Introduction
De voering epitheel van het maagdarmkanaal in constante vernieuwing. Dit proces wordt veroorzaakt door proliferatie van intestinale stamcellen (ISC) die continu produceren nakomelingen snel vervangen darmepitheel als het omdraait. De proliferatieve compartiment dat de ISCs beperkt tot de bodem van de crypten. De ISC leiden tot nakomelingen die uiteindelijk differentiëren in absorptieve of secretoire lijnen. Verhuizen van de crypte en op de villus of oppervlakte-epitheel, cellen differentiëren naarmate ze migreren naar boven voordat afschilfering in het lumen 1. ISC's aanleiding geven tot alle intestinale epitheliale celtypen met inbegrip van enterocyten, microfold cellen, entero-endocriene cellen, bekercellen, tuft cellen en Paneth cellen. De dikke darm wordt gekenmerkt door langgerekte crypten voornamelijk samengesteld uit colonocyten en bekercellen, met verspreide enteroendocrine en tuft cellen 2.
Ex vivo cultuur systemen vormen veelbelovend instrument voor het bestuderen van ISC onderhoud en darmweefsel homeostase. Het is echter moeilijk te vertrouwen op weefselkweek technieken fysiologische omstandigheden niet volledig gereproduceerd en de epitheliale micro vaak veranderd 3,4. Een grote vooruitgang in ISC gebied was de oprichting van weefselkweek technieken te onderhouden en uit te breiden individuele muizen ISC's met behulp van gedefinieerde groeifactoren aan de normale intestinale niche signalen vervangen. Langdurig kweekomstandigheden werden door Sato et al., Waarin één crypten of geïsoleerde stamcellen van het darmepitheel wel 3-dimensionale epitheelstructuren waaronder multiple crypte-achtige domeinen 5-7 vormen. Deze driedimensionale structuren ondergaan kernsplijting gebeurtenissen om continu uit te breiden. Interessant alle intestinale celtypes specifiek aan het weefsel van oorsprong worden geproduceerd en ook geëxtrudeerd in een lumen 8. Met modificaties van dit systeem epithelialeorganoids kunnen uit de maag, dunne darm en colon. Meer specifiek epitheliale organoids van de dunne darm enteroids 9 en die van de dikke darm colonoids 9,10. Deze epitheelcellen organoïde kweeksystemen werden gebruikt om het vermogen van geïsoleerde enkele cellen gefunctioneerd als stamcellen in vitro, waardoor het testen van de "stemness" van geïsoleerde cellen 5,6,10-15 testen. Andere onderzoekers hebben zowel enteroids en colonoids gebruikt om de functie van afzonderlijke epitheelcellen 16-21 bestuderen. Aldus kunnen enteroid en colonoid culturen worden gebruikt om zowel stam als niet-stamcellen functies uitwerken en geven nieuw inzicht in fundamentele cellulaire interacties in de darmen.
In 2011, Sato en collega's gegenereerd op lange termijn de cultuur van epitheliale organoids afkomstig van menselijke dunne darm en dikke darm 22,23. Naast verschillen in media samenstelling, de menselijke epitheliale enteroidsen colonoids vertonen dezelfde kenmerken als hun muizen tegenhanger. Bovendien kunnen ze worden gegenereerd uit zieke weefsels zoals Barrett-slokdarm, adenoom of adenocarcinoom en cystische fibrose 22,24. Human enteroids vormen een waardevolle systeem om intestinale stamcellen en epitheliale mucosale biologie studeren en dienen als een nieuw experimenteel systeem om zowel normale en abnormale gastro-intestinale fysiologie 3 bestuderen.
Hier beschrijven we methoden enteroids en colonoids stellen van menselijke dunne darm en colon crypten (figuur 1). In deze methodologische beoordeling, benadrukken we de crypte collectie van hele weefsel en biopten. We herhalen de cultuur modaliteiten die essentieel zijn voor de succesvolle groei en het onderhoud van de menselijke enteroids en colonoids en de mogelijke experimentele strategieën door dit model uitgevoerd zijn.
Protocol
OPMERKING: Ethiek Verklaring: Alle experimenten waarbij menselijke weefsels hierin beschreven werd goedgekeurd door een IRB bij CCHMC (IRB # 2012-2858; # 2014-0427). Informed consent voor tissue verzameling, opslag en het gebruik van de monsters werd verkregen van de donoren op CCHMC.
1. Voorbereiding voor Cultuur
Opmerking: Alle reagentia worden in tabel 1 vermeld.
- Bereid EDTA voorraadoplossing als volgt bereid 0,5 M ethyleendiaminetetra-azijnzuur, pH 8 (EDTA) in ultrazuiver H2O, filter gesteriliseerd met 0,22 pm filter. Optioneel, bewaar de EDTA stockoplossing bij RT voor onbepaalde tijd.
- Bereid chelerende buffer als volgt: meng 2% sorbitol, 1% sucrose, 1% bovine serum albumine fractie V (BSA) en 1x gentamicine / Amfotericine oplossing in Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing zonder Ca2 + en Mg2 + (DPBS), filter gesteriliseerd met 0,22 pm filter. Bereid de chelaatvormer buffer fris.
- Bereid Wnt-3A-geconditioneerd medium als volgt: Wnt-3A-geconditioneerd medium in huis is gemaakt met behulp van de cellijn L Wnt-3A volgens de instructies van de fabrikant (ATCC, CRL-2647). Vul het medium met 2 mM glutamine, 10 mM HEPES, 100 U / ml penicilline, 100 g / ml streptomycine, 1 N2 supplement, 1 B27 supplement, 1% BSA en filter gesteriliseerd met 0,22 um filter.
OPMERKING: Test elke partij voor Wnt activiteit met een TOPflash assay. Gebruik een stabiele cellijn HEK293 TOPflash (Hans Clevers lab) met een Renilla luciferase assay kit volgens de instructies van de fabrikant. Normaliseren van de TOPflash test met 100 ng / ml humaan recombinant Wnt-3A. Bevestigen minstens 10 veelvoudverandering activiteit van de geconditioneerde media in vergelijking met controle. Verdeel vers Wnt-3A geconditioneerd medium in 10 ml porties in 15 ml conische buizen en bevriezen bij -20 ° C maximaal 6 maanden. WINKEL aliquots ontdooid tot 5 dagen bij 4 ° C zonder verlies van activiteit. - Prepare menselijke minigut medium als volgt: Supplement Geavanceerde DMEM / F12-medium met 2 mM glutamine, 10 mM HEPES, 100 U / ml penicilline, 100 g / ml streptomycine, 1 N2 supplement, 1 B27 supplement, 1% BSA en filter gesteriliseerd met 0,22 um filter.
OPMERKING: Verdeel verse humane minigut medium in 10 ml porties in 15 ml conische buizen en bevriezen bij -20 ° C maximaal 3 maanden. WINKEL aliquots ontdooid tot 5 dagen bij 4 ° C zonder verlies van activiteit. - Bereid compleet menselijk minigut medium als volgt: Bereid verse voordat crypt cultuur of medium verandering menselijk minigut medium (zie 1.4), aangevuld met 50% Wnt-3A geconditioneerd medium (zie 1.3), 1 ug / ml R-spondin 1 (1: 1.000 verdunning van 1 mg / ml voorraad), 100 ng / ml Noggin (1: 1000 verdunning van 100 g / ml voorraad), 50 ng / ml EGF (1: 10.000 verdunning van 500 ug / ml voorraad), 500 nm A-83 -01 (1: 1000 verdunning van 500 M voorraad), 10 uM SB202190 (1: 3000 verdunning van 30 mM voorraad), 10 nM [Leu] 15-Gastrine 1 (1: 10.000 verdunning van 100 uMvoorraad), 10 mM nicotinamide (1: 100 verdunning van 1 M voorraad) en 1 mM N-Acetylcysteïne (1: 1000 verdunning van 1 M voorraad).
OPMERKING: Slaat complete mens minigut media tot 2 dagen bij 4 ° C zonder verlies van activiteit.
2. Crypt Isolatie van Whole Tissue
OPMERKING: Van de weefselverzameling, is het essentieel om het monster in zoutoplossing handhaven. Aanbevolen wordt het weefsel op ijs houden tijdens transport. Voorbereiding van het monster voor isolatie van crypte moet zo snel mogelijk worden uitgevoerd.
Opmerking: Alle reagentia zijn vermeld in tabel 1, gereedschappen, uitrusting en hulpstoffen worden in tabel 2 vermeld.
- Bereid alle reagentia voor het begin van het experiment. Ontdooi de basaalmembraan matrix op ijs en pre-incuberen van een 24-wells plaat in een CO2 incubator bij 37 ° C.
OPMERKING: U maakt een dun laagje basaalmembraan matrix met 15 gl / putje in het midden van een 24-goed bord en plaats het in een CO 2 incubator bij 37 ° C. Deze facultatieve stap houdt het basaal membraan matrix als een druppel tijdens de polymerisatie. - Was het weefsel met ijskoude Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing zonder Ca2 + en Mg2 + (DPBS). Overgaan tot de inhoud van DPBS is duidelijk.
- Met behulp van 0,2 mm diameter minutien pinnen, veilig het weefsel op een siliconen gecoat glas petrischaal gevuld met ijskoude DPBS. Strek en speld het weefsel vlak met de mucosale zijde naar boven.
- Onder een stereomicroscoop, verwijdert de bovenliggende slijmvlies van de submucosa en bindweefsel behulp van micro-ontleden schaar en fijne punt gebogen pincet (Figuur 2A, B).
- Rekken en speld de ontleed slijmvlies plat op de siliconen gecoat glas petrischaal met slijmvlies zijde naar boven. De resterende submucosa en bindweefsel worden verwijderd of gebruikt voor verdere experimenten (Figuur 2C).
- Voorzichtigschrapen het oppervlak van de mucosa met gebogen pincet. Deze stap is noodzakelijk om de kwaliteit van het preparaat verbeteren.
- Voor dunne darm, voorzichtig schrapen het slijmvlies aan de villi te verwijderen.
- Voor colon, voorzichtig schrapen het slijmvlies slijm en puin te verwijderen.
- Was de mucosa 3-4 maal met ijskoude chelatie buffer villi en vuil te verwijderen.
- Bedek het slijmvlies met vers bereide 2 mM EDTA chelatietherapie buffer (200 ul 0,5 M EDTA in 49,6 ml chelatietherapie buffer).
- Plaats de petrischaal op ijs en schud voorzichtig gedurende 30 minuten op een horizontaal schudapparaat.
- Was het weefsel 3-4 keer met ijskoude chelatietherapie buffer zonder EDTA. Na het wassen, laat het slijmvlies in de ijskoude chelatietherapie buffer.
- Verwerk het slijmvlies onder een dissectie microscoop met gebogen en fijne tang. Voorzichtig schrapen het slijmvlies aan intestinale crypten met behulp van de gebogen tang los.
- Verwijder voorzichtig de crypte schorsing van de petrischaal met behulp van een piPette en overzetten in een 50 ml conische buis.
NB: controleer het weefsel om ervoor te zorgen dat bijna alle crypten zijn verwijderd uit het slijmvlies. - Filter de crypten suspensie door een 150 pm gaas 2 keer.
OPMERKING: controleer de doorstroming voor crypt verrijking onder een microscoop (figuur 2D). - Centrifugeer de crypte suspensie 5 minuten bij 50 xg bij 4 ° C. Verwijder het supernatant.
- Resuspendeer de pellet in 5 ml ijskoude buffer chelatie.
- Tel het aantal crypten per 10 ul druppel van de suspensie van stap 2.15. Breng het aantal crypten nodig voor plating aan een 5 ml ronde bodem buis. Gebruik 200 tot 500 crypten per putje van een 24-well schotel naar enteroids of colonoids vestigen.
- Centrifugeer de crypte fractie gedurende 10 minuten bij 150 g, 4 ° C. Verwijder het supernatant.
- Gebruik crypten voor de volgende cultuur.
3. Crypt Isolatie van Biopsie
- Bereid alle reagentia voor debegin van het experiment. Ontdooi de basaalmembraan matrix op ijs en pre-incuberen van een 24-wells plaat in een CO2 incubator bij 37 ° C.
- Was de biopsie met ijskoude Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing zonder Ca2 + en Mg2 + (DPBS).
- Met 0,1 mm minutien pennen Bevestig de biopsie op een gesiliconiseerd glazen petrischaal gevuld met ijskoud DPBS. Strek en speld het slijmvlies plat met de mucosale zijde naar boven (Figuur 2E).
- Voorzichtig schrapen het oppervlak van de mucosa met gebogen tang villi en vuil te verwijderen. Deze stap is noodzakelijk om de kwaliteit van het preparaat verbeteren.
- Was de biopsie 3-4 maal met ijskoude chelatie buffer villi en vuil te verwijderen.
- Bedek de biopsie met vers bereide 2 mM EDTA chelatietherapie buffer (200 ul 0,5 M EDTA in 49,8 ml chelatietherapie buffer).
- Plaats de petrischaal op ijs en schud voorzichtig gedurende 30 minuten op een horizontaal schudapparaat. <li> Was de biopsie 3-4 keer met ijskoude chelatietherapie buffer zonder EDTA. Na het wassen, laat de biopsie in ijskoude chelatietherapie buffer.
- Verwerk de biopsie onder een dissectie microscoop met gebogen en fijne tang. Voorzichtig schrapen het slijmvlies aan de intestinale crypten los met behulp van gebogen pincet.
- Verwijder voorzichtig de crypte schorsing van de petrischaal met een pipet en overbrengen naar een 50 ml conische buis.
NB: controleer het weefsel om ervoor te zorgen dat bijna alle crypten zijn verwijderd uit het slijmvlies. - Filter de crypte suspensie door een 150 um nylon mesh 2 keer.
OPMERKING: controleer de doorstroming voor crypt verrijking onder een microscoop. - Centrifugeer de crypte suspensie 5 minuten bij 50 xg bij 4 ° C. Verwijder het supernatant.
- Resuspendeer de pellet in 1 ml ijskoude chelatietherapie buffer. Breng de crypte suspensie tot een 1,5 ml microcentrifugebuis.
- Centrifugeer de crypte fractie gedurende 10 min bij 150 xg, 4 ° C. Verwijder het supernatant. </ Li>
- Gebruik crypten voor de volgende cultuur.
4. Crypt Cultuur in basaalmembraanziekte Matrix
- Met behulp van pre-gekoelde pipet tips, resuspendeer de crypte pellet (vanaf stap 2.18 of 3.15) in basaal membraan matrix (200 tot 500 crypten / 50 pi basaal membraan matrix).
- Solliciteer 50 ul van crypte suspensie in basaal membraan matrix per goed op de voorverwarmde plaat. Uitwerpen langzaam de basaalmembraan matrix in het midden van de put.
- Plaats de 24-wells plaat in een 37 ° C, 5% CO2 incubator gedurende 30 minuten tot een volledige polymerisatie van het basaalmembraan matrix mogelijk.
- Overlay het basaal membraan matrix met 500 ul compleet menselijk minigut medium aangevuld met 2,5 uM CHIR99021 (1: 4000 verdunning van 10 mM voorraad) en 2,5 uM Thiazovivin (1: 4000 verdunning van 10 mM voorraad).
- Incubeer de plaat in een 37 ° C, 5% CO2 incubator.
- Vervang het medium met verse compleet Human minigut medium om de 2 dagen.
5. passage van de Gekweekte Enteroids en Colonoids.
OPMERKING: Passage Enteroids en Colonoids om de 7 tot 10 dagen na de eerste plating. In het algemeen, een split ver in 3-4 putten.
- Bereid alle reagentia voor het begin van het experiment. Ontdooi de basaalmembraan matrix op ijs en pre-incuberen van een 24-wells plaat in een CO2 incubator bij 37 ° C.
- Verwijder de media met behulp van steriele tips en overlay met 1 ml ijskoude DPBS.
- Pipet heen en weer met een 1.000 III tip. Breng de oplossing in een nieuwe 15 ml conische buis.
- Voeg 2 ml humaan minigut medium aangevuld met 5% FBS per 1 ml medium.
- Centrifugeer de oplossing gedurende 5 minuten bij 50 xg bij 4 ° C. Verwijder het supernatant.
- Resuspendeer de pellet met 2 ml celdissociatie enzym aangevuld met 10 pM Y-27632 (1: 1000 verdunning van 10 mM voorraad). Incubeer gedurende 5 min bij 37 ° C in een waterbad.
- Distantiëren de celklonten met behulp van een 3 ml luerlockspuit uitgerust met een 18-G fill / stompe naald. Pipet de oplossing voorzichtig heen en weer met behulp van de spuit 10 keer.
- Centrifugeer de suspensie gedurende 5 min bij 500 xg, 4 ° C. Verwijder het supernatant.
- Met behulp van pre-gekoelde pipet tips, resuspendeer de cel pellet in basaal membraan matrix.
- Solliciteer 50 ul van crypte suspensie in basaal membraan matrix per goed op de voorverwarmde plaat. Uitwerpen langzaam de basaalmembraan matrix in het midden van de put.
- Plaats de 24-wells plaat in een 37 ° C, 5% CO2 incubator gedurende 20 minuten tot een volledige polymerisatie van het basaalmembraan matrix mogelijk.
- Overlay het basaal membraan matrix met 500 ul compleet menselijk minigut medium aangevuld met 10 uM Y-27632 (1: 1000 verdunning van 10 mM voorraad).
- Incubeer de plaat in een 37 ° C, 5% CO2 incubator.
- Na 2 dagenVervang het medium met verse volledig mens minigut medium aangevuld met 10 uM Y-27632 (1: 1000 verdunning van 10 mM voorraad). Daarna vervang het medium met verse, volledig mens minigut medium om de andere dag.
6. Bevriezing van Gekweekte Enteroids en Colonoids
OPMERKING: Meestal bevriezen een ver in 2-3 cryovials.
- Herhaal stap 5,1-5,8.
- Resuspendeer de pellet met koud freezing medium. Breng 1 ml ijskoud oplossing in een gemerkte cryovial. Plaats de cryovial in een ijskoud container met 500 ml isopropylalcohol.
- Breng de bevriezing houder naar een 80 ° C vriezer gedurende 24 uur, vervolgens over cryovial vloeibare stikstof opslag.
OPMERKING: Bewaren Enteroids en Colonoids voor maximaal 1 jaar.
Representative Results
Figuur 2D toont een typisch voorbeeld van vers geïsoleerde crypten van hele weefsel (figuur 2D). Het aantal crypten geïsoleerd uit een biopsie lager dan geheel weefsel. Met behulp van standaard capaciteit biopsietangen met naald, we meestal uit te voeren twee biopsie beten op een enkele pass. Elke biopsie beet resulteert in een 10 mm2 oppervlak met een gemiddelde van 50 tot 100 crypten per biopsie (figuur 2F).
Na cultuur in basaal membraan matrix, de crypten ronden te enterospheres voor de dunne darm en colonospheres voor colon vormen. De crypte ontluikende gebeurt meestal binnen 5-6 dagen na het zaaien. Het is echter niet ongebruikelijk om ofwel enteroids (enteroids) of colonoids (colonoids) vormen bollen in de kelder membraanmatrix zien (figuur 3A-C; Film 1). De passage kan worden uitgevoerd na 7 dagen, afhankelijk van de grootte van de enteroids. De enteroids of colonoids established van biopsies ondergaan dezelfde ontwikkeling in de cultuur. Aangezien de crypte dichtheid bij zaaien lager, de passages wordt meestal na 10 tot 12 dagen in kweek (Figuur 4a, b). Enteroids en colonoids culturen uit te breiden op een reproduceerbare wijze.
Zowel enteroids en colonoids vormen een luminale zijde en bekleed met epitheel (Figuur 5A, B). Proliferatieve cellen kunnen worden waargenomen binnen het enteroids en bevinden zich in de kiem uiteinden (figuur 5C, D). Confocale beeldvorming van enteroids gekleurd met E-cadherine (Ecad) toont de epitheliale cellen (figuur 5E).
Zowel enteroids en colonoids kan worden vastgesteld uit weefsel van patiënten met erfelijke / aangeboren afwijkingen. Figuur 6 toont representatieve enteroids groeien van een patiënt met cystische fibrose (figuur 6A) en een tuften enteropathie gevolg van een aangeboren mutatie in de epitheelcel advertentiehesion molecule gen (EpCAM) (Figuur 6B). Naast het genetisch defect, niet de enteroids niet verschillen in basale toestand vertonen.
Figuur 1. Workflow van crypten dissociatie en het genereren van menselijke enteroids en colonoids in cultuur. Crypten (uit menselijke dunne darm of dikke darm) worden geïsoleerd door EDTA chelatietherapie. Gekweekte crypten vormen enteroids voor de dunne darm en colonoids voor de dikke darm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2. Dissectie werkwijze voor de crypte isolatie. (A) De dunne darm specimen wordt uitgerekt en plat gespeld in een siliconen gecoate petrischaal. (B) De mucosa wordt gescheiden van de onderliggende submucosa. (C) Het uitgesneden mucosa opgespannen vlak vastgemaakt in een met siliconen beklede petrischaal. (D) Na EDTA chelatie, worden de crypten geïsoleerd uit het weefsel. (E) Een biopsie wordt uitgerekt en plat gespeld in een siliconen gecoate petrischaal. (F) Na EDTA chelatietherapie, crypten zijn geïsoleerd van de biopsie. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3. Crypt cultuur en menselijke enteroid en colonoid generatie van hele weefsel. (A) jejunale crypten plated in basaal membraan matrix na isolatie. De crypten sluiten na 3-4 uur en beginnen ballon tot enterospheres na deze tijd vormen. Op 7 dagen worden de jejunale enteroids gevormd. (B) Na isolatie en cultuur, ileal crypten gedragen zich als de jejunal crypten en vormen ileal enteroids. (C) Colonic crypten worden verzilverd in basaal membraan matrix na isolatie. De crypten dicht en vorm colonoids na 7 dagen (Schaal bars: 100 micrometer). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4. Crypt cultuur en menselijke enteroid en colonoid generatie van biopsie. (A) Duodenale crypten plated in basaal membraan matrix na isolatie. De crypten sluiten na 3-4 uur en beginnen ballon omhoog beyond dit keer naar enterospheres vormen. Op 7 dagen worden de enteroids gevormd. (B) Na isolatie en cultuur, zijn colon crypten uitgezet in basaal membraan matrix. De crypten close up te colonospheres vormen dan colonoids na 7 dagen (Schaal bars: 100 micrometer). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5. Intestinale geslachten van de menselijke enteroids. (A) Human enteroid na 6 dagen in de cultuur. (B) hematoxyline-eosine gedeelten van de enteroids in (A) tonen de epitheliale bekleding (Schaalbalken: 100 pm). (CD) confocale beeldvorming van enteroids na Edu kleuring (magenta) toont de aanwezigheid van proliferatieve cellen. (E Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 6. Crypt cultuur en menselijke enteroid generatie van zieke weefsel. (A) Enteroids vastgesteld op basis van een mucoviscidose exemplaar. (B) Enteroids vastgesteld op basis van een aangeboren tuften enteropathy monster (Schaal bars: 100 micrometer). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Film 1. Enterosphere vorming van de menselijke enteroid in cultuur. 32 uur de tijd-rondene-film toont een gevestigde uit menselijke dunne darm terugtrekken om een enteroid in cultuur vormen enterosphere. Klik hier om deze video te bekijken.
| Naam van het reagens | Vennootschap | Catalogusnummer | Solvent | Stock Concentratie | Eindconcentratie | Commentaar |
| Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing Ca 2+, Mg 2+ gratis (DPBS) | Life-technologieën; Gibco | 14190-144 | - | - | 1x | |
| Ethyleendiamine azijnzuur (EDTA) | Sigma-Aldrich | 431.788 | Ultrapuur dH 2 O | 2 mM | ||
| Sorbitol | Fischer Scientific | BP439-500 | DPBS | Poeder | 2% | |
| Sucrose | Fischer Scientific | BP220-1 | DPBS | Poeder | 1% | |
| Bovine serum albumine (BSA) fractie V | Fischer Scientific | BP1600-100 | DPBS | Poeder | 1% | |
| Gzntamycin / amfotericine B-oplossing | Life-technologieën; Gibco | R-015-10 | - | 500x | 1x | |
| Wnt-3A-conditioning medium | in huis | - | - | - | - | |
| Geavanceerde DMEM / F12 | Life-technologieën; Gibco | 12634-028 | - | - | - | |
| HEPES 1M | Life-technologieën; Gibco | 15630-080 | - | 1 M | 10 mM | |
| GlutaMAX (glutamine) | Life-technologieën; Gibco | 35050-061 | - | 100X | 1X | |
| Penicilline-streptomycine (10000 U / ml) | Life-technologieën; Gibco | 15140-148 | - | 100X | 1X | |
| N2 Supplement | Life-technologieën; Gibco | 17502-048 | - | 100X | 1X | |
| B27 supplement | Life-technologieën; Gibco | 17504-044 | - | 50X | 1X | |
| N-acetylcysteïne | Sigma-Aldrich | A9165-5G | DPBS | 1 M | 1 mM | </ Td> |
| Nicotidamide | Sigma-Aldrich | N0636 | DPBS | 1 M | 10 mM | |
| Matrigel, GFR, fenol vrij (basaal membraan matrix) | Corning | 356.231 | - | - | - | VEREIST |
| menselijke recombinant Noggin | R & D | 6057-NG / CF | DPBS | 100 ug / ml | 100 ng / ml | Andere aanbieders: R & D; Anaspec en Preprotech |
| humaan recombinant R-Spondin | Preprotech | 120-38 | DPBS | 1 mg / ml | 1 ug / ml | |
| menselijk recombinant EGF | Sigma-Aldrich | E9644-.2MG | DBPs | 500 mg / ml | 50 ng / ml | |
| Y-27632 | Sigma-Aldrich | Y0503-1MG | DPBS | 10 mM | 10 uM | |
| A-83-01 | Tocris | 2939 | DMSO | 500 uM | 500 nM | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067-5MG | DMSO | 30 mM | 10 uM | |
| mens [Leu] 15-Gastrine 1 | Sigma-Aldrich | G9145-.1MG | DPBS | 100 uM | 10 nM | |
| CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | DMSO | 10 mM | 2.5 uM | |
| Thiazovivin | Stemgent | 04-0017 | DMSO | 10 mM | 2.5 uM | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), fenol rood (celdissociatie enzym) | Life-technologieën; Gibco | 12605-010 | - | - | - | Voor passage |
| Fetal Bovine Serum | Life-technologieën; Gibco | 10082-147 | - | - | - | Voor passage |
| CTS Synth-a-Freeze Medium (bevriezing gemiddeld) | Life-technologieën; Gibco | A13713-01 | - | - | - | Voor het invriezen |
| L Wnt-3A cellijn | ATCC | CRL-2647 | - | - | - | Wnt-3A-conditioning mediaproductie |
| Renilla luciferase assay | Promega | E2710 | - | - | - | Wnt-3A-conditioning media activiteit |
| recombinant humaan Wnt-3A | R & D | 5036-WN / CF | DPBS | 100 ug / ml | 100 ng / ml | |
| HEK293 TOPflash cellijn | - | - | - | - | - | Wnt-3A-conditioning media-activiteit; Geschenk van Hans Clevers laboratorium |
Tabel 1. Gedetailleerde reagens lijst met favoriete fabrikant en catalogusnummer.
| Uitrusting | Verbruiksartikelen | Gereedschap |
| Laminaire stroming kap | 15- en 50 ml conische buizen | Dumont # 5 standaard tang (FST; # 11251-20) |
| CO 2 Incubator | Microfugebuisjes | Dumont # 7, gebogen fijn pincet (FST; # 11274-20) |
| Stereo-microscoop | 24-well platen | Fijne schaar (FST; # 14060-09) | 0,22 pm filter (Sartorius) | Vannas voorjaar schaar (FST; # 15018-10) |
| Orbitaalschudder | Serologische pipetten | 0,2 mm diameter minutien pinnen (FST; # 26002-20) |
| Bevriezing container (Nalgene) | Micropipet tips | 0,1 mm diameter minutien pinnen (FST; # 26002-10) |
| Sylgard 184 Silicone (Dow Corning) | 150 pm mesh openingen, nylon screening (Dynamic Aqua-aanbod) | |
| Glazen petrischaal | 5 ml rondbodem polypropyleen buizen (Falcon) | |
| Serologische pipet | 18G botte fill naald (BD) | |
| Micropipet | 3 ml lsyringes met Luer-Lock tips (BD) | |
| Cryovials |
Discussion
Deze methode levert een compleet systeem reproduceren darmepitheel geslachten en epitheliale dynamiek die een nuttig instrument om darmepitheel biologie studeren vormen. De werkwijze die hierin gepresenteerd werd aangepast van de oorspronkelijke muizen studie van Sato en Clevers 22 die efficiënt resulteert in menselijke enteroids en colonoids. Hier hebben we handmatig pakte de crypten door microdissection elke cellulaire verontreinigingen te voorkomen. Deze methode laat een directe visualisatie van de crypten en leidt tot consistentie overuren vergeleken met het oorspronkelijke crypte collectie van "schudden". Andere groepen ontwikkelde vergelijkbare techniek met behulp van iets andere aanpak vooral het vervangen van de chelatietherapie door EDTA met collagenase 25. Behalve de verschillen in crypte verzameling, die technieken gebruiken een gedefinieerde media die vereist is om de menselijke enteroids groeien in kweek 22. Om de groei van efficiëntie op crypte zaaien verhogen, voegen we een GSK3 remmer (CHIR99021)de eerste twee dagen 12.
De behandeling van het weefsel of biopsies is belangrijk en het crypte isolatie moet zodra het weefsel komt in het laboratorium uitgevoerd. Kan echter vertraagd crypt het kweken worden uitgevoerd tot 24 uur na weefselverzameltoestel (gegevens niet getoond) zoals eerder beschreven voor muizen weefsel 26. Het darmweefsel wordt in een conische buis geheel gevuld met DPBS om weefselverstoring voorkomen en moet bij 4 ° C gehandhaafd worden geplaatst. De vertraagde voorbereiding zorgt voor weefsel verschepen maar temperatuurvariatie dient tijdens het transport te vermijden. De totale tijd voor het oorspronkelijke crypte plating ongeveer 2 uur bij 15 tot 30 minuten aan het weefsel en 1 tot 2 uur te isoleren en plaat de crypte verwerken. De microdissection van het weefsel is een kritische factor en gezegde van een schone crypte voorbereiding. De crypt afgifte hand schudden zoals beschreven in verschillende protocollen mogelijk 22,23.
Ondanks de overeenkomsten met de muizen enteroid (enteroids) systeem, het menselijk enteroids vereisen specifieke moleculen behouden en te versterken hun groei in de tijd. De groeifactoren worden EFG Noggin, R-spondin eveneens gebruikt om de muizen epitheliale organoids. Het gebruik van Wnt-3A kritisch. We merkten dat de vorming en de groei rendement groter met een Wnt-3A geconditioneerd medium dan de menselijke recombinant eiwit. Gelijktijdig hebben we aangetoond verbeterde kweekomstandigheden met een remmer van glycogeen synthase kinase 3 (CHIR99021) 12. Recombinant groeifactoren kunnen worden vervangen door Wnt-3A, R-spondin en Noggin geconditioneerd medium. Een Wnt-3A uiten L-cellijn is commercieel verkrijgbaar (ATCC). Andere groepen hebben R-spondin 1- 23,27, Noggin- 19 ontwikkeld, en Wnt-3A / R-spondin3 / Noggin- 28 uiten cellijnen. Twee kleine molecule inhibitoren worden gebruikt in de kweek menoodzakelijk dia en zijn voor het onderhoud van de cultuur 29. A-83-01 is een selectieve remmer van transformerende groeifactor β en activine / Nodal receptoren (activine-achtige kinase 4, 5, 7) en SB202190 is een p38 mitogen-activated protein kinase inhibitor (MAPK). Beide remmers werden respectievelijk gebruikt om humane geïnduceerde pluripotente stamcellen zelf-vernieuwing te ondersteunen en om de menselijke naïeve pluripotente stamcellen 30-32 stand. Bovendien, nicotinamide, een voorloper van nicotinamide adenine dinucleotide, moet enteroids en colonoids expansie handhaven langdurige wijze 22,29.
De EDTA chelatie is een belangrijke stap als het bepaalt de opbrengst van de crypt bereiding. We hebben succesvol met 2 mM EDTA behandeling. Echter, EDTA concentratie worden gewijzigd van 2 mM tot 15 mM betreffende het type weefsel. In dat geval incubatietijd moet empirisch worden bepaald. Na de eerste plating, zal de crypte rond-up en uiteindelijk vormen enteroids. De enteroids of colonoids tonen vaak "stem" fenotype door het vormen van gebieden met weinig tot geen gedifferentieerde cellen. In dat geval kan differentiatie worden geïnitieerd door intrekking Wnt-3A, nicotinamide en de p38 MAPK remmer. Het gebruik van Notch-remmer, zoals DAPT of DBZ helpt het verbeteren van de differentiatie binnen de enteroids 22.
Dit model recapituleert de intestinale fysiologie met continue-crypt ontluikende gebeurtenissen die voortvloeien uit een stamcel compartiment evenals villus-achtige epitheliale domeinen die zowel absorberend en secretoire onderscheiden geslachten. Interessant dit systeem geen mesenchymale cellen bevat en gebruikt specifieke media omstandigheden de niche signaal voldoen.
Zoals het muizenmodel kunnen humane enteroids worden gegenereerd uit geïsoleerde intestinale epitheliale cellen met het vermogen van deze cellen om als een stamcel testen. Several studies hebben gebruikt cluster van differentiatie merkers (CD44, CD24 en CD166) en EPHB2 positieve cellen te verrijken voor cellen met stamcellen eigenschappen 12,23,33. Samen vormen deze studies tonen het nut van de menselijke enteroids culturen voor het testen van de stemness. Andere onderzoekers gebruiken dit model om intestinale ziekten zoals besmettelijke diarree, cystic fibrosis, of colorectale kanker 22,34-37 onderzoeken. Deze studies tonen aan dat de menselijke enteroids vormen een betrouwbare menselijke ziekte model met een mogelijkheid om te komen tot een persoonlijke screening. Menselijke enteroids kunnen genetisch worden gemodificeerd met behulp van DNA transfectie of infectie met virale deeltjes 38. Dit zorgt voor een krachtig hulpmiddel om gen-specifieke functies te bestuderen binnen het menselijke epitheliale organoids of juist genetische mutaties. Onlangs Schwank en collega's toonden de mogelijkheid het genoom de mutatie van het CFTR-gen dat ac bewerken met de CRISPR / Cas9 systeem en corrigerenystic fibrose 24. Menselijke enteroids een waardevolle systeem intestinale stamcellen en epitheliale mucosale biologie bestuderen en als een nieuw experimenteel systeem voor zowel normale als abnormale maag fysiologie studie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Phosphate buffered saline Ca2+, Mg2+ free (DPBS) | Life technologies; Gibco | 14190-144 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | 431788 | |
| Sorbitol | Fischer Scientific | BP439-500 | |
| Sucrose | Fischer Scientific | BP220-1 | |
| Bovine serum albumin (BSA) Fraction V | Fischer Scientific | BP1600-100 | |
| Gzntamycin/Amphotericin B solution | Life technologies; Gibco | R-015-10 | |
| Wnt-3A conditioned medium | in house | ||
| Advanced DMEM/F12 | Life technologies; Gibco | 12634-028 | |
| HEPES 1M | Life technologies; Gibco | 15630-080 | |
| GlutaMAX (glutamine) | Life technologies; Gibco | 35050-061 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life technologies; Gibco | 15140-148 | |
| N2 Supplement | Life technologies; Gibco | 17502-048 | |
| B27 Supplement | Life technologies; Gibco | 17504-044 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
| Nicotidamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Matrigel, GFR, Phenol free (basement membrane matrix) | Corning | 356231 | |
| human recombinant Noggin | R&D | 6057-NG/CF | |
| human recombinant R-Spondin | Preprotech | 120-38 | |
| human recombinant EGF | Sigma-Aldrich | E9644-.2MG | |
| Y-27632 | Sigma-Aldrich | Y0503-1MG | |
| A-83-01 | Tocris | 2939 | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067-5MG | |
| human [Leu]15-Gastrin 1 | Sigma-Aldrich | G9145-.1MG | |
| CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | |
| Thiazovivin | Stemgent | 04-0017 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red (cell dissociation enzyme) | Life technologies; Gibco | 12605-010 | |
| Fetal Bovine Serum | Life technologies; Gibco | 10082-147 | |
| CTS Synth-a-Freeze Medium (freezing medium) | Life technologies; Gibco | A13713-01 | |
| L Wnt-3A cell line | ATCC | CRL-2647 | |
| Renilla luciferase assay | Promega | E2710 | |
| human recombinant Wnt-3A | R&D | 5036-WN/CF | |
| HEK293 TOPflash cell line |
References
- Noah, T. K., Donahue, B., Shroyer, N. F. Intestinal development and differentiation. Exp Cell Res. 317 (19), 2702-2710 (2011).
- Shroyer, N. F., Kocoshis, S. Pediatric Gastrointestinal and Liver Diseases. Hyams, J. R. W. III , Elsevier. 324-336 (2010).
- Leushacke, M., Barker, N. Ex vivo culture of the intestinal epithelium: strategies and applications. Gut. , (2014).
- Simon-Assmann, P., Turck, N., Sidhoum-Jenny, M., Gradwohl, G., Kedinger, M. In vitro models of intestinal epithelial cell differentiation. Cell Biol Toxicol. 23 (4), 241-256 (2007).
- Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Mahe, M. M., et al. Establishment of Gastrointestinal Epithelial Organoids. Current Protocols in Mouse Biology. 3, 217-240 (2013).
- Sato, T., Clevers, H. Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).
- Stelzner, M., et al. A nomenclature for intestinal in vitro cultures. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302 (12), G1359-G1363 (2012).
- Ramalingam, S., Daughtridge, G. W., Johnston, M. J., Gracz, A. D., Magness, S. T. Distinct levels of Sox9 expression mark colon epithelial stem cells that form colonoids in culture. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302 (1), G10-G20 (2012).
- Furstenberg, R. J., et al. Sorting mouse jejunal epithelial cells with CD24 yields a population with characteristics of intestinal stem cells. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 300 (3), G409-G417 (2011).
- Wang, F., et al. Isolation and Characterization of Intestinal Stem Cells Based on Surface Marker Combinations and Colony-Formation Assay. Gastroenterology. , (2013).
- Yan, K. S., et al. The intestinal stem cell markers Bmi1 and Lgr5 identify two functionally distinct populations. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (2), 466-471 (2012).
- Es, J. H., et al. Dll1+ secretory progenitor cells revert to stem cells upon crypt damage. Nat Cell Biol. 14 (10), 1099-1104 (2012).
- Yui, S., et al. Functional engraftment of colon epithelium expanded in vitro from a single adult Lgr5(+) stem cell. Nat Med. 18 (4), 618-623 (2012).
- Durand, A., et al. Functional intestinal stem cells after Paneth cell ablation induced by the loss of transcription factor Math1 (Atoh1). Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (23), 8965-8970 (2012).
- Sato, T., et al. Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts. Nature. 469 (7330), 415-418 (2011).
- Akcora, D., et al. The CSF-1 receptor fashions the intestinal stem cell niche. Stem Cell Res. 10 (2), 203-212 (2013).
- Farin, H. F., Van Es, J. H., Clevers, H. Redundant sources of Wnt regulate intestinal stem cells and promote formation of Paneth cells. Gastroenterology. 143 (6), 1518-1529 (2012).
- Rothenberg, M. E., et al. Identification of a cKit(+) colonic crypt base secretory cell that supports Lgr5(+) stem cells in mice. Gastroenterology. 142 (5), 1195-1205 (2012).
- Lau, W., et al. Peyer's patch M cells derived from Lgr5(+) stem cells require SpiB and are induced by RankL in cultured 'miniguts. Mol Cell Biol. 32 (18), 3639-3647 (2012).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Jung, P., et al. Isolation and in vitro expansion of human colonic stem cells. Nat Med. 17 (10), 1225-1227 (2011).
- Schwank, G., et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).
- VanDussen, K. L., et al. Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays. Gut. , (2014).
- Fuller, M. K., et al. Intestinal stem cells remain viable after prolonged tissue storage. Cell Tissue Res. 354 (2), 441-450 (2013).
- Ootani, A., et al. Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche. Nat Med. 15 (6), 701-706 (2009).
- Miyoshi, H., Ajima, R., Luo, C. T., Yamaguchi, T. P., Stappenbeck, T. S. Wnt5a potentiates TGF-beta signaling to promote colonic crypt regeneration after tissue injury. Science. 338 (6103), 108-113 (2012).
- Koo, B. K., Clevers, H. Stem Cells Marked by the R-Spondin Receptor Lgr5. Gastroenterology. , (2014).
- Li, W., et al. Generation of rat and human induced pluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors. Cell Stem Cell. 4 (1), 16-19 (2009).
- Tojo, M., et al. The ALK-5 inhibitor A-83-01 inhibits Smad signaling and epithelial-to-mesenchymal transition by transforming growth factor-beta. Cancer Sci. 96 (11), 791-800 (2005).
- Gafni, O., et al. Derivation of novel human ground state naive pluripotent stem cells. Nature. 504 (7479), 282-286 (2013).
- Gracz, A. D., et al. Brief report: CD24 and CD44 mark human intestinal epithelial cell populations with characteristics of active and facultative stem cells. Stem Cells. 31 (9), 2024-2030 (2013).
- Foulke-Abel, J., et al. Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract. Exp Biol Med (Maywood). , (2014).
- Dekkers, J. F., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nat Med. 19 (7), 939-945 (2013).
- Kovbasnjuk, O., et al. Human enteroids: preclinical models of non-inflammatory diarrhea. Stem Cell Res Ther. 4, Suppl 1. S3 (2013).
- Fujii, M., Sato, T. Culturing intestinal stem cells: applications for colorectal cancer research. Front Genet. 5, 169 (2014).
- Koo, B. K., Sasselli, V., Clevers, H. Retroviral gene expression control in primary organoid cultures. Curr Protoc Stem Cell Biol. 27 (Unit 5A), 6 (2013).
