Introduction
Slimhinnen epitel av mage-tarmkanalen er i konstant fornyelse. Denne prosess er trigget av proliferasjon av tarm stamceller (ISCS) som kontinuerlig produsere avkom til raskt å erstatte den intestinale epitel som det svinger over. Den proliferative rom som omfatter de ISCS er begrenset til bunnen av kryptene. De ISCS gi opphav til avkom som til slutt differensiere i absorberende eller sekretoriske linjene. Beveger seg ut av krypten og på villus eller overflate epitel, cellene differensieres hvert som de vandrer oppover før eksfoliering inn i hulrommet 1. ISCS gi opphav til alle intestinale epitel celletyper, inkludert enterocytter, microfold celler, enteroendocrine celler, slimceller, knippe celler og Paneth celler. Tykktarmen er preget av langstrakte krypter består hovedsakelig av colonocytes og slimceller, med spredt enteroendocrine og bunt celler 2.
Ex vivo Culdige systemer utgjør lovende verktøy for å studere ISC vedlikehold og tarmvevet homeostase. Det er imidlertid vanskelig å stole på vevskultur-teknologier som fysiologiske betingelser ikke er fullstendig gjengitt og epiteliale mikromiljøet ofte endret 3,4. Et stort fremskritt i ISC-feltet var etableringen av vevskulturteknikker å opprettholde og utvide enkelt murine ISCS hjelp av definerte vekstfaktorer for å erstatte den normale tarmnisje signaler. Langtidsdyrkningsbetingelser ble beskrevet av Sato et al., I hvilket enkelt krypter eller isolerte stamceller fra tarmepitelet vokse for å danne 3-dimensjonale strukturer epiteliale inkludert flere krypten-lignende domener 5-7. Disse tridimensional strukturer gjennomgå fisjons hendelser å kontinuerlig utvide. Interessant er alle tarmcelletyper som er spesifikke for vevet opprinnelses produsert og i tillegg blir ekstrudert inn i et hulrom 8. Ved hjelp av modifiseringer av dette systemet, epitelialorganoids kan genereres fra magen, tynntarmen og tykktarmen. Mer spesifikt, epiteliale organoids fra tynntarmen er enteroids 9, og de fra tykktarmen er colonoids 9,10. Disse epiteliale organoid kultursystemer har vært brukt til å teste evnen av isolerte enkeltceller til å fungere som stamceller in vitro, og dermed å teste "stemness" av isolerte celler 5,6,10-15. Andre forskere har brukt både enteroids og colonoids å studere funksjonen av individuelle epitelceller 16-21. Dermed kan enteroid og colonoid kulturer brukes til å evaluere både stilk og ikke-stamcelle funksjoner og gi ny innsikt i grunnleggende cellulære interaksjoner i tarmen.
I 2011 Sato og kolleger generert langsiktig kultur for epitel organoids avledet fra humant tynntarm og tykktarm 22,23. Foruten forskjeller i media sammensetning, de menneskelige epiteliale enteroidsog colonoids stille de samme funksjonene som sin muse motstykke. Videre kan de bli generert fra syke vev som Barretts øsofagus, adenom eller adenokarsinom, og cystisk fibrose 22,24. Menneskelige enteroids utgjør et verdifullt system for å studere tarmstamcelle og epitelial slimhinne biologi og tjene som en roman eksperimentelt system for å studere både normal og unormal gastrointestinal fysiologi tre.
Her beskriver vi metoder for å etablere enteroids og colonoids fra menneskets tynntarm og tykktarm krypter (figur 1). I denne metodisk gjennomgang, vi understreke krypten samling fra hele vev og biopsier. Vi rekapitulere kultur modaliteter som er avgjørende for en vellykket vekst og vedlikehold av menneskelige enteroids og colonoids og mulige eksperimentelle strategier utført av denne modellen.
Protocol
MERK: Etikk Uttalelse: All eksperimentering ved hjelp av menneskelig vev beskrevet her ble godkjent av IRB på CCHMC (IRB # 2012-2858; # 2014-0427). Informert samtykke for vev innsamling, lagring og bruk av prøvene ble hentet fra givere på CCHMC.
1. Forberedelse for kultur
MERK: Alle reagenser er oppført i tabell 1.
- Forbered EDTA stamløsning som følger: forberede 0,5 M etylendiamintetraeddiksyre, pH 8 (EDTA) i ultrarent H2O, filtersterilisert med 0,22 um filter. Eventuelt lagre EDTA stamløsning ved RT ubestemt tid.
- Forbered chelaterende buffer som følger: bland 2% sorbitol, 1% sukrose, 1% bovint serumalbumin fraksjon V (BSA) og 1 x Gentamicin / Amphotericin løsning i Dulbeccos Fosfatbufret saltløsning uten Ca2 + og Mg2 + (DPBS), filtersterilisert med 0,22 mikrometer filter. Klargjør gelaterende buffer frisk.
- Forberede Wnt-3A-kondisjonerte mediet som følger: Wnt-3A-kondisjonerte mediet er gjort i huset ved hjelp av cellelinjen L Wnt-3A i henhold til produsentens instruksjoner (ATCC, CRL-2647). Supplere medium med 2 mM glutamin, 10 mM HEPES, 100 U / ml penicillin, 100 pg / ml streptomycin, 1 N2-supplement, en B27 supplement, 1% BSA og filtersterilisert med 0,22 um filter.
MERK: Test hver batch for Wnt aktivitet ved hjelp av en TOPflash analysen. Bruk en stabil HEK293 TOPflash cellelinje (Hans Clevers lab) med en Renilla luciferase assay kit i henhold til produsentens instruksjoner. Normalisere TOPflash analysen med 100 ng / ml human rekombinant Wnt-3A. Bekrefte minst en 10 fold-endring aktivitet av kondisjonert medium sammenlignet med kontroll. Fordel frisk Wnt-3A kondisjonerte medium i 10 ml porsjoner i 15 ml koniske rør og fryse ved -20 ° C i inntil seks måneder. Butikken tint alikvotene opp til fem dager ved 4 ° C uten tap av aktivitet. - Prepare human minigut medium som følger: Supplement Advanced DMEM / F12-medium med 2 mM glutamin, 10 mM HEPES, 100 U / ml penicillin, 100 g / ml streptomycin, 1 N2-supplement, en B27 supplement, 1% BSA og filtersterilisert med 0.22 mikrometer filter.
MERK: Del friskt menneske minigut medium i 10 ml porsjoner i 15 ml koniske rør og fryse ved -20 ° C i inntil 3 måneder. Butikken tint alikvotene opp til fem dager ved 4 ° C uten tap av aktivitet. - Forberede helt menneske minigut medium som følger: Forbered frisk før krypten kultur eller medium endring menneskelig minigut medium (se 1.4) supplert med 50% Wnt-3A-condition medium (se 1.3), 1 mikrogram / ml R-spondin 1 (1: 1000 fortynning av 1 mg / ml lager), 100 ng / ml Noggin (1: 1000 fortynning av 100 g / ml stock), 50 ng / ml EGF (1: 10.000 fortynning på 500 pg / ml stock), 500 nM A-83 -01 (1: 1000 fortynning av 500 M lager), 10 uM SB202190 (1: 3000 fortynning av 30 mM stock), 10 nM [leu] 15-Gastrin 1 (1: 10.000 fortynning av 100 pMstock), 10 mM nikotinamid (1: 100 fortynning på 1 M stam) og 1 mM N-acetylcystein (1: 1000 fortynning av 1 M stam).
MERK: Oppbevar fullstendige menneskelige minigut media opp til 2 dager ved 4 ° C uten tap av aktivitet.
2. Crypt Isolasjon fra Whole Tissue
MERK: Fra vevssamling, er det viktig å opprettholde prøven i saltoppløsning. Det anbefales å holde vevet på is under transport. Fremstilling av prøven for isolering av krypten bør utføres så snart som mulig.
MERK: Alle reagenser er oppført i tabell 1, verktøy, utstyr og forbruksvarer er oppført i Tabell 2.
- Forberede alle reagenser før du starter eksperimentet. Tine basalmembranmassen på is og pre-inkubere en 24-brønners plate i en CO2-inkubator ved 37 ° C.
MERK: Alternativt kan foreta et tynt lag av basalmembranmassen ved anvendelse av 15 ul / brønn i sentrum av en 24-godt plate og legg den i en CO 2 inkubator ved 37 ° C. Denne fakultative trinn holder basalmembran matriks som en dråpe i løpet av polymeriseringen. - Vask vev med iskald Dulbeccos Fosfatbufret saltvann uten Ca 2+ og Mg 2+ (DPBS). Fortsett til innholdet i DPBS er klart.
- Ved hjelp av 0,2 mm diameter minutien pins, sikre vevet på en silikonbelagt glass petriskål fylt med iskalde DPBS. Strekk og pin vevet flat med slimhinnesiden opp.
- Under en disseksjonsmikroskop, fjerne den overliggende slimhinne fra submukosa og bindevev bruker mikro-dissekere saks og fine punkt buede tang (Figur 2A, B).
- Strekk og pin den dissekert slimhinnen flatt på silikonbelagt glass petriskål med slimhinnesiden opp. Den gjenværende submucosa og bindevev kan kastes eller brukes for videre eksperimenter (figur 2C).
- Forsiktigskrape overflaten av mucosa med buet pinsett. Dette trinnet er nødvendig for å forbedre kvaliteten av preparatet.
- For tynntarm, forsiktig skrape slimhinnene å fjerne villi.
- For kolon, forsiktig skrape slimhinnen å fjerne slim og rusk.
- Vask slimhinnen 3-4 ganger med iskald chelation buffer for å fjerne villi og rusk.
- Dekk slimhinnen med nylagde 2mM EDTA chelation buffer (200 mL 0,5 M EDTA i 49,6 ml chelation buffer).
- Plasser petriskål på is og riste forsiktig i 30 min på en horisontal orbital shaker.
- Vask vev 3-4 ganger med iskald chelation buffer uten EDTA. Etter vask, la slimhinnene i iskald chelation buffer.
- Behandle slimhinnen under et disseksjonsmikroskop bruker buede og fin pinsett. Forsiktig skrape slimhinnene å frigjøre tarm krypter ved hjelp av de buede tang.
- Fjerne krypten suspensjon forsiktig fra petriskålen ved hjelp av en pipette og overføre den til et 50 ml konisk rør.
MERK: sjekk vevet for å være sikker på at nesten alle krypter har blitt fjernet fra slimhinnen. - Filtrer den krypter suspensjonen gjennom en 150 um mesh to ganger.
MERK: sjekk gjennomstrømning for krypten berikelse under et mikroskop (figur 2D). - Sentrifuger suspensjonen krypten 5 minutter ved 50 x g, 4 ° C. Kast supernatanten.
- Resuspender pelleten i 5 ml iskald buffer chelatering.
- Tell antall krypter per 10-mL dråpe fra suspensjon fra trinn 2.15. Overfør antall krypter trengs for plating til en 5 ml rundbunnet rør. Bruk 200 til 500 krypter pr brønn i en 24-brønners skål for å etablere enteroids eller colonoids.
- Sentrifuger krypten fraksjonen i 10 minutter ved 150 g, 4 ° C. Fjern supernatanten.
- Bruk krypter for påfølgende kultur.
3. Crypt Isolasjon fra Biopsi
- Forberede alle reagenser førbegynnelsen av eksperimentet. Tine basalmembranmassen på is og pre-inkubere en 24-brønners plate i en CO2-inkubator ved 37 ° C.
- Vask biopsi med iskald Dulbeccos Fosfatbufret saltvann uten Ca 2+ og Mg 2+ (DPBS).
- Ved hjelp av 0,1 mm diameter minutien pins, sikre biopsi på en silikonbelagt glass petriskål fylt med iskalde DPBS. Strekk og pin slimhinnen flat med slimhinnesiden opp (figur 2E).
- Forsiktig å skrape overflaten av mucosa med buet pinsett for å fjerne villi og rusk. Dette trinnet er nødvendig for å forbedre kvaliteten av preparatet.
- Vask biopsi 3-4 ganger med iskald chelation buffer for å fjerne villi og rusk.
- Dekk biopsi med nylagde 2mM EDTA chelation buffer (200 mL 0,5 M EDTA i 49,8 ml chelation buffer).
- Plasser petriskål på is og riste forsiktig i 30 min på en horisontal orbital shaker. <li> Vask biopsi 3-4 ganger med iskald chelation buffer uten EDTA. Etter vask, la biopsi i iskald chelation buffer.
- Behandle biopsi under et disseksjonsmikroskop bruker buede og fin pinsett. Forsiktig skrape slimhinnene å frigjøre tarm krypter bruker buede tang.
- Fjern forsiktig krypten suspensjon fra petriskålen ved hjelp av en pipette og overføre den til en 50 ml konisk tube.
MERK: sjekk vevet for å være sikker på at nesten alle krypter har blitt fjernet fra slimhinnen. - Filtrer krypten suspensjonen gjennom en 150 pm nylonnett to ganger.
MERK: sjekk gjennomstrømning for krypten berikelse under et mikroskop. - Sentrifuger suspensjonen krypten 5 minutter ved 50 x g, 4 ° C. Kast supernatanten.
- Resuspender pelleten i 1 ml iskald buffer chelatering. Overfør krypten suspensjonen til et 1,5 ml mikrosentrifugerør.
- Sentrifuger krypten fraksjonen i 10 minutter ved 150 x g, 4 ° C. Fjern supernatanten. </ Li>
- Bruk krypter for påfølgende kultur.
4. Crypt Kultur i basalmembran Matrix
- Ved hjelp av pre-kjølt pipettespisser, suspender krypten pellet (fra trinn 2.18 eller 3.15) i kjelleren membran matrise (200 til 500 krypter / 50 mikroliter basalmembran matrix).
- Påfør 50 mL av krypten suspensjon i kjelleren membran matrise per brønn på forvarmet plate. Sakte løse ut basalmembran matriks i sentrum av brønnen.
- Plasser 24-brønners plate i en 37 ° C, 5% CO2-inkubator i 30 minutter for å tillate en fullstendig polymerisering av basalmembranmassen.
- Overlegg kjelleren membran matrise med 500 mL av helt menneske minigut medium supplert med 2,5 mikrometer CHIR99021 (1: 4000 fortynning av 10 mM lager) og 2,5 mikrometer Thiazovivin (1: 4000 fortynning av 10 mM lager).
- Inkuber platen i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator.
- Erstatte mediet med frisk komplett Human minigut mellom hver 2 dager.
5. aging av Cultured Enteroids og Colonoids.
MERK: Passage Enteroids og Colonoids hver 7 til 10 dager etter første platekledning. Vanligvis deles ett godt inn 3 til 4 brønner.
- Forberede alle reagensene før begynnelsen av forsøket. Tine basalmembranmassen på is og pre-inkubere en 24-brønners plate i en CO2-inkubator ved 37 ° C.
- Fjern materialet ved hjelp av sterile tips og overlay med 1 ml iskald DPBS.
- Pipette frem og tilbake med en 1000 mL tips. Overfør løsningen i en ny 15 ml konisk rør.
- Tilsett 2 ml av menneskelig minigut medium supplert med 5% FBS per 1 ml medium.
- Sentrifuger oppløsningen i 5 minutter ved 50 x g, 4 ° C. Kast supernatanten.
- Resuspender pelleten med 2 ml av celledissosieringsmedium enzym supplert med 10 uM Y-27632 (1: 1000 fortynning av 10 mM stock). Inkuber i 5 mi ved 37 ° C i et vann-bad.
- Dissosiere de celleklumper ved hjelp av en 3 ml Luer-Lock sprøyte utstyrt med en 18-G fylle- / butt nål. Forsiktig pipettere løsningen frem og tilbake ved hjelp av sprøyten 10 ganger.
- Sentrifuger suspensjonen i 5 min ved 500 x g, 4 ° C. Kast supernatanten.
- Ved hjelp av pre-kjølt pipettespisser, cellepelleten suspenderes i kjelleren membran matrise.
- Påfør 50 mL av krypten suspensjon i kjelleren membran matrise per brønn på forvarmet plate. Sakte løse ut basalmembran matriks i sentrum av brønnen.
- Plasser 24-brønners plate i en 37 ° C, 5% CO2-inkubator i 20 minutter for å tillate en fullstendig polymerisering av basalmembranmassen.
- Overlappe basalmembran matrise med 500 pl av komplett humant minigut medium supplert med 10 uM Y-27 632 (1: 1000 fortynning av 10 mM stock).
- Inkuber platen i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator.
- Etter to dager, Erstatte mediet med friskt komplett humant minigut medium supplert med 10 uM Y-27 632 (1: 1000 fortynning av 10 mM stock). Deretter erstatte mediet med friske, helt menneske minigut medium annenhver dag.
6. Frysing av Cultured Enteroids og Colonoids
MERK: Vanligvis fryse ett godt inn 2-3 cryovials.
- Gjenta trinn 05.01 til 05.08.
- Resuspender pelleten med kald frysemedium. Overføring 1 ml iskaldt oppløsning i en merket kryoampulle. Plasser kryoampulle i en frysebeholder inneholdende 500 ml isopropylalkohol.
- Overfør frysebeholderen til en 80 ° C fryser i 24 timer, og deretter overføre kryoampulle til flytende nitrogen lagring.
MERK: Oppbevar Enteroids og Colonoids for inntil 1 år.
Representative Results
Figur 2D viser et typisk eksempel på en nylig isolerte krypter fra hele vev (figur 2D). Antall krypter isolert fra en biopsi er lavere enn i hele vev. Ved hjelp av standard kapasitet biopsitang med nål, vi vanligvis utfører to biopsi biter på én omgang. Hver biopsi bite resulterer i en 10 mm 2 overflate med et gjennomsnitt på 50 til 100 krypter pr biopsi (figur 2F).
Etter kultur i kjelleren membran matrise, krypter runde opp å danne enterospheres for tynntarmen og colonospheres for kolon. Krypten spirende vanligvis skjer innen 5 til 6 dager, etter seeding. Men det er ikke uvanlig å se enten enteroids (enteroids) eller colonoids (colonoids) danner kuler i kjelleren membran matrise (figur 3A-C, Movie 1). Den passaging kan gjøres etter 7 dager, avhengig av størrelsen på enteroids. Den enteroids eller colonoids etablished fra biopsier gjennomgå den samme utviklingen i kultur. Men som krypten tetthet ved poding er lavere, aging gjøres vanligvis etter 10 til 12 dager i kultur (figur 4a, b). Enteroids og colonoids kulturer ekspandere i en reproduserbar måte.
Begge enteroids og colonoids presentere en luminal side og er foret med et epitel (Figur 5A, B). Proliferative celler kan observeres innenfor enteroids og ligger innenfor bud tips (figur 5C, D). Konfokal avbildning av enteroids farget med E-cadherin (ECAD) viser epitelceller (figur 5E).
Begge enteroids og colonoids kan etableres fra vev oppnådd fra pasienter med genetiske / medfødte lidelser. Figur 6 viser representative enteroids vokser fra en pasient med cystisk fibrose (figur 6A) og et tufte enteropati på grunn av en medfødt mutasjon i epithelial cell adhesion molekyl genet (EpCAM) (figur 6B). Foruten den genetiske defekten, gjør enteroids ikke viser forskjeller i basal tilstand.
Figur 1. Arbeidsflyt av krypter dissosiasjon og generering av menneskelige enteroids og colonoids i kultur. Crypts (fra menneskelig tynntarmen eller tykktarmen) er isolert av EDTA chelation. Dyrkede krypter danne enteroids for tynntarmen og colonoids for kolon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Disseksjon fremgangsmåte for krypt isolasjon. (A) tynntarm specimen er strukket og festet flatt inn i en silikonbelagt petriskål. (B) Den mukosa er adskilt fra den underliggende submucosa. (C) Den dissekert slimhinnen blir strukket og festet flatt inn i en silikonbelagt petriskål. (D) Når EDTA chelatering, blir krypter isolert fra vevet. (E) En biopsi er strukket og festet flatt inn i en silikonbelagt petriskål. (F) Etter EDTA chelation, krypter er isolert fra biopsi. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Crypt kultur og menneskelig enteroid og colonoid generasjon fra hele vev. (A) jejunal krypter belagt i kjelleren membran matrise etter isolasjon. Krypter lukker etter 3 til 4 timer og begynner å ballongen opp å danne enterospheres utover denne tiden. På 7 dager, er de jejunale enteroids dannet. (B) Etter isolering og kultur, ileale krypter oppføre seg som de jejunale krypter og danne ileale enteroids. (C) Colonic krypter blir sådd ut i basalmembranmassen etter isolering. Krypter nære og skjema colonoids etter 7 dager (Scale barer: 100 mikrometer). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Crypt kultur og menneskelig enteroid og colonoid generasjon fra biopsi. (A) duodenal krypter belagt i kjelleren membran matrise etter isolasjon. Krypter lukker etter 3 til 4 timer og starter til ballongen opp beyond denne tid til å danne enterospheres. På 7 dager, er enteroids dannet. (B) Etter isolering og kultur, er kryptene i kolon belagt i basalmembran matrise. Krypter lukke opp for å danne colonospheres deretter colonoids etter 7 dager (Scale barer: 100 mikrometer). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Tarm linjer av de menneskelige enteroids. (A) Menneskelig enteroid etter 6 dager i kultur. (B) Hematoxylin-eosin deler av enteroids i (A) demonstrere epitelbelegg (Scale barer: 100 mikrometer). (CD) Confocal avbildning av enteroids etter EDU-farging (magenta) viser tilstedeværelsen av proliferative celler. (E Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. Crypt kultur og menneskelig enteroid generasjon fra sykt vev. (A) Enteroids etablert fra en cystisk fibrose prøven. (B) Enteroids etablert av en medfødt tufte enteropathy prøven (Scale barer: 100 mikrometer). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Movie 1. Enterosphere forming menneskelig enteroid i kultur. 32 timers tids rundere filmen viser en enterosphere etablert fra menneskelig tynntarmen trekke til å danne en enteroid i kultur. Klikk her for å se denne videoen.
| Navn av Reagens | Selskap | Catalog Number | Løsemiddel | Stock Konsentrasjon | Endelig Konsentrasjon | Kommentar |
| Dulbeccos Fosfatbufret saltvann Ca 2+, Mg 2+ gratis (DPBS) | Life-teknologi; Gibco | 14190-144 | - | - | 1x | |
| Etylen tetraeddiksyre (EDTA) | Sigma-Aldrich | 431788 | Ultra dH 2 O | 2 mm | ||
| Sorbitol | Fischer Scientific | BP439-500 | DPBS | Pulver | 2% | |
| Sukrose | Fischer Scientific | BP220-1 | DPBS | Pulver | 1% | |
| Bovint serumalbumin (BSA) fraksjon V | Fischer Scientific | BP1600-100 | DPBS | Pulver | 1% | |
| Gzntamycin / Amphotericin B-løsning | Life-teknologi; Gibco | R-015-10 | - | 500x | 1x | |
| Wnt-3A conditionned medium | i huset | - | - | - | - | |
| Avansert DMEM / F12 | Life-teknologi; Gibco | 12634-028 | - | - | - | |
| HEPES 1M | Life-teknologi; Gibco | 15630-080 | - | 1 M | 10 mm | |
| Glutamax (glutamin) | Life-teknologi; Gibco | 35050-061 | - | 100X | 1X | |
| Penicillin-Streptomycin (10 000 U / ml) | Life-teknologi; Gibco | 15140-148 | - | 100X | 1X | |
| N2 Supplement | Life-teknologi; Gibco | 17502-048 | - | 100X | 1X | |
| B27 Supplement | Life-teknologi; Gibco | 17504-044 | - | 50X | 1X | |
| N-acetylcystein | Sigma-Aldrich | A9165-5G | DPBS | 1 M | 1 mm | </ Td> |
| Nicotidamide | Sigma-Aldrich | N0636 | DPBS | 1 M | 10 mm | |
| Matrigel, GFR, Fenol gratis (basalmembran matrix) | Corning | 356231 | - | - | - | NØDVENDIG |
| humant rekombinant Noggin | R & D | 6057-NG / CF | DPBS | 100 pg / ml | 100 ng / ml | Andre leverandører: R & D; AnaSpec og Preprotech |
| humant rekombinant R-Spondin | Preprotech | 120-38 | DPBS | 1 mg / ml | 1 pg / ml | |
| humant rekombinant EGF | Sigma-Aldrich | E9644-.2MG | DBPS | 500 pg / ml | 50 ng / ml | |
| Y-27632 | Sigma-Aldrich | Y0503-1MG | DPBS | 10 mm | 10 mikrometer | |
| A-83-01 | Tocris | 2939 | DMSO | 500 mikrometer | 500 nM | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067-5MG | DMSO | 30 mM | 10 mikrometer | |
| menneskelig [Leu] 15-Gastrin 1 | Sigma-Aldrich | G9145-.1MG | DPBS | 100 mikrometer | 10 nM | |
| CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | DMSO | 10 mm | 2,5 mikrometer | |
| Thiazovivin | Stemgent | 04-0017 | DMSO | 10 mm | 2,5 mikrometer | |
| TrypLE Express Enzym (1X), fenol rød (celledissosiasjon enzym) | Life-teknologi; Gibco | 12605-010 | - | - | - | For aging |
| Føtalt bovint serum | Life-teknologi; Gibco | 10082-147 | - | - | - | For aging |
| CTS Synth-a-Freeze Medium (frysing medium) | Life-teknologi; Gibco | A13713-01 | - | - | - | For frysing |
| L Wnt-3A cellelinje | ATCC | CRL-2647 | - | - | - | Wnt-3A conditionned medieproduksjon |
| Renilla luciferase assay | Promega | E2710 | - | - | - | Wnt-3A conditionned media aktivitet |
| humant rekombinant Wnt-3A | R & D | 5036-WN / CF | DPBS | 100 pg / ml | 100 ng / ml | |
| HEK293 TOPflash cellelinje | - | - | - | - | - | Wnt-3A conditionned media aktivitet; Gave fra Hans Clevers laboratorium |
Tabell 1. Detaljert reagent liste med foretrukne produsent og katalognummer.
| Utstyr | Forbruks | Verktøy |
| Laminær hette | 15- og 50 ml koniske rør | Dumont # 5 standard tang (FST; # 11251-20) |
| CO 2 Incubator | Mikrofugerør | Dumont # 7, buede fine tang (FST; # 11274-20) |
| Stereo-mikroskop | 24-brønners plater | Fin saks (FST; # 14060-09) | 0,22 mikrometer filter (Sartorius) | Vännäs våren saks (FST; # 15018-10) |
| Orbitalrister | Serologiske pipetter | 0,2 mm diameter minutien pins (FST; # 26002-20) |
| Frysing container (Nalgene) | Mikropipette tips | 0,1 mm diameter minutien pins (FST; # 26002-10) |
| Sylgard 184 Silikon (Dow Corning) | 150 mikrometer mesh åpninger, nylon screening (Dynamic Aqua-forsyning) | |
| Glass petriskål | 5 ml rundbunnet polypropylenrør (Falcon) | |
| Serologisk pipette | 18G sløv fill nål (BD) | |
| Mikropipette | 3 ml lsyringes med Luer-Lock-tips (BD) | |
| Cryovials |
Discussion
Denne metoden gir et komplett system reprodusere intestinale epitelceller i rett linje og epiteliale dynamikk som utgjør et nyttig verktøy for å studere intestinal epithelial biologi. Metoden som presenteres her var tilpasset fra den opprinnelige murine studie av Sato og Clevers 22 som effektivt resulterer i menneskelige enteroids og colonoids. Her plukket vi manuelt opp krypter ved mikrodisseksjon å unngå eventuelle cellulære forurensninger. Denne fremgangsmåte tillater en direkte visualisering av krypter og fører til konsistens overtid i forhold til den opprinnelige krypt samling ved "riste". Andre grupper utviklet lignende teknikk ved hjelp av litt forskjellige tilnærminger spesielt erstatte den chelation av EDTA med kollagenase 25. I tillegg til forskjellene i krypten samling, disse teknikk bruker et definert medium som er nødvendig for å dyrke humane enteroids i kultur 22. For å øke veksten effektivitet ved krypten seeding, vi legger en GSK3p inhibitor (CHIR99021)for de to første dagene 12.
Håndteringen av vevet eller biopsi er viktig og krypten isolering bør utføres så snart som vevet kommer i laboratoriet. Imidlertid kunne forsinket krypt isolasjon og kulturen utføres opp til 24 timer etter innsamling vev (data ikke vist) som tidligere beskrevet for murine vev 26. Tarmvevet bør plasseres i et konisk rør helt fylt med DPBS for å unngå avbrudd vev, og bør opprettholdes ved 4 ° C. Den forsinkede forberedelse tillater vev frakt men temperaturvariasjoner bør unngås under transport. Den totale tid som er nødvendig for den første krypten plette er omtrent 2 timer med 15 til 30 min for å behandle vev og 1 til 2 timer for å isolere og plate krypten. Den mikrodisseksjon av vevet er en kritisk determinant og predikat av en ren krypt preparat. Det er imidlertid mulig krypten utgivelsen av håndhils som beskrevet i ulike protokoller 22,23.
Til tross for likhetene med den murine enteroid (enteroids) system, de menneskelige enteroids krever spesifikke molekyler til å forbedre og opprettholde sin vekst over tid. Vekstfaktorer, er EGF Noggin, R-spondin anvendes på lignende måte til de murine epiteliale organoids. Imidlertid er bruken av Wnt-3A kritisk. Vi har lagt merke til at dannelsen så vel som veksteffektiviteten er større ved bruk av en Wnt 3A-kondisjonert medium enn den humane rekombinante protein. Samtidig, demonstrerte vi forbedrede dyrkingsbetingelser ved bruk av en inhibitor av glykogen syntase kinase 3 (CHIR99021) 12. Rekombinante vekstfaktorer kunne erstattes av Wnt-3A, R-spondin, og Noggin aircondition-media. En Wnt-3A-uttrykkende L-cellelinje er kommersielt tilgjengelig (ATCC). Andre grupper har utviklet R-spondin 1- 23,27, Noggin- 19, og Wnt-3A / R-spondin3 / Noggin- 28 uttrykker cellelinjer. To lavmolekylære inhibitorer benyttes i kultur megdia og er nødvendige for opprettholdelse av kulturen 29. A-83 til 01 er en selektiv inhibitor av transformerende vekstfaktor-β og aktivin / nodal-reseptorer (aktivin-lignende kinase 4, 5, 7) og SB202190 er et p38-mitogen-aktivert protein kinase inhibitor (MAPK). Begge hemmere har blitt brukt henholdsvis å opprettholde menneskeskapte pluripotent stamceller selvfornyelse og å etablere menneskelige naive pluripotente stamceller 30-32. Også, nikotinamid, en forløper for nikotinamidadenindinukleotid, er nødvendig for å opprettholde enteroids og colonoids ekspansjon i en langsiktig måte 22,29.
EDTA chelation er et viktig skritt som den bestemmer utbyttet fra krypten forberedelse. Vi har vært vellykket med 2 mM EDTA-behandling. Imidlertid kan EDTA-konsentrasjonen endres fra 2 mM til 15 mM med hensyn til typen av vev. I dette tilfelle har inkubasjonstiden som skal bestemmes empirisk. Etter den første plating, vil krypten runde-up og til slutt danne enteroids. Men enteroids eller colonoids ofte demonstrere en "stamme" fenotype ved å danne kuler med liten eller ingen differensierte celler. I dette tilfelle kan differensiering initieres ved å trekke tilbake Wnt-3A, nikotinamid og p38 MAPK-inhibitor. Bruken av Notch inhibitor som DAPT eller DBZ hjelper øke differensieringen innenfor enteroids 22.
Denne modellen rekapitulerer tarm fysiologi med stadige krypten-spirende hendelser som oppstår fra en stamcelle samt villus-lignende epiteliale domener som inneholder både absorberende og sekretoriske differensiert linjene. Interessant, dette systemet inneholder ingen mesenkymalceller og bruker spesifikke medie forhold til å møte kravene til nisje signal.
Som den murine modellen, kan humane enteroids bli generert fra isolerte intestinale epitelceller for å teste evnen til disse cellene for å fungere som en stamcelle. Several studier har brukt klynge av differensiering markører (CD44, CD24 eller CD166) og EPHB2 positive celler for å berike for celler med stilk egenskaper 12,23,33. Sammen utgjør disse studiene viser nytten av menneskelige enteroids kulturer for å teste stemness. Andre forskere bruker denne modellen til å undersøke tarmsykdommer som smittsomme diarésykdommer, cystisk fibrose, eller kolorektal kreft 22,34-37. Disse studiene viser at menneskelige enteroids utgjør en pålitelig menneskelig sykdom modell med mulighet for å bevege seg mot en personlig screening. Menneskelige enteroids kan genmodifisert ved hjelp av DNA transfeksjon eller infeksjon med viruspartikler 38. Dette gir et kraftig verktøy for å studere genspesifikke funksjoner innenfor de menneskelige epiteliale organoids eller riktige genetiske mutasjoner. Nylig, Schwank og kolleger demonstrerte muligheten til å redigere genomet med CRISPR / Cas9 system og korrigere mutasjon på CFTR genet forårsaker acystic fibrose 24. Menneskelige enteroids utgjør et verdifullt system for å studere tarmstamcelle og epitelial slimhinne biologi og tjene som en roman eksperimentelt system for å studere både normal og unormal gastrointestinal fysiologi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Phosphate buffered saline Ca2+, Mg2+ free (DPBS) | Life technologies; Gibco | 14190-144 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | 431788 | |
| Sorbitol | Fischer Scientific | BP439-500 | |
| Sucrose | Fischer Scientific | BP220-1 | |
| Bovine serum albumin (BSA) Fraction V | Fischer Scientific | BP1600-100 | |
| Gzntamycin/Amphotericin B solution | Life technologies; Gibco | R-015-10 | |
| Wnt-3A conditioned medium | in house | ||
| Advanced DMEM/F12 | Life technologies; Gibco | 12634-028 | |
| HEPES 1M | Life technologies; Gibco | 15630-080 | |
| GlutaMAX (glutamine) | Life technologies; Gibco | 35050-061 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life technologies; Gibco | 15140-148 | |
| N2 Supplement | Life technologies; Gibco | 17502-048 | |
| B27 Supplement | Life technologies; Gibco | 17504-044 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
| Nicotidamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Matrigel, GFR, Phenol free (basement membrane matrix) | Corning | 356231 | |
| human recombinant Noggin | R&D | 6057-NG/CF | |
| human recombinant R-Spondin | Preprotech | 120-38 | |
| human recombinant EGF | Sigma-Aldrich | E9644-.2MG | |
| Y-27632 | Sigma-Aldrich | Y0503-1MG | |
| A-83-01 | Tocris | 2939 | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067-5MG | |
| human [Leu]15-Gastrin 1 | Sigma-Aldrich | G9145-.1MG | |
| CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | |
| Thiazovivin | Stemgent | 04-0017 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red (cell dissociation enzyme) | Life technologies; Gibco | 12605-010 | |
| Fetal Bovine Serum | Life technologies; Gibco | 10082-147 | |
| CTS Synth-a-Freeze Medium (freezing medium) | Life technologies; Gibco | A13713-01 | |
| L Wnt-3A cell line | ATCC | CRL-2647 | |
| Renilla luciferase assay | Promega | E2710 | |
| human recombinant Wnt-3A | R&D | 5036-WN/CF | |
| HEK293 TOPflash cell line |
References
- Noah, T. K., Donahue, B., Shroyer, N. F. Intestinal development and differentiation. Exp Cell Res. 317 (19), 2702-2710 (2011).
- Shroyer, N. F., Kocoshis, S. Pediatric Gastrointestinal and Liver Diseases. Hyams, J. R. W. III , Elsevier. 324-336 (2010).
- Leushacke, M., Barker, N. Ex vivo culture of the intestinal epithelium: strategies and applications. Gut. , (2014).
- Simon-Assmann, P., Turck, N., Sidhoum-Jenny, M., Gradwohl, G., Kedinger, M. In vitro models of intestinal epithelial cell differentiation. Cell Biol Toxicol. 23 (4), 241-256 (2007).
- Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Mahe, M. M., et al. Establishment of Gastrointestinal Epithelial Organoids. Current Protocols in Mouse Biology. 3, 217-240 (2013).
- Sato, T., Clevers, H. Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).
- Stelzner, M., et al. A nomenclature for intestinal in vitro cultures. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302 (12), G1359-G1363 (2012).
- Ramalingam, S., Daughtridge, G. W., Johnston, M. J., Gracz, A. D., Magness, S. T. Distinct levels of Sox9 expression mark colon epithelial stem cells that form colonoids in culture. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302 (1), G10-G20 (2012).
- Furstenberg, R. J., et al. Sorting mouse jejunal epithelial cells with CD24 yields a population with characteristics of intestinal stem cells. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 300 (3), G409-G417 (2011).
- Wang, F., et al. Isolation and Characterization of Intestinal Stem Cells Based on Surface Marker Combinations and Colony-Formation Assay. Gastroenterology. , (2013).
- Yan, K. S., et al. The intestinal stem cell markers Bmi1 and Lgr5 identify two functionally distinct populations. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (2), 466-471 (2012).
- Es, J. H., et al. Dll1+ secretory progenitor cells revert to stem cells upon crypt damage. Nat Cell Biol. 14 (10), 1099-1104 (2012).
- Yui, S., et al. Functional engraftment of colon epithelium expanded in vitro from a single adult Lgr5(+) stem cell. Nat Med. 18 (4), 618-623 (2012).
- Durand, A., et al. Functional intestinal stem cells after Paneth cell ablation induced by the loss of transcription factor Math1 (Atoh1). Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (23), 8965-8970 (2012).
- Sato, T., et al. Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts. Nature. 469 (7330), 415-418 (2011).
- Akcora, D., et al. The CSF-1 receptor fashions the intestinal stem cell niche. Stem Cell Res. 10 (2), 203-212 (2013).
- Farin, H. F., Van Es, J. H., Clevers, H. Redundant sources of Wnt regulate intestinal stem cells and promote formation of Paneth cells. Gastroenterology. 143 (6), 1518-1529 (2012).
- Rothenberg, M. E., et al. Identification of a cKit(+) colonic crypt base secretory cell that supports Lgr5(+) stem cells in mice. Gastroenterology. 142 (5), 1195-1205 (2012).
- Lau, W., et al. Peyer's patch M cells derived from Lgr5(+) stem cells require SpiB and are induced by RankL in cultured 'miniguts. Mol Cell Biol. 32 (18), 3639-3647 (2012).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Jung, P., et al. Isolation and in vitro expansion of human colonic stem cells. Nat Med. 17 (10), 1225-1227 (2011).
- Schwank, G., et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).
- VanDussen, K. L., et al. Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays. Gut. , (2014).
- Fuller, M. K., et al. Intestinal stem cells remain viable after prolonged tissue storage. Cell Tissue Res. 354 (2), 441-450 (2013).
- Ootani, A., et al. Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche. Nat Med. 15 (6), 701-706 (2009).
- Miyoshi, H., Ajima, R., Luo, C. T., Yamaguchi, T. P., Stappenbeck, T. S. Wnt5a potentiates TGF-beta signaling to promote colonic crypt regeneration after tissue injury. Science. 338 (6103), 108-113 (2012).
- Koo, B. K., Clevers, H. Stem Cells Marked by the R-Spondin Receptor Lgr5. Gastroenterology. , (2014).
- Li, W., et al. Generation of rat and human induced pluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors. Cell Stem Cell. 4 (1), 16-19 (2009).
- Tojo, M., et al. The ALK-5 inhibitor A-83-01 inhibits Smad signaling and epithelial-to-mesenchymal transition by transforming growth factor-beta. Cancer Sci. 96 (11), 791-800 (2005).
- Gafni, O., et al. Derivation of novel human ground state naive pluripotent stem cells. Nature. 504 (7479), 282-286 (2013).
- Gracz, A. D., et al. Brief report: CD24 and CD44 mark human intestinal epithelial cell populations with characteristics of active and facultative stem cells. Stem Cells. 31 (9), 2024-2030 (2013).
- Foulke-Abel, J., et al. Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract. Exp Biol Med (Maywood). , (2014).
- Dekkers, J. F., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nat Med. 19 (7), 939-945 (2013).
- Kovbasnjuk, O., et al. Human enteroids: preclinical models of non-inflammatory diarrhea. Stem Cell Res Ther. 4, Suppl 1. S3 (2013).
- Fujii, M., Sato, T. Culturing intestinal stem cells: applications for colorectal cancer research. Front Genet. 5, 169 (2014).
- Koo, B. K., Sasselli, V., Clevers, H. Retroviral gene expression control in primary organoid cultures. Curr Protoc Stem Cell Biol. 27 (Unit 5A), 6 (2013).
