Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Protein Purification teknikk som gjør at Påvisning av Sumoylation og ubiquitinering av Spirende gjær kinetochore Proteiner Ndc10 og Ndc80

doi: 10.3791/52482 Published: May 3, 2015

Summary

Dette manuskriptet beskriver påvisning av sumoylation og ubiquitinering av kinetochore proteiner, Ndc10 og Ndc80, i den spirende gjær Saccharomyces cerevisiae.

Abstract

Post-translasjonelle modifikasjoner (PTMs), som fosforylering, metylering, acetylering, ubiquitinering, og sumoylation, regulere den cellulære funksjonen til mange proteiner. PTMs av kinetochore proteiner som assosierer med centromeric DNA megle trofast kromosom segregering for å opprettholde genom stabilitet. Biokjemiske metoder som massespektrometri og western blot analyse er mest brukt for identifisering av PTMs. Her blir en proteinrensemetode som er beskrevet som tillater påvisning av både sumoylation og ubiquitinering av kinetochore proteiner, Ndc10 og Ndc80, i Saccharomyces cerevisiae. En stamme som uttrykker polyhistidin-Flag-merket Smt3 (HF-Smt3) og Myc-merket Ndc10 eller Ndc80 ble bygget og brukt til våre studier. For påvisning av sumoylation, utviklet vi en protokoll til affinitetskromatografi rense His-tagget sumoylated proteiner ved hjelp av nikkel perler og brukes western blot analyse med anti-Myc antistoff for å påvise sumoylated Ndc10 ennd Ndc80. For påvisning av ubiquitinering, utviklet vi en protokoll for immunoprecipitation av Myc-merket proteiner og brukes western blot analyse med anti-Ub antistoff for å vise at Ndc10 og Ndc80 er ubiquitinmolekyler. Våre resultater viser at epitop tagget-protein av interesse for Hans-Flag merket Smt3 belastning letter påvisningen av flere PTMs. Fremtidige studier bør tillate utnyttelse av denne teknikken til å identifisere og karakterisere protein interaksjoner som er avhengig av en bestemt PTM.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Ubiquitinering og sumoylation tillater konjugering av ubiquitin og små Ubiquitin lignende modifikator (SUMO; Smt3 i S. cerevisiae 1) til et målprotein, respektivt. PTMs av kinetochore proteiner påvirker deres cellulære nivåer og protein-protein interaksjoner i ulike cellesyklusfaser for å sikre trofast kromosom segregering. For eksempel er cellulære nivåer av Cse4 / CENP-A og ytre kinetochore protein Dsn1 regulert av ubiquitin-formidlet proteolyse for å sikre stabilitet genom 2-5. Destabilisering av feil kinetochore-microtubule vedlegg krever Ipl1 / Aurora B kinase som fosforylerer Dam1 og Ndc80 komplekser som direkte samhandler med mikrotubuli 6-8. Til tross for identifisering av over sytti kinetochore proteiner, er det svært få studier som undersøker de modifikasjoner av disse proteinene med PTMs, f.eks ubiquitin og SUMO. En viktig begrensning er evnen til å bevare den PTMs under rensingen og mangelen på tilpassede antistoffer for påvisning av PTMs som sumoylation, fosforylering, metylering, og andre. Karakterisering av sumoylated kinetochore proteiner Ndc10, Cep3, Bir1, og Ndc80 benyttet en tilpasset antistoff 9. I tillegg har Ndc10 vært innblandet som et substrat for ubiquitinering 10. Menneskelig Hec1 (Ndc80 i S. cerevisiae) er også substrat for ubiquitinering, regulert av APC / C-hCdh1 E3 ligase 11. Derfor Ndc10 og Ndc80 er gode kandidater for optimalisering av protokollen for å oppdage både sumoylation og ubiquitinering i S. cerevisiae.

For å lette identifiseringen av sumoylation, bygget vi stammer som uttrykker HF-Smt3 og Myc-merket Ndc10 eller Ndc80. Bruken av epitope tags (HF: His6-Flag) minimerer bakgrunnen på grunn av kryssreaksjon som er hyppig observert i polyklonale serum reist mot en kandidat protein. Vi utviklet en protokoll for å affinitetskromatografirense HF-Smt3 konjugater og deretter brukes kommersielle anti-Flag og anti-myc antistoff for å oppdage tilstedeværelsen av sumolyated Ndc10 og Ndc80 i renset Smt3 preparatet. For ubiquitinering, utviklet vi en modifisert immunopresipitering protokoll som bevarer ubiquitinering av Myc-merkede kinetochore proteiner og utført western blot analyse med kommersiell anti-Ub antistoff for å påvise ubiquitinering av Ndc10 og Ndc80.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Veksten av gjærceller

  1. Inokuler gjærceller i 30 ml YPD (tabell 1) i en liten kolbe. Inkuber ved 30 ° C over natten med risting.
  2. Fortynn cellene til en optisk tetthet på 0,2 ved 600 nm (OD 600 = 0,2) i 50 ml YPD og inkuber ved 30 ° C med risting.
  3. Dyrk kulturen til en optisk tetthet på 1,0 ved 600 nm (OD 600 = 1,0).
  4. Sentrifuger cellene i 5 min ved 2000 xg og kast supernatanten.
  5. Resuspender cellepelleten i 40 ml sterilt vann og sentrifuger i 5 minutter ved 2000 x g for å vaske cellene. Kast supernatanten og lagres cellepelleten ved -20 ° C.

2. Utvinning av Proteiner

  1. Resuspender celler i 0,5 ml iskald buffer guanidin (tabell 1) for pull-down-analyse ved hjelp av Ni-NTA superflow perler eller buffer A (tabell 1) for immunopresipitering. Hold rørene på is til alle tider.
  2. Overføring til 2 ml skrukork.
  3. Legg det samme volum av glassperler (Table of Materials).
  4. Bead-slå cellene i en mini perle beater (tabell of Materials) i 2 min ved romtemperatur, deretter plassere på is i 2-3 min. Gjenta dette tre ganger.
  5. Vortex på høy hastighet ved 4 ° C i 30-60 min. Kontroller cellene ved visualisering under mikroskopet for å sikre at cellene lyseres.
    Merk: lyserte celler vises som mørke spøkelser og mangler en grense eller definert form. Optimalt minst 80% av cellene skal lyseres.
  6. Punktere et hull i bunnen av røret ved hjelp av en skyvepinnen og sett i en samling 15 ml konisk rør (skrulokk skal være løs).
  7. Sentrifuger ved 1000 x g i 1 min for å samle lysatet.
  8. Overfør lysatet til en mikro-sentrifugerør.
  9. Sentrifuger ved 15000 xg i 30 min ved 4 ° C for å samle de ekstraherte proteiner.
  10. Måle konsentrasjonen av de ekstraherte proteiner ved hjelp av protein ASSAy kit (Table of Materials) og normalisere alle ekstrakter for å inneholde den samme mengde protein. Bringe det totale volum til 1 ml med passende buffer.
    Merk: Rundt 5 mg totalt protein ble oppnådd fra 50 OD 600 celler.
  11. Lagre 50 ul (250 ug protein hvis det totale protein ekstrahert fra trinn er 2,10 5 mg) som hel celleekstrakt (WCE). Tilsett 50 ul av 2x Laemmli-prøvebuffer (tabell 1) og inkuberes ved 100 ° C i en varmeblokk i 3-5 min. Last 10 ul av hver prøve i en SDS-PAGE-gel for Western Blot-analyse (avsnitt 5: Western blot analyse).

3. Rensing av HF-Smt3 Konjugater

  1. Skaff Ni-NTA superflow perler (Tabell of Materials) som er nødvendige for eksperimentene (100 mikroliter perler per prøve) ved lavhastighetssentrifugering (800-1,500 xg) i 1 min. Fjern supernatanten.
  2. Vask perler 5x med 1 ml PBS (Table of Materials): Inverter top-over-bunn inntil perlene resuspenderes, samle perler ved lavhastighetssentrifugering, og fjern supernatanten.
  3. Suspendere kulene i 1 ml guanidin buffer (tabell 1) og alikvot dem inn i det antall rør som tilsvarer prøver som skal behandles. Samle perlene ved lavhastighetssentrifugering, og fjern supernatanten. Bland perlene godt ved å snu topp-over bunnen.
    Merk: Bland perlene godt ved å vende topp-over bunnen.
  4. For hver prøve, tilsett 950 ul av den gjenværende WCE (fra Trinn 2.11: Utvinning av protein) til 100 ul av Ni-NTA superflow perler.
  5. Inkuber på en gyngende plattform ved 4 ° C i minst 4 timer eller over natten.
  6. Sentrifuger ved 800-1,500 xg i 1 min ved 4 ° C.
  7. Spar 50 mikroliter, som supernatant (SUP). Tilsett 50 ul av 2x Laemmli-prøvebuffer og inkuber ved 100 ° C i en varmeblokk i 3-5 min. Load 10 mL av hver prøve i en SDS-PAGE gel for Western Blot analyse (§ 5: Western blot analysis).
  8. Vasking av perler en gang med 1 ml buffer guanidin i 5-10 min på en gyngende plattform.
  9. Vasking av perler med 5 x 1 ml bryte buffer (tabell 1) i 5-10 min på en gyngende plattform.
  10. Resuspender perler i 90 ul av 2x Laemmli-prøvebuffer.
  11. Tilsett 10 pl av 1 M imidazol.
    Merk: Imidazole bidrar til å distansere den His-tagget protein fra Ni-NTA perler på grunn av konkurrerende interaksjon mellom -imidazol og perlene.
  12. Inkuber ved 100 ° C i en varmeblokk i 3-5 min.
  13. Vortex, deretter sentrifuger ved 13 000 xg i 30 sek. Overfør supernatanten til et nytt rør.
  14. Last 10-20 ul av hver prøve i en SDS-PAGE-gel for Western Blot-analyse (avsnitt 5: Western blot analyse).
    Merk: 10-20 mL tilsvarer 0,5-1,0 mg av input, hvis 5 mg WCE brukes.

4. Immunoutfelling av Myc-merket kinetochore Proteiner

  1. Skaff anti-c-myc agarose affinitetsgel entibody (Table of Materials) nødvendig for eksperimentene (25 mL av harpiks per prøve) ved lavhastighetssentrifugering (800-1,500 xg). Fjern supernatanten.
  2. Vask harpiks 5x med 1 ml av buffer A: Invert top-over-bunn inntil harpiksen resuspendert, samle harpiks ved lavhastighetssentrifugering, og fjern supernatanten.
  3. Suspendere harpiksen i 1 ml av buffer A og aliquot dem i antall rør tilsvarende prøver som skal behandles. Samle harpiks ved lavhastighetssentrifugering, og fjern supernatanten.
    Merk: Bland harpiks godt ved å snu top-over-bunn.
  4. Legg 950 ul av den gjenværende WCE (fra Trinn 2.11: Utvinning av protein) til 25 pl av harpiks.
  5. Inkuber på en gyngende plattform ved 4 ° C over natten.
  6. Sentrifuger ved 800-1,500 xg i 1 min ved 4 ° C.
  7. Spar 50 mikroliter, som supernatant (SUP). Tilsett 50 ul av 2x Laemmli-prøvebuffer og inkuber ved 100 ° C i en varmeblokk i 3-5 min. Load 10 pl av hver prøve i en SDS-PAGE-gel for Western Blot-analyse (avsnitt 5: Western blot analyse).
  8. Vask harpiks 5x med 1 ml av buffer A: Invert top-over-bunn inntil harpiksen resuspendert, samle harpiks ved lavhastighetssentrifugering, og fjern supernatanten.
  9. Resuspender harpiksen i 100 pl prøvebuffer SUMEB (tabell 1).
    Merk: SUMEB sample buffer inneholder 8 M Urea og 1% SDS (sterk denaturering tilstand).
  10. Inkuber ved 100 ° C i en varmeblokk i 3-5 min.
  11. Vortex, deretter sentrifuger ved 13 000 xg i 30 sek. Overfør supernatanten til et nytt rør.
  12. Last 10-20 ul av hver prøve i en SDS-PAGE-gel for Western Blot-analyse (avsnitt 5: Western blot analyse).
    Merk: 10-20 mL tilsvarer 0,5-1,0 mg av input, hvis 5 mg WCE brukes.

5. Western blot-analyse

  1. Laste proteinekstrakter på 4-12% Bis-Tris gels (Table of Materials) og perform elektroforese ved 120 V i 90 min (Running buffer: Table of Materials).
  2. Overfør proteiner fra gel til en nitrocellulosemembran (Table of Materials) ved hjelp av en overføringsapparat ved 30 V i 90 min (Transfer buffer: Table of Materials).
  3. Blokkere membranen i 5% melk / TBST 1x (Tabell 1) i 1 time ved romtemperatur.
  4. Inkuber membran med primær antistoff (Table of Materials) i 5% melk / 1x TBST natten ved 4 ° C. For primære antistoffer, kan du bruke en fortynning på 1: 1000 (Anti-Flag og anti-UB antistoffer) eller 1: 5000 (anti-Myc antistoff).
  5. Vask membran 3x i 10 minutter hver med 1x TBST.
  6. Inkuber membran med sekundært antistoff (tabell of Materials) i 5% melk / TBST 1x i 1 time ved romtemperatur. Bruk av en 1: 5000 fortynning av sekundære antistoffer.
  7. Vask membran 3x i 10 minutter hver med 1x TBST.
  8. Inkuber membran med ECL working løsning (Table of Materials) i 5 min.
  9. Expose membranen til blå sensitive X-Ray film (Table of Materials) og utvikle ved hjelp av en automatisk utvikler (Table of Materials).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

For å oppdage sumoylation av kinetochore proteiner Ndc80 og Ndc10, stammer med HF-Smt3 og Myc-merket kinetochore proteiner (Ndc80 eller Ndc10) ble konstruert (tabell 2), som tidligere beskrevet 9,12. HF-Smt3 konjugater ble affinitetsrenset bruker Ni-NTA perler. Western blot-analyse av renset HF-Smt3 med et anti-Flag-antistoff tillot påvisning av sumoylated former SUMO substrater som var fraværende i kontrollstammen uten HF-Smt3 (figur 1A og 1B, venstre panel). Som forventet ble det flere former for SUMO underlag oppdaget i HF-Smt3 belastning. Vi har fastslått ved hvis Ndc80 og Ndc10 er til stede i renset HF-Smt3 konjugat ved å gjøre western blot analyser ved anvendelse av et anti-myc antistoff. Flere band som var av høyere molekylvekt enn for Ndc80 eller Ndc10 var tydelig registrert (Figur 1A og 1B, høyre panel). Videre, flere band av både Ndc80 og Ndc10ble redusert i nocodazol behandlede celler (figur 1C og 1D). Disse resultatene viser at proteinrensing og Western blot-analyse som er beskrevet her tillater påvisning av sumoylation av Ndc80 og Ndc10, som tidligere beskrevet ni.

For å oppdage ubiquitinering av Ndc80 og Ndc10, Myc-merket Ndc80 eller Ndc10 ble immunopresipitert (IP) og western blot analyse ble utført med anti-Myc og anti-Ub antistoffer (figur 2). Analyse av hele celleekstraktene (WCE) og supernatant (SUP) bekreftet uttrykk for Ndc80-Myc og Ndc10-Myc (Figur 2A). De lavere molekylvekt bånd på WCE kan representere nedbrytningsprodukter. IP prøver undersøkt med anti-Myc viste flere høymolekylvekt band, noe som tyder på at Ndc80 og Ndc10 inneholde PTMs. En ladde mønster av IP prøver undersøkt med anti-Ub antistoff viste at Ndc80 og Ndc10 er ubiquitinmolekyler (figur 2A, α-Ub). Det rakner mønster av Ndc80 og Ndc10 ble forbedret ved behandling med proteasominhibitor (MG132) (figur 2B, α-Ub), videre bekrefter at disse bandene representerer poly-ubiqutination. De representative Resultatene viser at både Ndc80 og Ndc10 er substrater for sumoylation og ubiquitinering i S. cerevisiae og at de beskrevne proteinrensemetoder er nyttige for påvisning av PTMs som sumoylation og ubiquitinering. Ifølge vår kunnskap, er dette den første rapporten som Ndc80 i S. cerevisiae er et substrat for ubiquitinering, selv om ubiquitin-formidlet proteolyse av den humane homologen Hec1 har tidligere blitt publisert 11.

Figur 1
Figur 1: Rensing av sumolyated underlag gjør identifiseringen av kinetochore proteiner Ndc80 og Ndc10 som SUMO underlag Pr.oteins ble ekstrahert og HF-Smt3 konjugater ble fremstilt og analysert ved hjelp av western blot-analyse etter SDS-PAGE separasjon. (A og B) Ndc80 og Ndc10 er sumoylated. Proteiner ble ekstrahert fra logaritmisk voksende celler i YPD. Venstre panel: Totale SUMO substrater ble oppdaget med en anti-Flag antistoff. Høyre panel: Sumoylated Ndc80 eller Ndc10 ble påvist i HF-Smt3 konjugater når undersøkt med en anti-Myc antistoff. (C og D) Sumoylation av Ndc80 og Ndc10 reduseres i nocodazol behandlede celler. Logaritmisk voksende celler i YPD ble behandlet med DMSO (-) eller DMSO + 20 ug / ml nocodazol (+) i 2 timer ved 30 ° C. HF-Smt3 Konjugatene ble analysert ved hjelp av western blot-analyse ved anvendelse av anti-myc antistoff. Isogene gjærstammer som brukes er (A og C) YPH1800 (Ndc80-Myc), YMB7862 (Hans-Flag-SMT3 Ndc80-Myc) og (B og D) YPH1734 (Ndc10-Myc), YMB7867 (Hans-Flag-SMT3 Ndc10-Myc).

Figur 2
Fig. 2: ubiquitinering av kinetochore proteiner Ndc80 og Ndc10 Utvinning av protein og immunoutfellingsanalyse ble utført som beskrevet i protokollen. (A) Ndc80 og Ndc10 er ubiquitinmolekyler. Proteiner ble ekstrahert fra logaritmisk voksende celler i YPD. Hele celleekstrakt (WCE), supernatanten (SUP), og immunoutfelt (IP) fraksjonene ble utsatt for SDS-PAGE. Western blot ble anvendt for å detektere myc-merket og ubiquitinmolekyler med anti-myc og anti-antistoffer UB hhv. (B) ubiquitinering av Ndc80 og Ndc10 er forbedret i celler behandlet med proteasominhibitor MG132. Logaritmisk voksende celler i YPD ble behandlet med DMSO (-) eller DMSO + 50 uM MG132 (+) i nærvær av 0,003% SDS i 3 timer ved 30 ° C, som tidligere beskrevet 13

Løsning Komponenter
YPD 1% gjærekstrakt, 2% Bacto-pepton, 2% glukose
Guanidine buffer 0,1 M Tris-HCl pH 8,0, 6 M guanidin-klorid, 0,5 M NaCl
Buffer A 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 50 mM NaCl, 0,2% Triton X-100, 1 x proteasehemmere
Breaking buffer 0,1 M Tris-HCl pH 8,0, 20% glyserol, 1 mM PMSF
SUMEB sample buffer 1% SDS, 8 M urea, 10 mM MOPS pH 6,8, 10 mM EDTA, 0,01% bromfenolblått
2x Laemmli Sample Buffer 100 mM Tris-HClpH 6,8, 4% SDS, 20% glycerol, 0,2% bromfenolblått (før bruk: legg b-merkaptoetanol (BME) til en sluttkonsentrasjon på 200 mM)
1x TBST 137 mM natriumklorid, 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,1% Tween-20

Tabell 1: Solutions.

Tabell 2. gjærstammer anvendt i denne studien *.
Stammer Parent Genotype Referanse
BY4741 Mata his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 Åpne Biosystems
BY4742 Mata his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0 Åpne Biosystems
YMB7278 BY4741 / BY4742 Mata his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0 HF-SMT3 :: LEU2 Denne studien
YPH1734 Mata ura3-52 lys2-801 ade2-101 his3Δ200 leu2Δ1 trp1Δ63 NDC10-13Myc :: kanMX6 Petit et al., 2006
YPH1800 Mata ura3-52 lys2-801 ade2-101 his3Δ200 leu2Δ1 trp1Δ63 NDC80-13Myc :: His3MX6 Petit et al., 2006
YMB7862 YMB7278 / YPH1800 Mata his3 leu2 ura3 ADE2 TRP1 HF-SMT3 :: LEU2 NDC80-Myc :: His3MX6 Denne studien
YMB7867 YMB7278 / YPH1734 Mata his3 leu2 ura3 TRP1 LYS2 HF-SMT3 :: LEU2 NDC10-Myc :: kanMX6 Denne studien
* Alle gjærstammer er avledet fra Saccharomyces cerevisiae S288C.
Tabell 2: gjærstammer anvendt i denne studien.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

EPITOP koder som HA, Myc, flagg, og GST er mye brukt til biokjemisk analyse av proteiner. Bygging av stammer med HF-Smt3 og Myc-merket kinetochore proteiner, slik som Ndc10 og Ndc80, letter påvisningen av PTMs som sumoylation og ubiquitinering. HF-Smt3 trekke ned analysen tillater påvisning av sumoylated kinetochore proteiner, Ndc10 og Ndc80 (figur 1). Den affinitetsrensing protokollen og western blot analyse ved hjelp av anti-Flag antistoff etablere spesifisitet av samspillet mellom HF-Smt3 og målproteiner, som modifiserte proteiner ikke ble oppdaget i kontrollstammen uten HF-Smt3. Bruken av myc-tag på proteinsubstrater validerer nærværet av sumoylated Ndc10 og Ndc80 i HF-Smt3 konjugater. Videre sumoylation av både Ndc10 og Ndc80 ble redusert i nocodazol behandlede celler (figur 1C og 1D). Redusert sumoylation av Ndc10 svar på nocodazol behandlingert, men ikke Ndc80, ble tidligere rapportert av Petit et al. 9. Dette kan skyldes forskjeller i forsøksprotokollen og bruk av en tilpasset anti-SUMO antistoff. Våre resultater for sumoylation av kinetochore underlag tyder på at en lignende protokoll kan brukes til å undersøke andre kandidat SUMO underlag.

For å oppdage ubiquitinering, ble Myc-merket kinetochore proteiner først immunopresipitert og IP-fraksjonene ble undersøkt med anti-Ub antistoff (figur 2). Den rakner mønster av Ndc10 og Ndc80 ble øket når cellene ble behandlet med MG132 å hemme proteasom-funksjonen (figur 2B), som indikerer at disse proteinene er substrater av proteasomet. IP-fraksjonene ikke klarte å oppdage sumoylation av Ndc10 eller Ndc80 i western blot analyse med anti-Flag eller anti-Smt3 antistoff (data ikke vist). Dette kan være på grunn av tekniske årsaker, for eksempel nivåer av sumoylated underlaget i IP-fraksjonen eller interference fra epitop koder. Ytterligere optimalisering av IP-protokollen, slik som konsentrasjon av salter og Western blotting betingelser skal lette deteksjon av multiple PTMs av hvilket som helst protein av interesse. I dag er sumoylation beste oppdaget av HF-Smt3 trekke ned analysen fulgt av vestlige blotter av kandidat SUMO underlag (figur 1).

Flere detaljer påvirke effektiviteten av proteinrensing og evnen til å påvise PTMs. Først bør alle rørene holdes på is for å hemme proteaser, unntatt som spesifisert. For det andre, et 1: 1 forhold er av cellesuspensjon til glassperler kritisk å forstyrre cellene ved vulsten beater og / eller vortex. Cellelyse bør overvåkes ved undersøkelse av cellene under mikroskopet. For det tredje er det svært viktig å forberede et avklart lysat for trekk ned analysen eller IP. Kort eller lavhastighetssentrifugering kan bidra til forurensning av celleavfall i lysatet, og dette påvirker evnen til å Detect den PTMs. Endelig kraftig risting av perlene med et stort volum av klart lysat (ca. 1 ml) i et 1,5 ml mikro- sentrifugerør sikrer at perlene er fullstendig opphengt for å trekke ned analysen eller IP-adresser. Oppsummert proteinrense og deteksjonsteknikker, slik som det som er beskrevet her, gi viktig mekanistiske innsikt i hvordan PTM fra kinetochore proteiner påvirke deres struktur og anordning for trofast kromosom segregering 14, 15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass beads BioSpec Products 11079105 0.5 mm diameter
Mini beadbeater BioSpec Products #693 8 cell disrupter
Ni-NTA superflow Qiagen 30430 100 ml
Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P8215 1 ml
Anti-c-Myc agarose affinity gel antbody produced in rabbit Sigma-Aldrich A7470 1 ml
Monoclonal anti-Flag M2 antibody produced in mouse Sigma-Aldrich F1804 Primary antibody, dilution 1:1,000
c-Myc antibody (A-14) Santa Cruz Biotechnology sc-789 Primary antibody, dilution 1:5,000
Purified mouse antibody monoclonal 9E10 Covance MMS-150P Primary antibody, dilution 1:5,000
Ubiquitin (P4G7) monoclonal antibody Covance MMS-258R Primary antibody, dilution 1:1,000
ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab GE Healthcare Life Sciences NA934V Secondary antibody, dilution 1:5,000
ECL Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab GE Healthcare Life Sciences NA931V Secondary antibody, dilution 1:5,000
DC protein assay Bio-Rad 500-0116
Nitrocellulose membrane Novex LC2001 0.45 mm pore size
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels Novex NP0321BOX 1.0 mm, 10 well
NuPAGE MES SDS Running Buffer Novex NP0002 20x
NuPAGE Transfer Buffer Novex NP0006-1 20x
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate Thermo Scientific 34078
10x PBS pH7.4 GIBCO 70011-044
Blue sensitive X-Ray film Dbio DBOF30003
Automatic developer Kodak M35AX-OMAT
Nocodazole Sigma-Aldrich M1404 50 mg
MG-132 Selleck Chemicals S2619 25 mg

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Johnson, P. R., Hochstrasser, M. SUMO-1: Ubiquitin gains weight. Trends Cell Biol. 7, 408-413 (1997).
  2. Hewawasam, G., et al. Psh1 is an E3 ubiquitin ligase that targets the centromeric histone variant Cse4. Mol Cell. 40, 444-454 (2010).
  3. Ranjitkar, P., et al. An E3 ubiquitin ligase prevents ectopic localization of the centromeric histone H3 variant via the centromere targeting domain. Mol Cell. 40, 455-464 (2010).
  4. Au, W. C., et al. A novel role of the N terminus of budding yeast histone H3 variant Cse4 in ubiquitin-mediated proteolysis. Genetics. 194, 513-518 (2013).
  5. Akiyoshi, B., et al. The Mub1/Ubr2 ubiquitin ligase complex regulates the conserved Dsn1 kinetochore protein. PLoS Genet. 9, e1003216 (2013).
  6. Biggins, S., et al. The conserved protein kinase Ipl1 regulates microtubule binding to kinetochores in budding yeast. Genes Dev. 13, 532-544 (1999).
  7. Cheeseman, I. M., et al. Phospho-regulation of kinetochore-microtubule attachments by the Aurora kinase Ipl1p. Cell. 111, 163-172 (2002).
  8. Liu, D., Lampson, M. A. Regulation of kinetochore-microtubule attachments by Aurora B kinase. Biochem Soc Trans. 37, 976-980 (2009).
  9. Montpetit, B., Hazbun, T. R., Fields, S., Hieter, P. Sumoylation of the budding yeast kinetochore protein Ndc10 is required for Ndc10 spindle localization and regulation of anaphase spindle elongation. J Cell Biol. 174, 653-663 (2006).
  10. Furth, N., et al. Exposure of bipartite hydrophobic signal triggers nuclear quality control of Ndc10 at the endoplasmic reticulum/nuclear envelope. Mol Biol Cell. 22, 4726-4739 (2011).
  11. Li, L., et al. Anaphase-promoting complex/cyclosome controls HEC1 stability. Cell Prolif. 44, 1-9 (2011).
  12. Takahashi, Y., Yong-Gonzalez, V., Kikuchi, Y., Strunnikov, A. SIZ1/SIZ2 control of chromosome transmission fidelity is mediated by the sumoylation of topoisomerase II. Genetics. 172, 783-794 (2006).
  13. Liu, C., Apodaca, J., Davis, L. E., Rao, H. Proteasome inhibition in wild-type yeast Saccharomyces cerevisiae cells. Biotechniques. 42, 158 (2007).
  14. Kitamura, E., Tanaka, K., Kitamura, Y., Tanaka, T. U. Kinetochore microtubule interaction during S phase in Saccharomyces cerevisiae. Genes Dev. 21, 3319-3330 (2007).
  15. Gascoigne, K. E., Cheeseman, I. M. Kinetochore assembly: if you build it, they will come. Curr Opin Cell Biol. 23, 102-108 (2011).
Protein Purification teknikk som gjør at Påvisning av Sumoylation og ubiquitinering av Spirende gjær kinetochore Proteiner Ndc10 og Ndc80
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ohkuni, K., Takahashi, Y., Basrai, M. A. Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80. J. Vis. Exp. (99), e52482, doi:10.3791/52482 (2015).More

Ohkuni, K., Takahashi, Y., Basrai, M. A. Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80. J. Vis. Exp. (99), e52482, doi:10.3791/52482 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter