Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Manipülasyon ve Published: February 9, 2015 doi: 10.3791/52496
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2
1Wellcome Trust/Cancer Research UK Gurdon Institute, University of Cambridge, 2Department of Zoology, University of Cambridge

Introduction

Xenopus laevis geliştirme 1 incelemek için yaygın olarak kullanılan, güçlü bir model organizmadır. Xenopus yumurta ve bol (memeli meslektaşları karşılaştırma yaklaşık 0.1 mm olmak, yaklaşık 1.2-1.4 mm) alışılmadık büyük olmasıdır. Yumurta (4,000-8,000 hücreleri ile sahnede 8-8,5 meydana gelen, MBT) orta-blastula geçiş kadar embriyo gelişimini götürmek için yeterli olan anne sentezlenmiş ve depolanan bileşenler içerir. MBT sonra daha da geliştirilmesi doğrudan embriyonik gen ürünleri üreten zigotik genom aktivasyonu, eşlik ediyor.

Çeşitli çalışmalar gelişimi için önemli anne faktörlerini belirlemeyi amaçladık. Birçok çalışma, anne proteinlerin durum bozunma gastrula aşamasında 2-4 de gözlenebildiği döllenmiş embriyolar haline morfolino oligonükleotitler de dahil olmak üzere anti-his oligonükleotidler (oligos) enjeksiyonu dayanır. Alternatif olarak, mRNAlar döllenmiş em enjekte edilirbryos gen fonksiyonlarını rahatsız veya aşın proteinlerin kaderlerini izlemek için. Bununla birlikte, tek bir hücre aşamasında embriyoların içine enjeksiyon normal MBT önce çok erken evrelerinde maternal protein ifade seviyelerini etkilemez.

Heasman ve Wylie, bu sorunu aşmak için 5 konak aktarma yöntemi kurdu. Bunların bir yöntemde, el defolike oosit antisens oligoları ile enjekte edilir ve ana kadın 6 transfer edilir. Erken dönemde embriyo gelişimi olarak azaldı proteinlerin rolleri incelenmiş böylece proteinler Fertilizasyondan önce aşağı regüle edilir. 7 'da gözden geçirilen bu anne tüketme yöntemi olup, anne proteinlerin çeşitli benzersiz gelişim roller belirlenmesine yol açmıştır.

Döllenme önce mRNA anne tükenmesi ya da aşırı ifadesi manuel defolliculation ve ev sahibi transferi olmadan elde edildiği, bu raporda, biz ayrıntı bizim yeni geliştirilen yöntem, içinde8. Manuel defolliculation zaman ve konak transferi bir sürü genellikle böylece anne tükenme yöntemi sık kullanımı engelleyici, usta teknikleri ve hayvan cerrahisi için özel lisans ihtiyacı gerektirir. Defolliculation ve ev sahibi transferi sırasıyla, enzimatik defolliculation 9,10 ve intrasitoplazmik sperm enjeksiyonu (ICSI) 11-13 ile ikame edilir. Yumurta ICSI başlangıçta transgenik kurbağalar 12 üretmek için kullanıldı. Sperm ve embriyonik çekirdekleri ayrıca in vitro olgunlaşması amfibi oosit 11,14,15 nakledildi. Burada, biz in vitro olgunlaştı oosit sperm enjekte etmek bizim adım adım yöntemi göstermek antisens oligolar veya mRNA ile ön-enjekte.

Protocol

NOT: kurbağa ile tüm deney İngiltere Home Office gereklerini takip yürütülmüştür.

Xenopus 1. Hazırlık laevis oosit

  1. Yaklaşık bir hafta oosit alma önce bir 27 G iğne ile, 1 ml steril bir şırınga ile ön astarlanması için Gebe Kısrak Serumu Gonadotropin (PMSG) 150 U dişi kurbağa enjekte edilir. Enjeksiyon dorsal lenf kese içine deri altından yapılır.
    NOT: Bu uzun bir süre için yumurtalarını vermedi kurbağaları önce yumurta koydu asla (en azından yarısından fazlası yıllık) ya da kullanmak için en uygunudur.
  2. (: On, 07:00-7:00: off 07:00-7:00) Mağaza ışık kontrollü odada 18 ° C'ye ayarlanmış bir su tankında kurbağa-prime önceden.
  3. Oosit toplama gününde, (GKD 2 O) çift damıtılmış su ile inceltilerek 10x MBS stoktan 1x Modifiye Barth solüsyonu (MBS) 'nin 1 L' nin Hazırlanması ve 10 ug / ml son konsantrasyonda penisilin ve streptomisin ilaveHer (MBS + PS). 10x MBS hazır 880 mM NaCI, 10 mM KCI, 24 mM NaHCO3, 8.2 mM MgSO oluşmaktadır 4 H2O .7H, 3.3 mM Ca (NO 3) 2 .4H 2, O, 4,1 mM CaCl2 .6H 2, O, 100 mM HEPES, pH 7.5 olarak değiştirilmişti.
  4. Tricaine metansülfonat (400 ul) 120 mg olarak deri altma enjeksiyonu (MS222) ile önceden astarlanmış kurbağa anestezisi. Su ile küçük bir tank içinde enjekte kurbağa tutun.
  5. 10 dakika sonra, başarılı bir anestezi kurbağalar, bu yanıt vermeyen beri üzerinde çevirerek anestezi kurbağa kontrol edin. Anestezi eksik ise, tanka buz ekleyin ve 10 dakika daha bekleyin.
  6. Silin nemli sırt yatma küçük tank ve yerden kurbağa Pick up.
  7. Forseps ve küçük cerrahi makas kullanarak, cilt çimdik ve orta hatta lateral karın, alt kısmında küçük bir kesi (2 cm) yapmak. Diğer tarafında başka bir kesi yapmak.
  8. Cildi kestikten sonra, kas tabakası wi kaldırıninci forseps kas tabakasında kesi yapmak ve.
  9. Kas tabakası kesilir sonra yumurtalık gözlemleyin ve forseps kullanarak kesiler gelen yumurtalık çekin.
  10. Aktarım MBS çözeltisi ile 50 ml tüp yumurtalık ekstre edilmiştir.
    NOT: Her iki kesiler mümkün olduğunca çok yumurtalık toplamaya çalışın.
  11. Sonraki uygun bertarafı için dondurma ardından kansız bırakılarak kadın kurbağa, katliam.
  12. Kan yıkanarak kadar MBS + PS ile ekstre yumurtalık birkaç kez durulayın. Ardından, PS MBS içeren + 9 cm Petri kabı yumurtalık aktarmak
    NOT: Bu noktada bir mikroskop altında oosit kalitesini kontrol edin. Oosit, hayvan yarısı (Şekil 1A) düzensiz pigmentasyon ile oosit olarak görünüşte kötü kalite, varsa, daha fazla işlemek ve bunun yerine yeni bir yumurtalık elde değil. İdeal olarak, oosit eşit pigmentli hayvan hemisfer ve yaklaşık eşit büyüklükte olmalıdır.
  13. Küçük parçalar halinde yumurtalık Tease(1-2 cm2) ve yeni bir 50 ml tüp içinde oosit 5 ml toplar.
  14. MBS + PS ile yırtık yumurtalık 5 ml birkaç kez durulayın ve 15 ml MBS + PS ekleyin.
  15. Yumurtalık süspansiyon defolliculation için enzimin 7 birimleri ekleyin (Malzeme Listesi'ne bakın).
    Not: GKD 2 O, 10 ml (28 birim / ml) ile liyofilize enzim sulandırın. Ara sıra nazik bir döndürme ile buz üzerinde 30 dakika boyunca şişe yerleştirin. Kullanılana kadar -80 ° C'de kısım 250 ul saklayın.
  16. Yumuşak (yaklaşık 0.014 x g eşdeğer 15 devir / dakika, en hızı) bir karıştırıcı üzerinde çalkalayarak 1 saat süreyle enzim ile yumurtalık parça inkübe edin.
    NOT: folikül hücreleri, 2 saat enzim normalde gerekli olan min inkübasyon 15 saat 2 neredeyse tamamen kaldırılması için. Daha uzun inkübasyon oosit nükleer transfer deney 16 için gereklidir.
  17. 1 saat inkübasyondan sonra, MBS içeren 6 cm Petri kabı küçük tedavi oosit sayısı (10-20 oosit) ve transfer pick up + PS EXTE kontrolbir tahlil mikroskobu altında defolliculation nt. Oosit birbirinden ayrılmış ve en azından kısmen (Şekil 1B) defolike ise, hemen bir sonraki durdurma reaksiyonu (aşama 18) devam edin. Oositler hala ağır folikül hücreleri tarafından çevrelenmiş ise, en fazla bir ilave 15 dakika boyunca inkübe edin.
  18. Reaksiyonu durdurmak ve süpernatant atmak için MBS + PS bol ekleyin. 10 kez yıkama tekrarlayın.
    Not: ancak doğrudan oosit, bir 50 ml tüp çeperine dökülerek MBS + PS ekleyin. MBS + PS süspansiyon sonra, küçük olgunlaşmamış oosit yıkama tamponu üstündeki şamandıra ve küçük yüzen oosit atmak için eğilimindedir.
  19. Yıkandıktan sonra, PS MBS içeren + 9 cm Petri kabı transfer
    NOT: Bu adım itibaren, 16-18 ° C'de mümkün olduğunca oosit tutmak itibaren. Bu sıcaklık kontrollü bir sahnede oosit içeren çanak tutarak yapılabilir.
  20. Dumont'un sınıflamasına göre evre VI oosit seçinMBS + PS Oosit transferi içeren yeni 9 cm Petri sonraki kullanımlar ve transferi için uygun bir uç boyutu (oosit boyutundan daha büyük) bir cam pipet kullanılarak yapılabilir.
    NOT: Kaliteli oosit hayvan yarımkürede ve bitkisel yarımkürede arasında açık kontrast bir eşit pigmentli hayvan yarımkürede olmalıdır ve yaklaşık eşit (Şekil 1C) boyutta olması. Sahne VI oosit tam (oosit çapı yaklaşık 1.2-1.4 mm) progesteron yanıt verebilir oosit yetiştirilen temsil eder.

Oositlerine antisens oligonükleotidler veya mRNA 2. Enjeksiyon

NOT: Bu bölümde tüm adımlar sıcaklık kontrollü sirkülasyon su veya buz dolu bir plastik kutu üzerinde donatılmış bir mikroskop sahnede 16-18 ° C'de yapılmalıdır.

  1. Mikro-enjeksiyon yapılan edilecektir MBS + PS ile dolu yeni bir 9 cm Petri için, içine 200-300 seçilen oositlerin transferi.
    NOT: EAC olarakh durumu, 200-300 oosit normal kullanılmaktadır. Toplam olarak, yaklaşık 1000 oositler bir deneyde kullanılmıştır.
  2. Antisens oligo veya mRNA enjeksiyon hazırlamak için, bir mikropüskürtücü metal pistonunu çıkarın.
  3. Şırınga kullanılarak, mineral yağı ile bir cam kılcal doldurun ve mikroenjektör metal pistonun yağ ile dolu cam kılcal yerleştirin.
    NOT: Bir cam kılcal mikropipet çektirmesi ile çekilir. Bu iğneler ipuçları zarar vermeden bir kutuda muhafaza edilir.
  4. Mümkün olduğunca enjeksiyon için küçük çaplı ucu gibi amaçlayan bir mikroskop altında küçük cerrahi makas kullanarak iğne ucu kesin.
    NOT: İğne ucu mikro dövme veya mikropipet beveler kullanılarak bilenmiş edilebilir. 25 ° 'lik bir açıyla iğne konik için oosit duvarına geçen kapasitesini artırır.
  5. Diseksiyon mikroskobu sahnede Parafilm küçük bir şerit yerleştirin ve antisens oligo veya mRNA çözümün bir 3 ul damla dağıtmak.
  6. Ti Taşıçözeltinin küçük bir damlacık içine enjeksiyon iğnesinin p hem çözeltisi ile iğne doldurmak enjekte edilecek.
    NOT: Enjeksiyon iğne ucu kadar küçük olursa, hava kabarcıkları, metal piston ucunda görünmelidir. Ardından, bu olmaz kadar enjeksiyon iğnesi üzerinde büyük bir ipucu yapmak.
  7. Yaklaşık 0,5 mm uzakta ucundan bir iğne işaretleyin. Bu işaret enjeksiyon derinliği bir göstergesi olarak kullanılmaktadır.
  8. Yavaşça enjeksiyon sırasında istenmeyen oosit hareketini önlemek için forseps ile enjeksiyon noktasına oosit karşı tarafına tutarak (torbacığı altında) oosit merkez noktasına yönelik ekvator sınır boyunca bir oosit içine iğne ucu yerleştirin .
    NOT: folikül hücreleri (Şekil 1B) serbest alanını bulun ve hatta ince iğne genellikle folikül hücreleri tabakası nüfuz edemez çünkü o noktadan iğneyi.
  9. 4.6 ng / 4.6 nl veya Karşıtları 9.2 ng / 9.2 nl Çıkarense oligolar ya da ayak anahtarı kullanarak mRNA uygun bir hacmi (13.8 ng 250 mikrogram) verilmiştir. Antisens oligo üretimine ilişkin ayrıntılı bilgi 7'de tarif edilmektedir.
  10. % 0.1 BSA ile takviye edilmiş MBS + PS ile doldurulmuş bir 6 cm Petri için enjekte oosit aktarın (Oosit kuluçka ortamı, bir 0.45 mikron gözenek filtresi kullanılarak çözelti sterilize).
  11. 16 yaşında oosit inkübe ° C veya 1-2 gün süreyle 18 ° C.
    Not: Enjekte edilen oositler, bu durumda 4.6 ng antisens oligo enjeksiyon tercih edilir, enjeksiyondan sonra in vitro olgunlaşması birkaç saat tabi tutulabilir. Genel bir kural sonraki embriyonik gelişim daha iyi, kuluçka dönemi kısadır olmasıdır.

OOSİT Vitro Olgunlaşma (IVM) 3.

  1. Oosit olgunlaştırma deney akşamı, ° C derin dondurucuda -80 progesteron stok solüsyonu (etanol içinde 30 mM) getirme ve oda tem de çökeltilerin çözünmesizaman zaman girdap ile lığı.
    Not: progesteron hazır normalde 1 saat 30 dakika için oda sıcaklığında bırakılmıştır.
  2. (, 3 uM progesteron nihai konsantrasyon Olgunlaştırma ortamı) ile aynı çözelti içinde progesteron dağıtmak için 30 dakika boyunca bir karıştırıcı üzerinde çalkalayın MBS + PS 50 ml progesteron stoklar 5 ul ekle.
  3. In vitro olgunlaşması tedavisi için agaroz kaplı 6 cm yemekler hazırlayın.
    1. Magnezyum ve kalsiyum olmadan 1x MBS 50 ml agaroz 1 gr.
    2. Bir mikrodalga içinde ısıtılarak agaroz içinde çözülür.
    3. Yemekler alt kapak 6 cm tabaklara agaroz bir çözelti küçük bir hacme dökün.
    4. Katılaşma gerçekleşene dek 30 dakika boyunca en az bekleyin.
    NOT: Agaroz kaplama yemekleri oosit yapışmasını önler. Bir kez sıkıca yemekleri bağlı in vitro olgunlaştı oosit, bu oosit onlar dis gelen dekolmanı sırasında aldığınız uyaranlarla aktive olacağı muhtemeldirhes.
  4. Olgunlaşma orta 5-8 ml yemekleri agaroz kaplı ve her 6 cm yemekleri içine 200-300 oosit transfer dökün.
    NOT: oosit inkübasyon ortamı az miktarda oosit aktarmak için deneyin.
  5. 16 ° C'de 16 saat inkübe edilir.
    NOT: Örneğin, 17:00 de tedaviye başlamak ve ertesi gün 09:00 de bitirmek.

4. İntrasitoplazmik Sperm Enjeksiyonu (ICSI)

  1. Dondurulmuş sperm stok hazırlama
    Not: Aşağıdaki sperm hazırlama oosit olgunlaşma deney başlamadan önce yapılmalıdır, ve dondurulmuş sperm stokları ICSI için -80 ° C'de tutulur.
    1. Yağ çekme hariç, adımları 1,4-1,11 takip ederek bir erkek kurbağa testis toplayın ve kesiler forseps kullanarak ve yağdan testislerin çıkarılması dışarı testisler.
    2. 1x Marc Modifiye Ringers (MMR, 100 mM NaCI, 2 mM KCI, 1 mM MgSO 4, 2 mM CaCI2, 5 mM HEPES, pH 7.4) içinde testisler yıkayın.
    3. Yağın bir çıkarınforseps kullanarak kalan kan damarlarını kaldırarak temiz bir kağıt mendil üzerine yıkanmış testisler haddeleme tarafından d kan damarları.
    4. 1x MMR 1 ml ihtiva eden bir 3.5 cm Petri için, her testis yerleştirin.
    5. Ince makas ile uzunlamasına kesin ve hiçbir büyük parçalar kalmayıncaya kadar forseps ile küçük parçalar halinde gözyaşı.
    6. Pipet yukarı ve 1 ml'lik plastik olan ucu kesilir ucu ve yük cam homojenleştirici içine ezilmiş testis solüsyonu 1 ml kullanarak aşağı.
    7. 2-3 vuruş bunları homojen ve daha sonra 15 ml'lik bir santrifüj tüpüne en bağlanmış bir 50 mikron gözenek filtresi üzerine dökün. Çözelti filtre üzerinden gitmek için izin.
    8. 1x MMR 1 ml kalan kesim testis resuspending adımı yineleyin 4.1.7. Son olarak, 1x MMR ile homojenleştirici birkaç kez yıkayın ve filtreden geçirin.
    9. Tekrar bir 15 ml santrifüj tüpüne diğer testis ve havuz iki testis için 4.1.8 için 4.1.5 adımları.
    10. 4 800 x g'de hücreleri Spin6; 20 dakika işleme sokuldu.
    11. Süpernatantı atın ve 1x MMR 2 ml pelet hücreleri tekrar süspansiyon. Daha sonra, yeni bir tüpe aktarılır.
      NOT: görünür kan hücreleri mevcut olduğundan emin olun.
    12. 14 ml ultra net santrifüj tüpüne bir adım degrade hazırlayın. Alt tabaka:% 30 iyodiksanol 4 ml. İkinci alt tabaka:% 20 iyodiksanol 1 ml. Üçüncü alt tabaka:% 12 iyodiksanol 5 ml. Üst katman: 1x MMR 2 ml hücreleri testis. (Alt faz rahatsız değil yavaş yavaş bindirmek) 1 ml pipet ile çok nazikçe geçişlerini Yerleşimi.
      NOT:% 30 iyodiksanol Sadece bir katman da sadece sperm izole etmek için çalışması gerekir.
    13. (Ara vermeden yavaşlama), 15 dakika boyunca 4 ° C'de 10,000 x g'de ultrasantrifüj kullanarak SW40 rotor içinde spin.
    14. Yavaşça ultrasantrifüjdeki tüpü çıkarın. Gradyan her bir katmanı ve altında bulunan pelet arasında bir ara kontrol edin.
    15. Pelet sperm fraksiyonu toplayın.
    16. Sperm Pel yeniden süspanseiyodiksanol dışarı yıkamak için 1x MMR izin. 20 dakika boyunca 4 ° C'de 800 x g'de spin.
      NOT: sperm bir sürü hala 4 ° C'de 3,220 x g'de yüzer madde 20 dakika için spin, yeniden dönüş sonra süspansiyon kalır ve topak haline sperm havuz varsa.
    17. Süpernatant atılır ve 1x Nükleer hazırlanması 1 ml tampon sperm pelletini (NPB 250 mM sukroz, 0.5 mM spermidin trihidroklorit, 0.2 mM Spermin, tetrahidroklorür, 1 mM EDTA, 15 mM HEPES, pH 7.7), 13. Daha sonra, bir Eppendorf tüpüne aktarılır.
    18. 50 mg / ml 1 x NPB (DMSO içinde yeniden süspanse Digitonin'dir toz içinde 50 ila 10 mg arasında ul / ml Digitonin'dir solüsyonu eklenir ve -80 ° C'de alikot dondurma. Önce kullanımı, 10 mg, 50 mg / ml lik bir seyreltik / ml 1x NPB. 10 mg / ml Digitonin'dir dondurulmuş ve -20 ° C'de ve yeniden kullanılabilir) sperm çözeltisi 1 ml saklanabilir Kullanılmayan.
    19. Oda sıcaklığında 5 dakika süreyle inkübe edilir.
    20. DAPI boyama (bir fina olarak 0.3 ug / ml DAPI tarafından permeabilizasyon hızını kontroll konsantrasyonu). Hücrelerin daha az% 95 geçirgenleştirildi ise, biraz daha uzun kuluçkaya yatmaktadır.
      NOT: Çok sayıda sperm hücreleri (sperm birden testis toplanan özellikle) aynı anda inkübe edilir Bazen, eğer bu durumda Digitonin'in ek bir küçük bir miktar eklemek gerekebilir, geçirgenliği zordur; sperm% 20 permeabilize takdirde, örneğin Digitonin'in ek 20 ul ilave edilir.
    21. % 3 nihai bir konsantrasyona kadar% 10 BSA eklenerek geçirgenliği durdurun.
    22. 4 ° C'de hücreler dönerler.
      NOT: 5 dakika boyunca 100 x g ile başlayarak mümkün olduğu kadar az santrifüj hızı deneyin. Yeterli değilse, hız ve / veya süresini arttırmak.
    23. Aşama 4.1.22 ile aynı hızda% 0.3 1x NPB BSA ve santrifüj ile hücreler yıkanır. Bu arada, sperm Depolama tamponu hazırlamak (SSB 2x NPB 2 ml,% 10 BSA, gliserol otoklava 1.2 ml, H2 O 680 ul 120 ul).
    24. Sperm SSB 500 ul ekleyinpelet. Yukarı ve aşağı Pipet birkaç kez hücrelere zarar vermemek için bir kesim ucu ile tekrar süspansiyon.
    25. 4 ° C'de bir gece boyunca dengelenmeye bırakın.
    26. Yukarı ve bir kesim ucu ile birkaç kez aşağı hücreleri pipetle.
    27. Hemasitometre kullanarak hücreleri saymak için 10 kez 1x MMR veya 1x PBS içinde mikrolitre birkaç seyreltin.
    28. Tek kullanımlık alikotları -80 ° C'de 30.000 sperm / ul (veya daha yüksek) doğrudan -80 ° C'de ve mağaza alikotları olarak dondurun.
  2. In vitro ICSI oosit olgunlaştı
    NOT: oosit içeren tüm süreçler 16-18 ° C'de yapılmalıdır.
    1. Olgunlaştı oosit aktarmak için bir cam pipet hazırlayın.
      NOT: Cam pipet yeterince geniş sıkma yapmadan oosit karşılamak için olmalıdır.
    2. Onaltı saat progesteron içeren ortamda oosit hareket ettikten sonra, Transfer yıkama MBS + PS ile doldurulmuş bir 6 cm agaroz kaplı çanak içine oosit olgunlaşması.
      Not: Daha da önemlisi, m,Nativ oosit son derece dikkatli bir şekilde tedavi edilmelidir. Oosit Kaba tedavi sperm enjeksiyonu öncesi spontan aktivasyonu neden olabilir.
    3. Germinal vezikül dökümü (Şekil 2) ima beyaz lekelerin görünümünü, onaylayarak olgunlaştı oosit sayın. Olgunlaşma oranı% 80'den az ise, daha analizler için embriyo hayatta yeterli sayıda elde etmek mümkün değildir.
      NOT: Kalan folikül hücreleri oosit olgunlaşması sonra soyulmuş (Şekil 2).
    4. Enjeksiyon ortamı ile doldurulmuş yeni bir agaroz kaplı 6 cm'lik tabağı MBS yıkama transfer oosit (: Ficoll (% 6), 30 g, 20 10 x MMR mi ve 1,000x PS stokunun 500 ul, 500 ml hazırlayın).
    5. ICSI başlamadan önce en az 30 dakika inkübe edilir.
    6. Adımlarda 2.2-2.4 açıklandığı gibi Mikroenjektör ayarlayın.
      Not: enjeksiyon iğnesinin ucu boyutu adım 2.6 de tarif edilen prosedür takip edilerek mümkün olduğu kadar küçük tutulur. çapiğne 20-40 mm. Verimli enjeksiyon izin verebilir adım 2.4 açıklandığı gibi iğne ucu konik için.
    7. Sperm kısım Al ve sperm Seyreltme Tamponu (SDB, 250 mM sukroz, 75 mM KCI, 0.5 mM spermidin, 0.2 mM spermin, 200 uM HEPES pH 7.5) içinde, sperm süspansiyonu seyreltin.
      Not: bir iğne boyutu ve bu yüzden bağlı Seyreltme değişebilir. Ilk denemede olarak 30.000 sperm / ul stokunun 120 kez sulandırmak ve gerekirse daha ayarlayın.
    8. Diseksiyon mikroskobu sahnede Parafilm küçük bir şerit yerleştirin. Pipetleme sperm enjeksiyonu çözüm karıştırın ve sperm solüsyonu birkaç damla ul dağıtmak.
    9. , Iğne içine seyreltilmiş sperm süspansiyon Suck bir mikroskop lamı üzerine 0.3 ug / ml DAPI içeren 10 ardışık damla içine 4.6 nl enjekte ve hızlı bir floresan mikroskop enjeksiyon başına teslim sperm sayısını.
      NOT: enjeksiyon başına 1-2 sperm hedefliyoruz. Gerekirse, daha fazla sperm enjeksiyonu çözümü sulandırmakve istenen konsantrasyon elde kadar tekrar enjeksiyon başına sperm sayısını kontrol edin.
    10. Test enjeksiyon çözüm çıkarın ve uygun bir konsantrasyon ile yeni bir sperm enjeksiyonu çözümü doldurun.
    11. 100 olgunlaşmış oositlerin sperm çözeltisi 4.6 nl enjekte edilir.
      NOT: Sürekli çözüm enjekte etmek önemlidir. İlk 4.6 nl (normalde 1-2 sn) püskürtülmesi için gerekli süreyi belirlemek. Aşağıdaki işlemi tekrarlayın; Bir oosit enjekte, bir oosit enjekte birkaç saniye bekleyin, enjeksiyon çözeltisi içinde bir iğne ve sahte-enjeksiyon kaldırmak, bir kaç saniye bekleyin. Bu sürekli enjeksiyonu da iğne ucu tıkanmasını engeller. Seçenek olarak ise, bir pompa kullanılarak bir yöntem 13 kullanılabilir.
    12. Yaklaşık 100 enjeksiyon, kalan sperm çözüm çıkarmak ve (dağıtım önce yukarı ve aşağı aynı sperm çözümü kullanın, ancak pipet) sperm çözümü yeniden doldurun.
      NOT: İğne iyi sperm çözümü emmek yoksa, ihtiyaç ucunu kestile. Bu durumun iyileştirilmesi değil, yeni bir iğne hazırlayın.
    13. Tüm oosit enjekte kadar enjeksiyon işlemi tekrarlayın.
      NOT: oosit kalitesi iyi ve enjeksiyon başarılı olursa, enjekte edilen oositlerin daralma enjeksiyon süresi 20 dakika içinde görülür.
    14. 16 ° C veya 18 enjekte yemekler taşı   C inkübatör °.
    15. 4-5 saat enjeksiyonundan sonra, ICSI embriyoların bölünme oranını kontrol edin.
      NOT: Bu embriyoların yarılması oluklar, normal döllenmiş embriyo gibi net olmayabilir. Bazı embriyolar aynı zamanda birden fazla sperm enjeksiyonu sebep olabilir anormal bölünmelere, göstermektedir.
    16. Kuluçka ortamına anormal yarılan embriyon transferleri de bölünen embriyolar (500 mi hazırlayın: Ficoll (% 4), 5 10x MMR mi ve 1,000x PS stokunun 500 ul 20 g) eklenmiştir.
    17. 16 ya embriyolar inkübe   Gecede ° C veya 18 ° C inkübatör.
    18. Ertesi sabah, transfer Embryve 0.1x MMR ile os embriyolar hayatta saymak.
    19. Ortalama olarak, sperm-oosit enjekte yaklaşık 10% yüzme iribaş aşamasında (Şekil 3A) gelişebilir.

Representative Results

In vitro olgunlaştı oosit kullanarak ICSI embriyoların Embriyonik gelişim (Şekil 3A) incelendi. MII sahneye GV oosit olgunlaşması oranları değişkendir ve büyük ölçüde oosit kalitesine bağlıdır. İyi deneylerde, GV oosit neredeyse% 100 nihayet MII aşamada yumurta haline, oosit olgunlaşması progesteron ve gösteri işaretleri cevap. Tüm oositler ICSI olgunlaşmış tabi tutulur ve enjekte klivaj edilen yumurtaların yaklaşık% 25'i (Şekil 3A, n = kontrolü için 13 oligo enjekte oosit karıştırılmış ve n = herhangi bir oligo-enjekte edilmiş oositlerde 7) yapılmıştır. Yaklaşık% 60 ya da kontrol oligo-enjekte edilmiş oositlerde veya enjeksiyon oosit elde ayrılır embriyolar,% 80, sırasıyla Blastula / gastrula aşamasına. Blastula / gastrula embriyoların% 82 n iyi kalitede olduğunu ise blastula / gastrula embriyolar arasında, oligo-enjekte örneklerde embriyoların yaklaşık yarısı (anormal bölünme ve apoptoz neredeyse hiçbir işaret) iyi kalitedeile enjekte örnekleri (Şekil 3A). Enjekte örnekleri içinde% 60 ve parçalanan embriyoların% 29 (Şekil 3A) yaptı ise Son olarak,% 41 ve oligo enjekte örneklerde bölünen embriyolar% 11, sırasıyla, kas tepkisini ve yüzme larva aşamalarında ulaşmıştır. Bu ICSI embriyolar, normal ve anormal embriyolar (Şekil 3B) karışımlarıdır. Bazıları metamorfoz geçiren ve kurbağalar 8 olgun geliştirmek. Bu sonuçlar IVM ve ICSI takip GV oosit içine antisens oligonükleotitlerin, enjeksiyonu, etkili erken embriyo gelişimini sağlayan öneririz. Antisens oligos kendisi enjeksiyon embriyonik gelişimini azaltır rağmen, biz hala böyle gelişimsel oranları kontrol gibi birçok deneysel amaçlar için yeterli embriyolar elde edebiliyoruz, RT-PCR, böylece batı leke ve.

Şekil 1,
İncir ure 1: Xenopus tipik örnekleri, in vitro maturasyon deneyler için kaliteli ya da kötü kalite oosit laevis. (A) kötü kaliteli oosit bir örnek. Örneğin, yamalı pigmentasyon gösteren oositlerin daha sonraki deneyler için kullanılmamaktadır. Her Xenopus oosit çapı yaklaşık 1.2-1.4 mm laevis. (B) kısmen defolike oosit. oosit sağ yarısı kan damarlarının varlığı ile ayırt edilebilir folikül hücreleri, ile kaplıdır. Bir ok folikül hücreleri serbest ve enjeksiyon iğnesi enjekte edildiği içine bir alanı gösterir. (C) eşit büyüklükte ve hayvan yarımkürede ve bitkisel yarımkürede arasında açık kontrast eşit pigmentli hayvan hemisfer göstermek kaliteli oosit, bir örnek.

2496 / 52496fig2highres.jpg "/>
Şekil 2:. Xenopus öncesi ve olgunlaşma sonrası oosit laevis oosit olgunlaşması sonra, berrak beyaz lekeler hayvan hemisfer ve folikül hücreleri üst kısmında görünen soyulmuş edilir. Her bir Xenopus laevis oosit çapı yaklaşık 1 mm'dir.

Şekil 3,
Şekil 3: in vitro olgunlaştı oosit üretilen ICSI embriyoların, geliştirilmesi. Her aşamada ICSI embriyolar (A) Development özetlenmiştir. Kontrol IVM ve ICSI takip antisens oligonükleotidler (kontrol oligo enjeksiyon) veya enjeksiyon (non enjeksiyon) olmadan, şifreli olan oositler enjekte edildi. Her aşamada embriyolar gelen sayı çubukları üzerinde gösterilir. ± SEM gösterilir idi. N = 4-13 bağımsız deney / farklı females. (B) ICSI embriyoların hayatta örnekleri. Bu tailbud aşamasındaki embriyolar yaklaşık 200 oosit, bir başlangıç ​​materyali olarak kullanıldığı bir deneyde, imal edilmiştir.

Discussion

Biz burada detay anne faktörleri tüketmek ya da döllenme öncesi dışsal faktörleri aşırı ifade için yeni bir yöntem. Bu sistem iki microinjections gerektirir, ancak bunun yerine ev sahibi transferi yöntemi 7,17 kullanılan kurbağa ameliyatı, atlar. Bu hayvan bakımı açısından kurbağa ameliyatı adımı kaldırmak için en uygunudur. Dahası, biz deneylerin başarısını etkileyen bir faktör biyolojik kurtulmak anlamına transfer deneyleri için ev sahibi kadın kurbağa kalitesi dikkate almak zorunda değilsiniz. Bu nedenle, bu sistemde PMSG-prime kurbağa elde edilen oosit kalitesi başarılı deneyler için anahtar önemli bir biyolojik faktördür. oosit kalitesi yumurtalık veya sonrasında defolliculation toplandıktan sonra yargılanabilir. Herhangi bir anormallik bu aşamada görülürse, yeni bir kurbağa başka yumurtalık toplamak için en uygunudur. Eğer oosit kalitesini kontrol edebilirsiniz başka nokta oosit olgunlaşması peşinde. Eğer progesteron az% 80E-tedavi oosit olgunlaşma belirtileri gösteriyor, daha fazla analiz için embriyo yeterli sayıda elde etmek mümkün olmayabilir. enzimatik defolliculation yerine kılavuzu defolliculation kullanımı da defolliculation için gerekli emek azaltmak için bu sistemi kullanan bir başka avantajdır. Ancak, manuel defolliculation enzimatik tedaviden daha iyi bir gelişme verebilir ki hala mümkün.

Şekil 3'te gösterildiği gibi, in vitro olarak yaklaşık% 10, yüzme larva dönemini ulaşabilir oosit olgunlaşması. Bu veriler, 8 ve yeni enjeksiyon deneyleri rapor da dahil olmak üzere 13 bağımsız deneyden toplanan. Sunucu aktarma yöntemi transfer oosit% 30-60 neurula aşamasına 17 ulaşabilirsiniz beri anlamlı veri elde etmek için her tedavi 75-150 oosit ihtiyacı var. Önerilen yöntem, normal bölünen embriyolar, yaklaşık% 40-60 ulaşabildiklerinden her bir deney grubu 200-300 oosit ile başlarkas tepki aşaması. Bu veriler her iki yöntem de makul bir gelişim hızı desteklediğini gösteriyor. Biz şimdiye kadar bu yaklaşım metamorfoz ile gelişimini destekler belirten, bu tekniği kullanarak kontrol mRNA enjekte ve kontrol antisens oligo-enjekte oosit 10 canlı kurbağa almış.

Bizim oosit manipülasyon-ICSI yöntemi yakında döllenmeden sonra, çok erken embriyonik gelişimi sırasında maternal faktörlerin rolünü test etmek için bir fırsat sağlar. Buna ek olarak, gübreleme öncesi kromatin değiştirici faktörlerin ekspresyonu mümkün gelişimi için gerekli olan anne kromatin durumlarını anlamak için gübreleme öncesi anne kromatin pişmanlık yapabilir. Bu strateji, aynı zamanda bu bile gübreleme önce ifade edilebilir beri Transkripsiyon aktivatörü gibi efektör nükleaz (TALEN) 18,19 ve CRISPR / CAS9 20,21 olarak mevcut gen düzenleme sistemleri ile de çalışabilir. Bu nedenle, yeni bir yaklaşım potenti vardırark gelecek bir çok uygulama için kullanılır.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pregnant Mare Serum Gonadotropin (PMSG)  MSD Animal Health Vm 01708/4309 PMSG-Intervet 5000iu powder and solvent for solution for injection
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (MS222) Sigma A5040 For anesthesia
Liberase TM Research Grade Roche 05 401 127 001 For oocyte defolliculation. Store at -20 °C.
Drummond Nanoject Drummond Scientific Company 3-000-205/206 For microinjection
glass capillary  Alpha laboratories 7” Drummond #3-000-203-G/XL For microinjection
Micropipette Puller  SUTTER Instrument Model D-97 For microinjection
UltraPure Agarose Invitrogen 16500-500 For in vitro maturation and ICSI
14 ml ultra-clear centrifuge tube  Beckman Coulter United Kingdom Ltd 344060 For sperm purification
OptiPrep Density Gradient Medium (Iodixanol) Sigma D1556 For sperm purification
Digitonin Sigma D141 Cell permeabilization reagent
Shaker Hybaid  HB-SHK-1 For oocyte defolliculation
Dissecting microscope (Stereo zoom microscope) ZEISS Semi SV6 For oocyte collection and microinjection
50 μm pore filter CellTrics 04-0042-2317 For sperm purification
Ultracentrifuge Beckman Coulter Optima L-100XP For sperm purification
50 ml centrifuge tube Cellstar Greiner Bio-One 227261 or 210261 Oocyte collection and defolliculation reaction
15 ml centrifuge tube FALCON 352097 For sperm purification
90 mm Petri dish  Thermo Scientific 101VR20/C
Easy-Grip Cell Culture Dish, 60 x 15 mm FALCON 353004
Easy-Grip Cell Culture Dish, 35 x 15 mm FALCON 351008

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Miyamoto, K., Gurdon, J. B. Insights into the amphibian egg to understand the mammalian oocyte. Biology and Pathology of the Oocyte: Role in Fertility, Medicine, and Nuclear Reprogramming. Trounson, A., Gosden, R., Eichenlaub-Ritter, U. , Second, Cambridge University Press. 1-11 (2013).
  2. Heasman, J., Kofron, M., Wylie, C. Beta-catenin signaling activity dissected in the early Xenopus embryo: a novel antisense approach. Developmental biology. 222 (1), 124-134 (2000).
  3. Oelgeschlager, M., Kuroda, H., Reversade, B., De Robertis, E. M. Chordin is required for the Spemann organizer transplantation phenomenon in Xenopus embryos. Developmental cell. 4 (2), 219-230 (2003).
  4. Szenker, E., Lacoste, N., Almouzni, G. A developmental requirement for HIRA-dependent H3.3 deposition revealed at gastrulation in Xenopus. Cell reports. 1 (6), 730-740 (2012).
  5. Heasman, J., Holwill, S., Wylie, C. C. Fertilization of cultured Xenopus oocytes and use in studies of maternally inherited molecules. Methods in cell biology. 36, 213-230 (1991).
  6. Heasman, J., et al. Overexpression of cadherins and underexpression of beta-catenin inhibit dorsal mesoderm induction in early Xenopus embryos. Cell. 79 (5), 791-803 (1994).
  7. Hulstrand, A. M., Schneider, P. N., Houston, D. W. The use of antisense oligonucleotides in Xenopus oocytes. Methods. 51 (1), 75-81 (2010).
  8. Miyamoto, K., et al. Nuclear Wave1 is required for reprogramming transcription in oocytes and for normal development. Science. 341 (6149), 1002-1005 (2013).
  9. Halley-Stott, R. P., et al. Mammalian nuclear transplantation to Germinal Vesicle stage Xenopus oocytes - a method for quantitative transcriptional reprogramming. Methods. 51 (1), 56-65 (2010).
  10. Astrand, C., Belikov, S., Wrange, O. Histone acetylation characterizes chromatin presetting by NF1 and Oct1 and enhances glucocorticoid receptor binding to the MMTV promoter. Experimental cell research. 315 (15), 2604-2615 (2009).
  11. Amaya, E., Kroll, K. L. A method for generating transgenic frog embryos. Methods in molecular biology. 97, 393-414 (1999).
  12. Kroll, K. L., Amaya, E. Transgenic Xenopus embryos from sperm nuclear transplantations reveal FGF signaling requirements during gastrulation. Development. 122 (10), 3173-3183 (1996).
  13. Smith, S. J., Fairclough, L., Latinkic, B. V., Sparrow, D. B., Mohun, T. J. Xenopus laevis transgenesis by sperm nuclear injection. Nature protocols. 1 (5), 2195-2203 (2006).
  14. Drury, K. C., Schorderet-Slatkine, S. Effects of cycloheximide on the 'autocatalytic' nature of the maturation promoting factor (MPF) in oocytes of Xenopus laevis. Cell. 4 (3), 269-274 (1975).
  15. Smith, L. D., Ecker, R. E. Role of the oocyte nucleus in physiological maturation in Rana pipiens. Developmental biology. 19 (3), 281-309 (1969).
  16. Miyamoto, K., Pasque, V., Jullien, J., Gurdon, J. B. Nuclear actin polymerization is required for transcriptional reprogramming of Oct4 by oocytes. Genes & development. 25 (9), 946-958 (2011).
  17. Schneider, P. N., Hulstrand, A. M., Houston, D. W. Fertilization of Xenopus oocytes using the host transfer method. J. Vis. Exp. (45), (2010).
  18. Ishibashi, S., Cliffe, R., Amaya, E. Highly efficient bi-allelic mutation rates using TALENs in Xenopus tropicalis). Biology open. 1 (12), 1273-1276 (2012).
  19. Sakane, Y., et al. Targeted mutagenesis of multiple and paralogous genes in Xenopus laevis using two pairs of transcription activator-like effector nucleases. Development, growth & differentiation. 56 (1), 108-114 (2014).
  20. Nakayama, T., et al. Simple and efficient CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Xenopus tropicalis. Genesis. 51 (12), 835-843 (2013).
  21. Guo, X., et al. Efficient RNA/Cas9-mediated genome editing in Xenopus tropicalis. Development. 141 (3), 707-714 (2014).

Tags

Gelişimsel Biyoloji Sayı 96, oosit olgunlaştırma intrasitoplazmik sperm enjeksiyonu embriyonik gelişim maternal faktörler anne tükenmesi mikromaniplasyon gen girişim
Manipülasyon ve<em&gt; İn Vitro</emVe&gt; Olgunlaşma<em&gt; Xenopus laevis</emIntrasitoplazmik sperm enjeksiyonu izledi&gt; oositler, Embriyonik Geliştirme Çalışması
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Miyamoto, K., Simpson, D., Gurdon,… More

Miyamoto, K., Simpson, D., Gurdon, J. B. Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development. J. Vis. Exp. (96), e52496, doi:10.3791/52496 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter