के साथ साथ वर्णित लार संग्रह प्रोटोकॉल मानव विषय अनुसंधान के लिए मिशिगन संस्थागत समीक्षा बोर्ड के विश्वविद्यालय द्वारा समीक्षा की गई।
नोट: इस प्रकार के मानव विषय के काम के लिए संस्थागत समीक्षा के संबंध में, पूर्व व्यवस्था और अनुमतियाँ मेजबान संस्था से हुई किया जाना चाहिए। विशेष रूप से, संस्था पर निर्भर करता है, आईआरबी या नैतिकता के अनुमोदन मानव स्वयंसेवकों से लार संग्रह आगे बढ़ने से पहले मांग की है और अनुमोदित करने की आवश्यकता हो सकती है। एक आवेदन पत्र तैयार करने के लिए एक सहायता के रूप में, एक उपयोगी एनआईएच एल्गोरिथ्म / चार्ट यहां पाया जा सकता है: http://grants1.nih.gov/grants/policy/hs/PrivateInfoOrBioSpecimensDecisionChart.pdf

एक पर्यावरण सार्थक मध्यम विकास के रूप में उपयोग के लिए जमा लार की 1. तैयारी

  1. लार दान के लिए> 5 व्यक्तियों की भर्ती। कोई व्यक्ति के लिए सुनिश्चित है, किसी भी जानकारी की पहचान मत लोवे बीमार हैं, या पिछले 3 महीने में मौखिक एंटीबायोटिक दवाओं के लिए ले लिया है, या भोजन या तरल का सेवन किया है कि अगर ए एल एस दान करने से पहले पिछले दो घंटा में, पानी के अपवाद के साथ, लार दान करेंगे।
  2. 50 मिलीलीटर की प्लास्टिक ट्यूबों में लार ले लीजिए। बर्फ पर यह ध्यान में रखते हुए एक प्लास्टिक बीकर में एकत्र लार पूल। लार में पॉलिमर आंतरिक गिलास सतहों का पालन करना होगा के रूप में शीशे का प्रयोग न करें।
  3. एक 100x स्टॉक से 2.5 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता के लिए dithiothreitol (डीटीटी) जोड़ें। (स्टॉक एकल उपयोग aliquots में पर जमे हुए है -20 सी)। बर्फ पर एक प्लास्टिक बीकर में 10 मिनट के लिए हिलाओ।
  4. बात कण को ​​दूर करने के लिए, अपकेंद्रित्र 17,500 एक्स जी पर 30 मिनट के लिए जमा लार।
  5. एक-चौथाई केंद्रित लार देने के लिए DH 2 ओ के तीन संस्करणों के साथ लार पतला।
  6. फिल्टर बाँझ 0.22 polyethersulfone (पी इ एस), कम प्रोटीन बाध्यकारी फिल्टर का उपयोग कर लार। बड़े सतह क्षेत्र के साथ फिल्टर का प्रयोग करें, या कई छोटे से क्षेत्र फिल्टर का उपयोग करें। एक में लार रखेंबर्फ पर प्लास्टिक के कंटेनर को छानने है।
  7. जमा लार पर फ्रीज -80   50 मिलीलीटर की प्लास्टिक ट्यूबों में डिग्री सेल्सियस बैक्टीरिया बढ़ने की जरूरत है जब तक। प्रत्येक प्लास्टिक ट्यूब केवल एक ही उपयोग के लिए है और प्रत्येक microfluidic अच्छी तरह से 1.2 मिलीलीटर की एक अधिकतम (1.2 मिलीलीटर एक्स 24 कुओं = 28.8 मिलीलीटर) रखती है और लार ठंड के दौरान फैलता है के रूप में अंतरिक्ष प्रत्येक ट्यूब में की जरूरत है के रूप में कोई 35 से अधिक मिलीग्राम शामिल करना चाहिए।
  8. उपयोग के लिए, कमरे के तापमान पर जमा लार पिघलना। एक बार thawed, (किसी भी अवक्षेप को दूर करने के लिए 0.22 के polyethersulfone, कम प्रोटीन बाध्यकारी फिल्टर) एक बार और अधिक फिल्टर बाँझ।

एक inoculum के रूप में उपयोग के लिए जमा लार की 2. तैयारी

  1. लार दान के लिए> 5 व्यक्तियों की भर्ती। दान करने से पहले पिछले दो घंटा में, पानी के अपवाद के साथ पिछले 3 महीने में मौखिक एंटीबायोटिक दवाओं के लिए ले लिया है, या भोजन या तरल का सेवन किया है, किसी भी पहचान की जानकारी लेने के लिए वे बीमार हैं अगर कोई व्यक्तियों लार दान करेंगे सुनिश्चित नहीं है। एसए लीजिए30 मिनट से अधिक mples।
  2. कमरे के तापमान पर 50 मिलीलीटर की प्लास्टिक ट्यूबों में लार लीजिए और कमरे के तापमान पर एक प्लास्टिक बीकर में एकत्र लार पूल।
  3. 25% ग्लिसरॉल के अंतिम अनुपात, 75% सेल युक्त लार [सीसीएस] के साथ एक शेयर उपज के लिए autoclaved सामान्य अभिकर्मक ग्रेड ग्लिसरॉल के साथ जमा लार पतला।
  4. जब तक जरूरत 3 मिलीग्राम एकल उपयोग aliquots में -80 डिग्री सेल्सियस पर लार रुक।
  5. Microfluidic प्रणाली टीका लगाना करने के लिए आवश्यक है, जब aliquots के नीचे, प्रोटोकॉल के चरण 3 में वर्णित के रूप में microfluidic प्रणाली में pipetted किए जाने से पहले कमरे के तापमान पर thawed और 5 सेकंड के लिए एक vortexer पर धीरे उत्तेजित कर रहे हैं।

ओरल बहु प्रजातियों biofilms के 3. ग्रोथ

  1. सीएफएस पूर्व उपचार
    1. पहली कोट सीएफएस के साथ Bioflux microfluidic चैनलों। अच्छी तरह से प्रत्येक आउटलेट के लिए सीएफएस के 100 μl जोड़ें। Bioflux नियंत्रण सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, चैनलों से "मैनुअल" और सेट प्रवाह चुनें "बी 1-B24" थाटी इस्तेमाल हो रहे हैं।
    2. अगला, 1.0 डाएन / सेमी² कतरनी सेट और चैनल भर सीएफएस के समरूप वितरण सुनिश्चित करने के लिए कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए प्रवाह शुरू करते हैं। सीएफएस समान रूप से सभी चैनलों के माध्यम से प्रवाहित होती है कि यह पुष्टि करने के लिए प्रत्येक इनलेट चैनल में तरल पदार्थ नहीं है सुनिश्चित करें।
    3. 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर थाली सेते हैं।
    4. दुकान के कुओं में रहता है कि सीएफएस / pretreat समाधान निकालें और इनलेट वेल्स को हस्तांतरण। 100 μl का यह कुल मात्रा अच्छी तरह से आउटलेट से inoculum के लिए लागू किया जा रहा दबाव के खिलाफ संतुलन के लिए की सेवा करेंगे।
  2. टीका
    1. अच्छी तरह से प्रत्येक आउटलेट के लिए, सीसीएस inoculum के 100 μl जोड़ें। बिल्कुल 6 सेकंड के लिए 1.0 डाएन / सेमी ² में इनलेट कुओं (यानी, रिवर्स) को microfluidic गर्मी प्लेट पर प्लेट (तापमान 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट), नियंत्रण सॉफ्टवेयर के भीतर का चयन पुस्तिका, और आउटलेट कुओं से सेट प्रवाह रखें।
    2. 40 मिनट की अनुमति देने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर microfluidic थाली सेतेप्रारंभिक पालन और inoculum में बैक्टीरिया के विकास के लिए।
  3. रातों रात ग्रोथ
    1. टीका चैनलों का इस्तेमाल किया जा रहा है, आउटलेट कुओं में से प्रत्येक से बर्बाद inoculum aspirate। (मौजूदा सीएफएस के शीर्ष पर किया जा सकता है) इनलेट कुओं में से प्रत्येक में सीएफएस के 1 मिलीलीटर कुल मात्रा के लिए ऊपर जोड़ें।
    2. 37 डिग्री सेल्सियस पर microfluidic थाली सेते हैं, मैनुअल का चयन करें और 20 घंटे के लिए 0.2 डाएन / सेमी ² पर चलाने के लिए कार्यक्रम निर्धारित किया है।
  4. दाग prewash
    1. इनलेट और आउटलेट कुओं से तरल पदार्थ महाप्राण सब और इनलेट कुओं में से प्रत्येक के लिए पीबीएस के 100 μl (7.4 पीएच) जोड़ें। 0.2 डाएन / सेमी ² पर 20 मिनट के लिए प्रवाह।
  5. दाग मिश्रण अलावा
    1. सेल व्यवहार्यता धुंधला के लिए दाग होने के लिए प्रत्येक चैनल के लिए दाग मिश्रण के 100 μl बनाते हैं। विशेष रूप से, SYTO 9 के 3 μl और मृत / जी के रूप में वाणिज्यिक सेल व्यवहार्यता धुंधला किट का उपयोग पीबीएस के मिलीलीटर प्रति propidium आयोडाइड के 3 μl जोड़ें। यह उत्पन्न करता है10 माइक्रोन SYTO 9 और 60 माइक्रोन propidium आयोडाइड युक्त एक धुंधला मिश्रण।
    2. इनलेट कुओं से शेष पीबीएस Aspirate और फिर अच्छी तरह से प्रत्येक इनलेट करने के लिए सेल व्यवहार्यता दाग मिश्रण के 100 μl जोड़ें। कमरे के तापमान पर 45 मिनट के लिए आउटलेट के लिए इनलेट से समाधान 0.2 डाएन / 2 सेमी में प्रवाह और चलाने के लिए सेट करें।
  6. पोस्ट-धुंधला धोने
    1. इनलेट कुओं में से प्रत्येक में शेष दाग Aspirate और अच्छी तरह से प्रत्येक इनलेट पीबीएस के 100 μl जोड़ें। किसी भी अतिरिक्त दाग को दूर करने के लिए कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए आउटलेट के लिए इनलेट से पीबीएस समाधान 0.2 डाएन / सेमी ² में प्रवाह और चलाने के लिए सेट करें।

4. छवि संग्रह, 3 डी प्रतिपादन, और छवि विश्लेषण

  1. Microfluidic प्रणाली से biofilm छवि डेटा एकत्र करने के लिए एक औंधा लेजर confocal खुर्दबीन स्कैनिंग (CLSM) का प्रयोग करें। CLSM 150 ग्राम तक पहुंच सकता है जो Bioflux थाली, का भार सहन करने में सक्षम है कि सुनिश्चित करें।
    नोट: पैसा देखते हुएmicrofluidic चैनलों, biofilm संरचना विचार करने के लिए संवेदनशीलता के लिए की जरूरत है, और आवश्यकताओं के nsions, अलग-अलग तीव्रता के प्रतिदीप्ति संकेत का पता लगाने के एक 40x 1.25 एनए उद्देश्य लेंस या इसी तरह के ऑप्टिकल गुणवत्ता, बढ़ाई, और संख्यात्मक एपर्चर के साथ एक साथ CLSM फिट करने के लिए।
  2. लाभ के साथ उत्सर्जन पर कब्जा फाटकों के मानकीकरण और ऑफसेट माप स्थिर रखा जा रहा है। इस तस्वीर विरंजन में परिणाम कर सकते हैं के रूप में लेजर बिजली 25% से अधिक नहीं है कि सुनिश्चित करें।
  3. मैं एफ इले प्रकार OME के लिए (LIF) (हे कलम एम icroscopy nvironment) फ़ाइल प्रकार दाना एल eica से CLSM फ़ाइलों को परिवर्तित। इस सॉफ्टवेयर प्रोग्राम के बीच का उपयोग और अनुकूलता का अधिक से अधिक आराम के लिए अनुमति देता है। इस प्रकार की फ़ाइलों को परिवर्तित करने के लिए इस तरह के Imaris, के रूप में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें।

छवियाँ / आंकड़ों के लिए 3 डी प्रतिपादन

  1. एक बार OME स्वरूप में परिवर्तित, इस तरह के चित्र रेंडर करने के लिए Imaris के रूप में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर का उपयोग3 डी में। "Easy3D" और "पार" विकल्पों में से एक संयोजन का उपयोग कर इस प्रदर्शन करते हैं।
    नोट: पृष्ठभूमि संकेत और thresholding पर ध्यान किया जाना चाहिए। Imaris में हिस्टोग्राम समारोह संग्रह रेंज प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और छवियों का विश्लेषण किया जा रहा है के बीच यह निरंतर रखा जाना चाहिए।
  2. "स्नैपशॉट" समारोह का उपयोग कर छवियों को बचाने और फ़ाइल प्रकारों को सहेजने से पहले छवि संकल्प को सावधानी से विचार कर सकते हैं।
  3. ऐसे CorelDraw या एडोब इलस्ट्रेटर के रूप में छवि संपादन सॉफ्टवेयर का उपयोग आंकड़ों में छवियों को इकट्ठा करो।

रेखांकन और तालिकाओं के लिए 3 डी छवि विश्लेषण

  1. छवि विश्लेषण के लिए ImageJ 23 और COMSTAT / COMSTAT2 38 स्वतंत्र रूप से उपलब्ध का उपयोग करें। क्रमश: http://rsb.info.nih.gov/ij/ और http://comstat.dk/ से संकुल डाउनलोड करें। सबसे हाल ही में जावा अद्यतन स्थापित किया है।
    नोट: सॉफ्टवेयर प्लेटफार्म जावा PRIO स्थापित करने की आवश्यकता होगीछवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए आर।
    1. "विभाजन चैनल" के साथ "hyperstack" मोड और देखने में प्रत्येक biofilm छवि के लिए OME फ़ाइलें आयात करने COMSTAT2 प्लगइन के साथ ImageJ सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें।
    2. व्यक्तिगत रूप से दो चैनलों ImageJ की "हिस्टोग्राम" समारोह का उपयोग (लाल / propidium-आयोडाइड / मर जा रहा है चैनल 0, हरी / SYTO-9 / रहते जा रहा है चैनल 1) का विश्लेषण। इस समारोह में कोई संकेत (पृष्ठभूमि) के साथ शून्य जा रहा है पिक्सल और 255 होने के साथ, ("मूल्य" के रूप में दिखाया गया है) 0-255 प्रत्येक रंग तीव्रता में ("गणना" के रूप में दिखाया गया है) 8-बिट OME फ़ाइलों के पिक्सल की कुल संख्या की सूची पूरा संकेत संतृप्ति के साथ पिक्सेल।
    3. एक स्प्रेडशीट प्रोग्राम में डेटा निर्यात और इसी संकेत तीव्रता से प्रत्येक पिक्सेल भार से सभी संकेत मूल्यों के मानकीकरण। यह संकेत है कि तीव्रता के संख्यात्मक 8 बिट मूल्य (0-255) द्वारा एक दिया संकेत तीव्रता में कुल गिनती गुणा करके किया जाता है।
    4. पर कब्जा कर लिया प्रत्येक biofilm छवि के लिए दोनों चैनलों के लिए, सभी भारित मूल्यों, 0-255 राशि। या तो चैनल से प्रतिशत कुल संकेत निर्धारित करने के लिए दोनों चैनलों के लिए भारित मूल्यों की राशि ले लो। लाल और प्रतिशत हरी झंडी (प्रतिशत "मृत" और प्रतिशत प्रत्येक उपचार के लिए "जी" यानी) सापेक्ष अनुपात या प्रतिशत निर्धारित करने के लिए यह मत करो।
    5. असमान विचरण के लिए संशोधित दो पूंछ छात्र के टी-परीक्षण का उपयोग कर उदाहरण के लिए, सांख्यिकीय विश्लेषण प्रदर्शन। पी <0.05 के मूल्यों को महत्वपूर्ण माना जाता है और पी <0.01 के उन मूल्यों को अत्यंत महत्वपूर्ण माना जाता है।

संस्कृति स्वतंत्र विश्लेषण के लिए 5. फसल काटने Biofilm प्रकोष्ठों

  1. इनलेट और आउटलेट कुओं से सभी खर्च और अप्रयुक्त लार निकालें। 1 मिलीलीटर बाँझ आसुत जल में तीन बार के साथ कुओं धो लें।
  2. सॉफ्टवेयर नियंत्रण इंटरफ़ेस का उपयोग कर, इनलेट वेल्स को बाँझ आसुत जल के 100 μl जोड़ें और पारित> 8.0 डाएन / 2 सेमी में चैनलों के माध्यम से आगे बाँझ आसुत जल (800 सेकंड की, कतरनी दर> 745 μl / घंटा प्रवाह -1) कम से कम 5 मिनट के लिए। कम से कम 5 मिनट के लिए विपरीत दिशा में दोहराएँ और फिर आगे दोहराने और वाशिंग कदम प्रक्रिया को उल्टा।
  3. पूरी तरह से biofilm हटाने (चित्रा 2) के लिए (कोशिकाओं दाग रहे थे अगर / लेबल) प्रकाश द्वारा या epifluorescence माइक्रोस्कोपी द्वारा जाँच करें। संस्कृति स्वतंत्र विश्लेषण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर 100 μl सेल निलंबन और दुकान ले लीजिए। समुदाय संरचना के एक लागत प्रभावी विश्लेषण नैन्स एट अल में वर्णित दृष्टिकोण का उपयोग बैक्टीरियल टैग इनकोडिंग FLX amplicon pyrosequencing (bTEFAP) का उपयोग कर के माध्यम से हासिल किया जा सकता है। 20

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Representative Results

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Biofilms के 3 डी प्रतिपादन

प्रतिनिधि परिणाम 3 चित्र में दिखाया जाता है। Imaris सॉफ्टवेयर में एक उपयोगी उपकरण एकत्र biofilm ढेर के प्रत्येक टुकड़ा जांच करने के लिए और उन्हें तीन आयामी पुनर्निर्माण बनाने के गठबंधन के लिए विकल्प है। इसके अलावा, कृत्रिम ग्रहण प्रभाव नेत्रहीन मदद तीन आयामी संरचना की व्याख्या करने के लिए जोड़ा जा सकता है। गाया biofilms biofilm या सूक्ष्म कॉलोनी संरचना का पता लगाने के लिए अलग अलग आवर्धन के साथ किसी भी दिशा में केंद्रित किया जा सकता है। छवियों छवि में प्रस्तुत किया। 3 एक मौखिक बहु प्रजातियों biofilm के उपचार के नतीजे दिखाते हैं। विशेष नोट का 70% इथेनॉल के साथ इलाज महत्वपूर्ण सेल-मौत या सेल क्षति, सुझाव (हरे रंग से लाल करने के लिए) biofilm के अधिकांश के लिए महत्वपूर्ण रंग बदलने में हुई है। बड़े सूक्ष्म कालोनियों अंतर्निहित (और अब उजागर) सूक्ष्म कॉलोनी कोशिकाओं की तुलना में अधिक मृत कोशिकाओं को शामिल करने के लिए दिखाई दिया। सफलताज एक परिणाम इथेनॉल एक झिल्ली सक्रिय रोगाणुरोधी है क्योंकि biofilm कोशिकाओं के आसंजन डे के लिए क़यास वजह से है। OME प्रारूप करने के लिए फ़ाइलों को परिवर्तित करने और ImageJ में गाया ढेर का विश्लेषण करके, यह लाल और हरी झंडी की राशि इलाज biofilms और इथेनॉल के साथ इलाज किया उन लोगों के बीच विपरीत आनुपातिक होता है कि हिस्टोग्राम कार्यों को लागू करने से देखा जा सकता है।

Biofilm गुण की मात्रा का ठहराव

1 टेबल औसत और कुंजी संरचनात्मक मापदंडों का मानक विचलन से पता चलता है। Imaris, ImageJ और COMSTAT उपयोग करने के लिए एक प्रमुख लाभ, Imaris पहला प्रयोग किया जाता है, तो OME फ़ाइलें ImageJ और COMSTAT के माध्यम से pipelined किए जाने की अनुमति देने के लिए उत्पन्न किया जा सकता है। तालिका 1 में प्रस्तुत नमूना डेटा 70% इथेनॉल के साथ मौखिक biofilms के इलाज के 28.3% से 80.8% से व्यवहार्यता में एक अत्यधिक महत्वपूर्ण गिरावट आई है कि पता चलता है। इथेनॉल कुछ सेल नुकसान और संरचनात्मक सी पैदा कर सकता हैbiofilms में hanges लेकिन इस हद तक काफी अलग अक्सर बार नहीं है। यहाँ, औसत biovolume, औसत मोटाई और औसत खुरदरापन के उपायों में कोई मतभेद (तालिका 1) पाया गया।

चित्रा 1
चित्रा 1. Bioflux microfluidic मौखिक biofilm प्रणाली। (ए) एक औंधा एसपीई CLSM पर मुहिम शुरू की जा रही है, जबकि Bioflux प्रणाली की एक ऊर्ध्वाधर पार अनुभाग दिखा आरेख। (बी) के दो microfluidic चैनलों और इनलेट और आउटलेट कुओं पर प्रकाश डाला एक एनोटेट (काली लाइनें) तस्वीर। (सी) के कारण प्रतिक्रिया प्रसार सीमा के भाग में विषम हत्या में जिसके परिणामस्वरूप एक 0.01% सीपीसी समाधान के साथ इलाज किया गया है कि एक गाया दो आयामी लाइव / मृत दाग मौखिक biofilm की एक उदाहरण है। ग्रीन रंग दाग जीवित कोशिकाओं, इंगित करता हैSyto 9 के साथ; लाल रंग की कोशिकाओं नैन्स एट अल। अनुमति के साथ 20 से मृत या क्षतिग्रस्त और propidium आयोडाइड के साथ दाग। अंजीर 1 ए और 1 बी कर रहे हैं। छवि में पट्टी। -1 सी 30 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है।

चित्रा 2
गाया 20 घंटा biofilms के दो आयामी और तीन आयामी विचार उत्पन्न करने के लिए लेजर confocal माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग (CLSM) की चित्रा 2। उपयोग। ये biofilms जमा सेल युक्त लार (सीसीएस) की एक inoculum से जमा सेल मुक्त लार (सीएफएस) में विकसित किए गए। एक इलाज biofilm समुदाय (छवियों के बाएँ स्तंभ) एक 70% इथेनॉल इलाज किया biofilm समुदाय के खिलाफ तुलना में है और एक प्रतिनिधि biofilm देखने के विभिन्न विमानों (XY, XZ, और ZYZ) में दिखाया गया है। लाल रंग में मतभेद (मृत / क्षतिग्रस्त कोशिकाओं) और ग्रीन (जीवित कोशिकाओं) एक दिखा histogramsप्रत्येक छवि के ढेर के लिए दिखाया गया रे (भूरे रंग में दिखाया गया काला और गैर लॉग इन आंकड़ों में दिखाया गया डेटा लॉग इन)। सभी डेटा 8 बिट छवियों से है और इस तरह 0-255 (256 वेतन वृद्धि) के पैमाने पर ली गई है। स्केल सलाखों 30 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करते हैं।

चित्रा 3
20 घंटा मौखिक बहु प्रजातियों biofilm की निकासी / कटाई के परिणाम का प्रदर्शन चित्रा 3. फ्लो चार्ट ऊंचा कतरनी / फ्लो तकनीक का उपयोग कर Bioflux microfluidic युक्ति से (सीएफएस बह में एक सीसीएस inoculum से विकसित)। बिंदीदार लाइनों चैनल दीवारों के स्थान का निर्धारण करने में सहायता करने के लिए छवियों के लिए लागू किया गया है। काटा biofilm के समुदाय रचना अनुरोध के आधार पर इस तरह के जीवाणु टैग इनकोडिंग FLX amplicon pyrosequencing (bTEFAP) के रूप में 454 pyrosequencing टेक्नोलॉजीज द्वारा विश्लेषण किया है और कई वर्गीकरण के स्तर पर (प्रजातियों के माध्यम से जाति) में व्यक्त किया जा सकता हैuirements। समुदाय रचना का एक उदाहरण तीन microfluidic चैनलों से काटा biofilms के, संघ के स्तर पर, दिखाया गया है। बार्स माइक्रोमीटर में बड़े पैमाने प्रतिनिधित्व करते हैं।

पैरामीटर / उपचार इलाज 70% EtOH के
औसत व्यवहार्यता (%) 80.8 (0.9) 28.3 (5.8) **
औसत Biovolume (माइक्रोन / माइक्रोन 2 3) 17.7 (8.4) 16.1 (3.0)
औसत मोटाई (माइक्रोन 2) 23.3 (11.3) 15.6 (6.4)
औसत खुरदरापन 0.4 (0.3) 0.50 (0.2)

अनुपचारित और 70% इथेनॉल के biofilm संपत्तियों की तालिका 1. मात्रा एक inoculum सेल युक्त लार (सीसीएस) से जमा सेल मुक्त लार (सीएफएस) में विकसित 20 घंटा biofilms का इलाज किया। बोल्ड मूल्यों कोष्ठक में औसत और गैर बोल्ड मूल्यों मानक विचलन कर रहे हैं। डाटा तीन microfluidic चैनलों से कम से-कम पांच छवियों से है। अनुपचारित नियंत्रण के लिए महत्वपूर्ण मतभेद तारांकित (** p <0.01%) द्वारा डाला जाता है।

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Discussion

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इस तरीके से कागज सेटअप करने के लिए आवश्यक बुनियादी कदम पर प्रकाश डाला गया और जमा मानव लार से ली गई है और फिल्टर निष्फल 25% जमा मानव लार में उगाई मौखिक बहु प्रजातियों biofilms के विकास के लिए अनुमति देने के लिए एक तरह से एक microfluidic प्रणाली चला रहे हैं। Biofilm चिह्नित करने के प्रयास में दिया जाता है, लेकिन यह इन वर्णित दृष्टिकोण ऐसे उदाहरण के लिए, दाग या लेबल पेश किया जा सकता है, के रूप में परिवर्तनीय और अतिरिक्त तकनीकों हैं कि याद किया जाना चाहिए। उदाहरण के एक मामले के रूप में, एक अटकल लेबल वाले एंटीबॉडी का उपयोग करें या कल्पना और मौखिक बहु प्रजातियों biofilm भीतर कुछ प्रजातियों की भौगोलिक स्थिति की जांच के लिए एक फ्लोरोसेंट तनाव मिलवा सकता है। इसके अलावा, इस्तेमाल किया जा रहा microfluidic प्रणाली के मॉडल पर निर्भर करता है, यह अवायवीय स्थितियों के तहत biofilms का विकास संभव है (Bioflux प्रणाली के मामले में, एक तकनीकी नोट इस विषय पर Fluxion.com पर उपलब्ध है)।

Bioflux microfluid करने के लिए एक महत्वपूर्ण पहलूआईसी प्रणाली कई तकनीकों के साथ अपनी संगतता है और इस संस्कृति स्वतंत्र विविधता का विश्लेषण करती है (चित्रा 3) प्रदर्शन करने की क्षमता से यहाँ पर प्रकाश डाला है। Microfluidic प्रणाली के आंतरिक सतहों आसानी से आगे जोरदार, सुलभ नहीं हैं और पर्याप्त biofilm बायोमास सक्षम करता प्रवाह रिवर्स जबकि हटाया जाना है। Biofilm की सभी को आसानी से हटाया नहीं जा सकता है और इस प्रणाली के लिए एक कमजोरी माना जा सकता है, यह कई मॉडल biofilm सिस्टम भी इस ज्ञान के साथ संतुलित किया जाना है एक समान समस्या है और ऐसे किसी भी एकत्र आंकड़ों से दावा किया है कि नोट करने के लिए प्रासंगिक है । उदाहरण के लिए, यह स्ट्रेप्टोकोक्की की बहुतायत कई स्ट्रेप्टोकोकस प्रजातियों लार में लिपटे सतहों 39 करने के लिए बाध्य करने के लिए असाधारण अच्छा क्षमता है क्योंकि वास्तव में प्रयोगात्मक निर्धारित से biofilm में अधिक हो सकता है कि संभव है।

सभी मॉडल biofilm सिस्टम के साथ के रूप में, एक सवाल पूछा जा रहा है के प्रति जागरूक हो गया है। एफया उदाहरण के लिए, इस प्रणाली के लिए लंबी अवधि के अनुदैर्ध्य अध्ययन के लिए उपयुक्त नहीं होगा। इस तरह के एक निरंतर गहराई फिल्म रिएक्टर, एक Sorbarod प्रणाली, या एक ड्रिप रिएक्टर के रूप में एक मॉडल प्रणाली 40-42 अधिक उपयुक्त हो सकता है। एक मॉडल प्रणाली के लिए लार की सीमित मात्रा की समस्या इन के रूप में एक मुद्दा बन जाता है हालांकि microfluidic आधारित डिजाइन नहीं कर रहे हैं। हालांकि एक समान प्रकाश में, यहाँ वर्णित Bioflux प्रणाली को भी जैविक तरल पदार्थ कम मात्रा में ही उपलब्ध हैं जहां अन्य वातावरण में biofilms के अध्ययन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, इस मूत्र और घाव पीब शामिल हो सकते हैं।

अंत में, किसी भी इन विट्रो मॉडल प्रणाली के साथ के रूप में, एक मौखिक biofilms के विकास के लिए ताकत और microfluidic प्रणाली की कमजोरियों का जानकार हो गया है। Microfluidic प्रणाली यकीनन पर्यावरण की दृष्टि से सार्थक है और इन विवो स्थिति के लिए compositionally समान हैं कि biofilms के विकास के लिए अनुमति देता है, यह वें नहीं हैई में विवो स्थिति के रूप में एक ही है और संभावना तो कभी नहीं होगा। एक प्रयोगशाला मॉडल प्रणाली अपने मान्यताओं के रूप में ही रूप में अच्छा है और microfluidic प्रणाली मानव मौखिक गुहा के भीतर की स्थिति, ऐसे मेजबान आधारित प्रभाव और बाहरी जैविक और अजैविक चुनौतियों जैसे कारकों के साथ कई overlaps है, जबकि (जैसे पीने और खाने के माध्यम से) आसानी से नहीं हो सकता दोहराया। यह उच्च throughput प्रकृति के साथ-साथ पर्यावरण और सूक्ष्मजीवविज्ञानी वास्तविक दुनिया मौखिक स्थिति के साथ ओवरलैप इस logistically चुनौतीपूर्ण नैदानिक ​​अध्ययन में उलझाने से पहले भविष्यवाणी करने के लिए एक आकर्षक microfluidic प्रणाली बनाने, तथापि, कि स्पष्ट है।

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Acknowledgments

लेखकों biofilm विकास प्रोटोकॉल और जॉन Battista (Fluxion, सैन फ्रांसिस्को, सीए) Bioflux प्रणाली से संबंधित तकनीकी मुद्दों के विषय में सलाह देने के लिए तैयार करने में मदद के लिए विलियम नैन्स (मिशिगन विश्वविद्यालय) धन्यवाद। शुरू हुआ धन AHR के लिए: (AHR को R21DE018820 एनआईएच) और मिशिगन विश्वविद्यालय यह काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के द्वारा समर्थित किया गया

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-432-22
Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-959-49D
Dithiothreitol (White Crystals or Powder/Electrophoresis), Fisher BioReagents Fisher Scientific BP172-5
Sorval ultracentrifuge  (SS-34 compatible) Thermoscientific Unit-dependent
Thermo Scientific SS-34 Rotor  Thermoscientific 28-020
Thermo Scientific Type 1 Reagent Grade Deionized Water Thermo  Scientific Inc 23-290-065
Nalgene Rapid-Flow Filter Units and Bottle Top Filters, PES Membrane, Sterile. VWR 73520-986 
Glycerol Thermo Fisher Scientific Inc NC0542269
BioFlux microfluidic system Fluxion Bioflux 200 system
Bioflux 24-channel plate Fluxion 910-0004
PBS (Gibco) Thermo Fisher Scientific Inc 10010023
LIVE/DEAD stain (Invitrogen)  Invitrogen L7012
Confocal Laser Scanning Microscope Lecia SPE or eqivalent system
Epifluorescence Microscope Multiple choices Multiple choices
Pyrosequencing facilities Multiple choices Multiple choices
Decon SaniHol 70 Ethanol Solution Fisher Scientific 04-355-122
Ultra Low Temperature Freezer -80 °C Multiple choices Multiple choices
Tips (20, 200, and 1,000 μl) Multiple choices Multiple choices
Single Channel Variable Volume Pipettors (20, 200, 1,000 μl) Multiple choices Multiple choices
Software
Bioflux dedicated software Bioflux
Imaris Bitplane
Leica SPE Leica
ImageJ Freeware (http://imagej.nih.gov/ij/)
COMSTAT/COMSTAT 2 Freeware (http://www.comstat.dk/)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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एक उच्च throughput का प्रयोग करें<em&gt; इन विट्रो</em&gt; Microfluidic प्रणाली ओरल बहु प्रजातियों Biofilms विकसित करने के लिए
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Samarian, D. S., Jakubovics, N. S., Luo, T. L., Rickard, A. H. Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms. J. Vis. Exp. (94), e52467, doi:10.3791/52467 (2014).More

Samarian, D. S., Jakubovics, N. S., Luo, T. L., Rickard, A. H. Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms. J. Vis. Exp. (94), e52467, doi:10.3791/52467 (2014).

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