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Developmental Biology

हेरफेर और Published: February 9, 2015 doi: 10.3791/52496
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2
1Wellcome Trust/Cancer Research UK Gurdon Institute, University of Cambridge, 2Department of Zoology, University of Cambridge

Introduction

Xenopus laevis विकास एक अध्ययन करने के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया, शक्तिशाली मॉडल जीव है। Xenopus अंडे और प्रचुर मात्रा में (स्तनधारी समकक्षों की तुलना के बारे में 0.1 मिमी होने में लगभग 1.2-1.4 मिमी) असामान्य रूप से बड़े हैं क्योंकि यह है। अंडे (4,000-8,000 कोशिकाओं के साथ मंच 8-8.5 पर होने वाली, एमबीटी) मध्य ब्लासटुला संक्रमण जब तक भ्रूण के विकास ड्राइव करने के लिए पर्याप्त हैं जो माता के रूप में संश्लेषित और संग्रहीत घटक होते हैं। एमबीटी तो आगे के विकास के लिए प्रत्यक्ष कि भ्रूण जीन उत्पादों का उत्पादन जो युग्मज जीनोम सक्रियण, के साथ है।

कई अध्ययनों के विकास के लिए महत्वपूर्ण मातृ कारकों की पहचान करने के उद्देश्य से। कई अध्ययनों से मातृ प्रोटीन के मामले गिरावट गेसट्रुला चरण 2-4 पर मनाया जा सकता है, जिसमें निषेचित भ्रूण में morpholino oligonucleotides सहित antisense oligonucleotides (oligos), के इंजेक्शन पर भरोसा करते हैं। वैकल्पिक रूप से, mRNAs निषेचित उन्हें इंजेक्ट कर रहे हैंbryos जीन कार्यों को परेशान करने या overexpressed प्रोटीन के भाग्य का पता लगाने के लिए। हालांकि, एक सेल चरण भ्रूण में इंजेक्शन सामान्य रूप से एमबीटी से पहले बहुत जल्दी भ्रूण चरणों में मातृ प्रोटीन की अभिव्यक्ति के स्तर को प्रभावित नहीं करता है।

Heasman और विलिए इस मुद्दे 5 पर काबू पाने के लिए मेजबान हस्तांतरण विधि की स्थापना की। उनकी विधि में, मैन्युअल defolliculated oocytes antisense oligos इंजेक्शन के साथ कर रहे हैं और मेजबान महिलाओं 6 में स्थानांतरित कर दिया। जल्दी भ्रूण के विकास में downregulated प्रोटीन की भूमिका की जांच की जा सकती है, ताकि प्रोटीन निषेचन से पहले downregulated कर रहे हैं। 7 में समीक्षा के रूप में यह मातृ कमी विधि, मातृ प्रोटीन की कई अनूठी विकासात्मक भूमिका की पहचान करने के लिए नेतृत्व किया।

निषेचन से पहले mRNA की मातृ कमी या overexpression पुस्तिका defolliculation और मेजबान हस्तांतरण के बिना हासिल की है, जिसमें इस रिपोर्ट में, हम विस्तार हमारे हाल ही में विकसित पद्धति में8। मैनुअल defolliculation समय और मेजबान हस्तांतरण की एक बहुत अक्सर इस प्रकार मातृ कमी विधि के लगातार उपयोग में बाधा, कुशल तकनीक और पशु शल्य चिकित्सा के लिए विशेष लाइसेंस की जरूरत है की आवश्यकता है। Defolliculation और मेजबान स्थानांतरण क्रमश: एंजाइमी defolliculation 9,10 और intracytoplasmic शुक्राणु इंजेक्शन (आईसीएसआई) 11-13 से प्रतिस्थापित कर रहे हैं। अंडे के लिए आईसीएसआई मूल ट्रांसजेनिक मेंढ़क 12 निर्माण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। शुक्राणु और भ्रूण नाभिक भी इन विट्रो परिपक्व उभयचर oocytes 11,14,15 में प्रत्यारोपित किया गया। यहाँ, हम थे कि इन विट्रो परिपक्व oocytes के लिए शुक्राणु इंजेक्षन करने के लिए हमारे कदम-दर-कदम विधि दिखाने antisense oligos या mRNA के साथ पूर्व इंजेक्शन।

Protocol

नोट: मेंढ़कों के साथ सभी प्रयोग ब्रिटेन के गृह मंत्रालय की आवश्यकताओं के बाद बाहर किया गया था।

Xenopus के 1. तैयारी Oocytes laevis

  1. लगभग एक सप्ताह डिम्बाणुजनकोशिका संग्रह से पहले, एक 27 जी सुई के साथ 1 मिलीलीटर बाँझ सिरिंज का उपयोग करके पूर्व भड़काना के लिए गर्भवती घोड़ी सीरम gonadotropin (PMSG) के 150 यू के साथ महिला मेंढ़क इंजेक्षन। इंजेक्शन पृष्ठीय लिम्फ थैली में subcutaneously किया जाता है।
    नोट: यह एक लंबे समय के लिए अंडे देना नहीं था कि मेंढ़क से पहले अंडे रखी कभी नहीं किया है कि (कम से कम आधे से अधिक वर्ष) या उपयोग करने के लिए हो सकता है।
  2. (: पर, 7:00-07:00: बंद 07:00-19:00) स्टोर प्रकाश नियंत्रित कमरे में 18 डिग्री सेल्सियस पर सेट एक पानी की टंकी में मेंढ़क-primed प्री।
  3. डिम्बाणुजनकोशिका संग्रह के दिन पर, (DDH 2 ओ) दोहरा आसुत जल के साथ गिराए द्वारा 10x एमबीएस स्टॉक से 1x संशोधित बार्थ का समाधान (एमबीएस) के एक एल तैयार करते हैं, और 10 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल के अंतिम एकाग्रता में पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन जोड़नेप्रत्येक (एमबीएस + पी एस)। 10x एमबीएस शेयर 880 मिमी NaCl, 10 मिमी KCl, 24 मिमी 3 NaHCO, 8.2 मिमी MgSO के होते हैं 4 2 हे .7H, 3.3 मिमी सीए (सं 3) 2 .4H 2 हे, 4.1 मिमी 2 CaCl .6H ओ 2, 100 मिमी HEPES, पीएच 7.5।
  4. Tricaine methanesulfonate की (400 μl में) 120 मिलीग्राम के चमड़े के नीचे इंजेक्शन (MS222) द्वारा एक पूर्व primed मेंढक anesthetize। पानी के साथ एक छोटे से टैंक में इंजेक्शन मेंढक रखें।
  5. 10 मिनट के बाद, सफलतापूर्वक संवेदनाहृत मेंढ़क इस का जवाब नहीं है, क्योंकि यह मोड़ पर द्वारा anesthetized मेंढक की जाँच करें। संज्ञाहरण अधूरा है, तो टैंक में बर्फ जोड़ सकते हैं और एक और 10 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें।
  6. पोंछ एक नम पर पृष्ठीय लेटना में छोटे टैंक और जगह से मेंढक उठाओ।
  7. संदंश और एक छोटी सी शल्य कैंची का प्रयोग, त्वचा चुटकी और midline के लिए पार्श्व पेट के निचले हिस्से में एक छोटा सा चीरा (2 सेमी) बनाते हैं। दूसरे पक्ष पर एक चीरा बनाओ।
  8. त्वचा काटने के बाद, मांसपेशियों की परत वाई लिफ्टवें संदंश मांसपेशी परत में चीरा बनाने के लिए और।
  9. पेशी परत कट जाता है के बाद अंडाशय निरीक्षण और संदंश का उपयोग चीरों से अंडाशय बाहर खींच।
  10. स्थानांतरण एमबीएस समाधान के साथ एक 50 मिलीलीटर ट्यूब अंडाशय निकाली गई।
    नोट: दोनों चीरों से जितना संभव हो उतना अंडाशय को इकट्ठा करने की कोशिश करो।
  11. बाद के उचित निपटान के लिए ठंड के द्वारा पीछा exsanguination द्वारा महिला मेंढक, वध।
  12. रक्त धुल जाता है, जब तक एमबीएस + पी एस के साथ निकाली अंडाशय कुछ बार कुल्ला। फिर, पुनश्च एमबीएस युक्त + एक 9 सेमी पेट्री डिश के लिए अंडाशय हस्तांतरण
    नोट: इस बिंदु पर एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत oocytes की गुणवत्ता की जाँच करें। Oocytes ऐसे पशु आधे (चित्रा 1 ए) में असमान रंजकता के साथ oocytes के रूप में जाहिरा तौर पर खराब गुणवत्ता, कर रहे हैं, आगे की प्रक्रिया और इसके बजाय एक नई अंडाशय प्राप्त नहीं है। आदर्श रूप में, oocytes समान रूप से pigmented पशु गोलार्द्धों है और लगभग समान रूप से आकार में होना चाहिए।
  13. छोटे टुकड़ों में अंडाशय छेड़ो(1-2 सेमी 2) और एक नया 50 मिलीलीटर ट्यूब में oocytes की 5 मिलीलीटर इकट्ठा।
  14. एमबीएस + पी एस के साथ फटे अंडाशय के 5 मिलीलीटर कुछ बार कुल्ला और 15 मिलीलीटर एमबीएस + पुनश्च जोड़ें।
  15. अंडाशय निलंबन के लिए defolliculation के लिए एंजाइम की 7 इकाइयों में जोड़ें (सामग्री की सूची देखें)।
    नोट: DDH 2 ओ के 10 एमएल (28 इकाइयों / एमएल) के साथ lyophilized एंजाइम पुनर्गठित। सामयिक कोमल घूमता साथ बर्फ पर 30 मिनट के लिए शीशी रखें। उपयोग करें जब तक -80 डिग्री सेल्सियस पर विभाज्य 250 μl और दुकान।
  16. कोमल (लगभग 0.014 XG के बराबर 15 REV / मिनट, कम गति) एक प्रकार के बरतन पर झटकों के साथ एक घंटा के लिए एंजाइम के साथ अंडाशय टुकड़ा सेते हैं।
    नोट: कूप कोशिकाओं, 2 घंटा एंजाइम सामान्य रूप से जरूरी है के साथ मिनट ऊष्मायन 15 घंटा 2 के लगभग पूरी तरह हटाने के लिए। अब ऊष्मायन डिम्बाणुजनकोशिका परमाणु हस्तांतरण प्रयोग 16 के लिए आवश्यक है।
  17. 1 घंटे ऊष्मायन के बाद, एमबीएस युक्त एक 6 सेमी पेट्री डिश के लिए एक छोटा सा व्यवहार किया oocytes की संख्या (10-20 oocytes) और हस्तांतरण लेने + पुनश्च exte जाँचेंएक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत defolliculation के NT। Oocytes एक दूसरे से अलग है और कम से कम आंशिक रूप से (चित्रा 1 बी) defolliculated रहे हैं, तो तुरंत अगले पड़ाव की प्रतिक्रिया (चरण 18) के लिए आगे बढ़ें। Oocytes अभी भी भारी कूप कोशिकाओं से घिरे रहे हैं, तो अधिकतम पर एक अतिरिक्त 15 मिनट के लिए सेते हैं।
  18. प्रतिक्रिया बंद करो और सतह पर तैरनेवाला त्यागने के लिए एमबीएस + पी एस के बहुत जोड़ें। 10 बार के लिए वाशिंग दोहराएँ।
    नोट: नहीं, बल्कि सीधे oocytes के लिए, एक 50 मिलीलीटर ट्यूब की दीवार से गिरने से एमबीएस + पुनश्च जोड़ें। एमबीएस + पुनश्च में निलंबन के बाद, छोटे अपरिपक्व oocytes धोने बफर के शीर्ष पर तैरने लगते हैं और इस तरह के छोटे चल oocytes त्यागने के लिए करते हैं।
  19. Washes के बाद, पी एस एमबीएस युक्त + एक 9 सेमी पेट्री डिश के लिए स्थानांतरण
    नोट: इस कदम के बाद, 16-18 डिग्री सेल्सियस पर जितना संभव हो उतना oocytes रखने से। यह एक तापमान नियंत्रित मंच पर oocytes युक्त पकवान रखने के द्वारा किया जा सकता है।
  20. ड्यूमॉन्ट के वर्गीकरण के अनुसार चरण छठी oocytes का चयन करेंएमबीएस + पुनश्च Oocyte स्थानांतरण युक्त एक नया 9 सेमी पेट्री डिश के लिए बाद में उपयोग करता है और हस्तांतरण के लिए एक उपयुक्त टिप आकार (डिम्बाणुजनकोशिका आकार से भी बड़ा) के साथ एक गिलास पिपेट का उपयोग करके किया जा सकता है।
    नोट: अच्छी गुणवत्ता oocytes पशु गोलार्द्ध और वनस्पति गोलार्द्ध के बीच स्पष्ट विपरीत के साथ एक समान रूप से pigmented पशु गोलार्द्ध होनी चाहिए, और लगभग समान रूप से (चित्रा 1C) आकार। स्टेज छठी oocytes पूरी तरह से (डिम्बाणुजनकोशिका व्यास के बारे में 1.2-1.4 मिमी) प्रोजेस्टेरोन का जवाब कर सकते हैं कि oocytes उगाया का प्रतिनिधित्व करते हैं।

Oocytes में प्रतिसंवेदी oligonucleotides या mRNA की 2. इंजेक्शन

नोट: इस खंड में सभी चरणों का तापमान नियंत्रित घूम पानी के साथ या बर्फ से भरा एक प्लास्टिक के बॉक्स पर सुसज्जित एक खुर्दबीन मंच पर 16-18 डिग्री सेल्सियस पर किया जाना चाहिए।

  1. Microinjection प्रदर्शन किया जाएगा, जिसमें एमबीएस + पी एस के साथ भरा एक नया 9 सेमी पेट्री डिश में 200-300 चयनित oocytes स्थानांतरण।
    नोट: पूर्वी वायु कमान मेंएच हालत, 200-300 oocytes सामान्य रूप से उपयोग किया जाता है। कुल में, लगभग 1000 oocytes एक प्रयोग में इस्तेमाल किया जाता है।
  2. Antisense oligos या mRNA की इंजेक्शन तैयार करने के लिए, एक microinjector की धातु सवार बेदखल।
  3. सिरिंज का उपयोग खनिज तेल के साथ एक गिलास केशिका भरें और microinjector की धातु सवार को तेल से भरा गिलास केशिका डालें।
    ध्यान दें: एक गिलास केशिका micropipette खींचने से खींच लिया है। इन सुइयों सुझावों को नुकसान पहुँचाए बिना एक बॉक्स में रखा जाता है।
  4. संभव के रूप में इंजेक्शन के लिए छोटे व्यास टिप के रूप में लक्ष्य से एक खुर्दबीन के नीचे छोटे शल्य कैंची का उपयोग कर सुई की नोक काटें।
    नोट: सुई टिप एक माइक्रो फोर्ज या micropipette beveler का उपयोग करके बढ़ाई जा सकती है। 25 डिग्री के कोण पर सुई बेवल करने डिम्बाणुजनकोशिका दीवार मर्मज्ञ की क्षमता में सुधार।
  5. एक विदारक माइक्रोस्कोप के मंच पर parafilm का एक छोटी सी पट्टी प्लेस और antisense oligo या mRNA के समाधान का एक तीन μl बूंद बांटना।
  6. तिवारी हटोसमाधान की छोटी छोटी बूंद में इंजेक्शन की सुई के पी और समाधान के साथ सुई भरने के इंजेक्शन जा।
    नोट: इंजेक्शन सुई की नोक बहुत छोटा है, तो हवा के बुलबुले धातु सवार की नोक पर दिखाई देनी चाहिए। फिर, ऐसा नहीं होता है जब तक इंजेक्शन की सुई पर एक बड़ा टिप बनाते हैं।
  7. लगभग 0.5 मिमी दूर सिरे से इंजेक्शन की सुई के निशान। इस मार्क इंजेक्शन गहराई का एक संकेतक के रूप में प्रयोग किया जाता है।
  8. धीरे इंजेक्शन के दौरान अवांछनीय डिम्बाणुजनकोशिका आंदोलन को रोकने के लिए संदंश के साथ इंजेक्शन बात करने के लिए डिम्बाणुजनकोशिका के विपरीत दिशा में धारण करते हुए (कीटाणु पुटिका के नीचे) डिम्बाणुजनकोशिका के केंद्र बिंदु करने के लिए लक्ष्य द्वारा इक्वेटोरियल सीमा के साथ एक oocyte में सुई की नोक डालें ।
    नोट: कूप कोशिकाओं (चित्रा 1 बी) से मुक्त क्षेत्र का पता लगाएं, और यहां तक कि एक ठीक सुई अक्सर कूप कोशिकाओं की एक परत घुसना नहीं कर सकते, क्योंकि उस स्थान से सुई डालें।
  9. 4.6 एनजी / 4.6 nl या antis के 9.2 एनजी / 9.2 nl बेदखलense oligos, या पैर स्विच का उपयोग करके mRNA की एक उचित मात्रा (13.8 एनजी 250 पीजी)। Antisense oligo तैयारी का विवरण 7 में वर्णित हैं।
  10. 0.1% BSA के साथ पूरक एमबीएस + पी एस के साथ भरा एक 6 सेमी पेट्री डिश में इंजेक्शन oocytes स्थानांतरण (Oocyte ऊष्मायन मध्यम, एक .45 माइक्रोन ताकना फिल्टर का उपयोग कर समाधान बाँझ)।
  11. 16 में oocytes सेते डिग्री सेल्सियस या 1-2 दिनों के लिए 18 डिग्री सेल्सियस।
    नोट: इंजेक्ट oocytes जो मामले में 4.6 एनजी antisense oligos के इंजेक्शन के लिए बेहतर है, इंजेक्शन के बाद इन विट्रो परिपक्वता कई घंटे के लिए किए जा सकते हैं। एक सामान्य नियम के बाद भ्रूण के विकास के लिए बेहतर, ऊष्मायन अवधि कम है कि है।

Oocytes की इन विट्रो परिपक्वता (IVM) 3.

  1. Oocyte परिपक्वता प्रयोग की शाम को, सेल्सियस फ्रीजर से -80 प्रोजेस्टेरोन शेयर समाधान (इथेनॉल में 30 मिमी) लाने के लिए और कमरे मंदिर में अवक्षेप भंगकभी कभी भंवर के साथ तापमान।
    नोट: प्रोजेस्टेरोन शेयर आम तौर पर 1 घंटे के लिए 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर छोड़ दिया है।
  2. (; 3 माइक्रोन में प्रोजेस्टेरोन के अंतिम एकाग्रता परिपक्वता मध्यम) और समान रूप से समाधान में प्रोजेस्टेरोन वितरित करने के लिए 30 मिनट के लिए एक प्रकार के बरतन पर हिला एमबीएस + पी एस के 50 मिलीलीटर में प्रोजेस्टेरोन शेयर के 5 μl जोड़ें।
  3. इन विट्रो परिपक्वता के इलाज के लिए agarose लेपित 6 सेमी व्यंजन तैयार करते हैं।
    1. मैग्नीशियम और कैल्शियम के बिना 1x एमबीएस के 50 मिलीलीटर agarose की 1 ग्राम जोड़ें।
    2. एक माइक्रोवेव में हीटिंग द्वारा agarose भंग।
    3. व्यंजन के नीचे कवर करने के लिए 6 सेमी व्यंजन को agarose समाधान की एक छोटी मात्रा डालो।
    4. दृढ़ीभवन तक 30 मिनट के लिए कम से कम रुको।
    नोट: Agarose कोटिंग व्यंजन को oocytes की चिपके रोकता है। एक बार कसकर व्यंजन से जुड़े होते हैं इन विट्रो परिपक्व oocytes में, यह oocytes वे जिले से सेना की टुकड़ी के दौरान प्राप्त होने वाली उत्तेजनाओं से सक्रिय हो जाएगा कि सबसे अधिक संभावना हैवह।
  4. परिपक्वता माध्यम की 5-8 मिलीलीटर व्यंजन agarose में लिपटे और प्रत्येक 6 सेमी व्यंजन में 200-300 oocytes स्थानांतरित करने के लिए डालो।
    नोट: डिम्बाणुजनकोशिका ऊष्मायन माध्यम की एक न्यूनतम राशि के साथ oocytes स्थानांतरित करने के लिए प्रयास करें।
  5. 16 डिग्री सेल्सियस पर 16 घंटा के लिए सेते हैं।
    नोट: उदाहरण के लिए, 5 बजे उपचार शुरू करने और अगले दिन पर 09:00 पर खत्म।

4. intracytoplasmic शुक्राणु इंजेक्शन (आईसीएसआई)

  1. जमे हुए शुक्राणु शेयर तैयारी
    नोट: निम्न शुक्राणु तैयारी oocyte परिपक्वता प्रयोग शुरू करने से पहले किया जाना चाहिए, और जमे हुए शुक्राणु शेयरों आईसीएसआई के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाता है।
    1. वसा खींच लिए छोड़कर, कदम 1.4-1.11 का पालन करके एक नर मेंढक से वृषण लीजिए और चीरों संदंश का उपयोग और वसा से वृषण हटाने से बाहर वृषण।
    2. 1x मार्क संशोधित Ringers (एमएमआर, 100 मिमी NaCl, 2 मिमी KCl, 1 मिमी MgSO 4, 2 मिमी 2 CaCl, 5 मिमी HEPES, 7.4 पीएच) में वृषण धो लें।
    3. वसा एक निकालेंसंदंश का उपयोग शेष रक्त वाहिकाओं को हटाने के द्वारा फिर एक साफ टिशू पेपर पर धोया वृषण रोलिंग और से घ रक्त वाहिकाओं।
    4. 1x एमएमआर के 1 मिलीलीटर युक्त 3.5 सेमी पेट्री डिश में प्रत्येक वृषण रखें।
    5. ठीक कैंची के साथ अनुलंबीय काटें, और कोई बड़ी टुकड़े रहते हैं जब तक संदंश के साथ छोटे टुकड़ों में आंसू।
    6. पिपेट ऊपर और 1 मिलीलीटर प्लास्टिक जिसका अंत कट जाता है टिप, और भार एक गिलास homogenizer में कुचल वृषण समाधान के 1 एमएल का उपयोग कर नीचे।
    7. 2-3 स्ट्रोक से उन्हें homogenize और फिर एक 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब के शीर्ष से जुड़ी 50 माइक्रोन ताकना फिल्टर पर समाधान डालना। समाधान फिल्टर के माध्यम से जाने के लिए अनुमति दें।
    8. 1x एमएमआर के 1 मिलीलीटर में शेष कटौती वृषण resuspending द्वारा दोहराएँ चरण 4.1.7। अंत में, 1x एमएमआर के साथ homogenizer के समय की एक जोड़ी धोने और फिल्टर के माध्यम से इसे पारित।
    9. दोहराएँ एक 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में अन्य वृषण और पूल दो वृषण के लिए 4.1.8 करने के लिए 4.1.5 कदम।
    10. 4 में 800 XG पर कोशिकाओं स्पिन6; 20 मिनट के लिए सी।
    11. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 1x एमएमआर के 2 मिलीलीटर में pelleted कोशिकाओं resuspend। फिर, एक नया ट्यूब में हस्तांतरण।
      नोट: कोई दिखाई दे रक्त कोशिकाओं मौजूद हैं कि सुनिश्चित करें।
    12. एक 14 मिलीलीटर अल्ट्रा स्पष्ट अपकेंद्रित्र ट्यूब में एक कदम ढाल तैयार करें। नीचे की परत: 30% iodixanol के 4 मिलीलीटर। दूसरा नीचे की परत: 20% iodixanol के 1 मिलीलीटर। तीसरा नीचे की परत: 12% iodixanol के 5 मिलीलीटर। ऊपर परत: 1x एमएमआर के 2 मिलीलीटर में कोशिकाओं वृषण। (नीचे चरण परेशान करने के लिए नहीं धीरे धीरे उपरिशायी) 1 मिलीलीटर विंदुक टिप के साथ बहुत धीरे ढ़ाल ओवरले।
      नोट: 30% iodixanol का सिर्फ एक परत भी केवल शुक्राणु अलग-थलग करने के लिए काम करना चाहिए।
    13. (एक ब्रेक के बिना मंदी) 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 10,000 XG पर ultracentrifuge का उपयोग कर SW40 रोटर में स्पिन।
    14. धीरे ultracentrifuge से ट्यूब को हटा दें। ढाल के प्रत्येक स्तर और नीचे गोली के बीच एक अंतरफलक की पुष्टि करें।
    15. गोली से शुक्राणु अंश लीजिए।
    16. शुक्राणु PEL Resuspendiodixanol बाहर धोने के लिए 1x एमएमआर में करते हैं। 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 800 XG पर स्पिन।
      नोट: शुक्राणु का एक बहुत अभी भी 4 डिग्री सेल्सियस पर 3220 XG पर सतह पर तैरनेवाला 20 मिनट के लिए स्पिन, फिर से स्पिन के बाद निलंबन में रहते हैं और pelleted शुक्राणु पूल हैं।
    17. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 1x परमाणु तैयारी बफर के 1 मिलीलीटर में शुक्राणु गोली resuspend (NPB; 250 मिमी सुक्रोज, 0.5 मिमी spermidine trihydrochloride, 0.2 मिमी Spermine tetrahydrochloride, 1 मिमी EDTA, 15 मिमी HEPES, पीएच 7.7) 13। फिर, एक Eppendorf ट्यूब को हस्तांतरण।
    18. 50 मिलीग्राम / एमएल पर 1x NPB (DMSO में Resuspend Digitonin पाउडर में 50 10 मिलीग्राम की μl / एमएल Digitonin समाधान जोड़ें और -80 डिग्री सेल्सियस पर aliquots फ्रीज। उपयोग करने से पहले, 10 मिलीग्राम से 50 मिलीग्राम / एमएल विभाज्य पतला / मिलीलीटर के साथ 1x NPB। 10 मिलीग्राम / एमएल Digitonin जमे हुए और -20 डिग्री सेल्सियस और फिर से इस्तेमाल किया) शुक्राणु समाधान के मिलीलीटर करने के लिए 1 पर संग्रहित किया जा सकता है अप्रयुक्त।
    19. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए सेते हैं।
    20. DAPI धुंधला (एक वित्तीय और प्रक्रियात्मक पहलुओं के रूप में 0.3 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / DAPI के द्वारा एक permeabilization के दर की जाँच करेंएल एकाग्रता)। कोशिकाओं के कम से कम 95% permeabilized कर रहे हैं, एक लंबा सा सेते हैं।
      नोट: बहुत से शुक्राणु कोशिकाओं (शुक्राणु कई वृषण से एकत्र कर रहे हैं, खासकर जब) एक ही समय में incubated रहे हैं कभी कभी, तो यह जो मामले में यह Digitonin के एक अतिरिक्त छोटी राशि जोड़ने के लिए आवश्यक हो सकता है, permeabilize के लिए मुश्किल है; शुक्राणु की 20% permeabilized नहीं कर रहे हैं, उदाहरण के लिए, Digitonin की एक अतिरिक्त 20 μl जोड़ा गया है।
    21. 3% अंतिम एकाग्रता के लिए 10% बीएसए जोड़कर permeabilization के बंद करो।
    22. 4 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं स्पिन।
      नोट: 5 मिनट के लिए 100 XG के साथ शुरू से जितना संभव हो कम centrifugation गति की कोशिश करें। पर्याप्त नहीं है, गति और / या समय में वृद्धि।
    23. कदम 4.1.22 के रूप में एक ही रफ्तार से 0.3% 1x NPB में बीएसए और सेंट्रीफ्यूज के साथ कोशिकाओं को धो लें। इस बीच, शुक्राणु भंडारण बफर तैयार (एसएसबी; 2x NPB के 2 मिलीलीटर, 10% बीएसए, ग्लिसरॉल autoclaved 1.2 मिलीलीटर, एच 2 ओ के 680 μl के 120 μl)।
    24. शुक्राणु के लिए एसएसबी के 500 μl जोड़ेंगोली। ऊपर और नीचे पिपेट कई बार कोशिकाओं को नुकसान नहीं क्रम में एक कट टिप के साथ resuspend।
    25. 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात संतुलित करने की अनुमति दें।
    26. ऊपर और एक कट टिप के साथ कई बार नीचे कोशिकाओं पिपेट।
    27. Hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की गिनती करने के लिए 10 बार 1x एमएमआर में या 1x पीबीएस में microliters के एक जोड़े को पतला।
    28. एक एकल उपयोग aliquots में -80 डिग्री सेल्सियस से कम 30,000 शुक्राणु / μl (या अधिक) सीधे -80 डिग्री सेल्सियस पर और दुकान पर aliquots के रूप में रुक।
  2. इन विट्रो के लिए आईसीएसआई oocytes परिपक्व
    नोट: oocytes शामिल सभी प्रक्रियाओं को 16-18 डिग्री सेल्सियस पर किया जाना चाहिए।
    1. परिपक्व oocytes स्थानांतरित करने के लिए एक गिलास पिपेट तैयार करें।
      नोट: कांच पिपेट विस्तृत पर्याप्त फैलाएंगे बिना oocytes समायोजित करने के लिए किया जाना है।
    2. सोलह घंटे प्रोजेस्टेरोन युक्त मध्यम करने के लिए oocytes जाने के बाद, स्थानांतरण धोने के लिए एमबीएस + पी एस के साथ भरा एक 6 सेमी agarose लेपित डिश में oocytes परिपक्व।
      नोट: महत्वपूर्ण बात है, मीatured oocytes अत्यंत सावधानी से इलाज किया जाना है। Oocytes की किसी न किसी उपचार शुक्राणु इंजेक्शन से पहले सहज सक्रियण उत्पन्न हो सकता है।
    3. कीटाणु पुटिका टूटने (चित्रा 2) निकलता है, जो सफेद धब्बे की उपस्थिति की पुष्टि करने से परिपक्व oocytes गणना। परिपक्वता की दर 80% से कम है, तो इसे आगे के विश्लेषण के लिए भ्रूण जीवित रहने के लिए पर्याप्त संख्या में प्राप्त करने की संभावना नहीं है।
      नोट: शेष कूप कोशिकाओं oocyte परिपक्वता के बाद खुली हैं (चित्रा 2)।
    4. इंजेक्शन के माध्यम से भरा एक नया agarose लेपित 6 सेमी डिश के लिए एमबीएस धोने से स्थानांतरण oocytes (: Ficoll (6%) की 30 ग्राम, 20 10x एमएमआर की मिलीलीटर और 1,000x पुनश्च शेयर के 500 μl 500 मिलीलीटर तैयार)।
    5. आईसीएसआई शुरू करने से पहले कम से कम 30 मिनट सेते हैं।
    6. चरणों 2.2-2.4 में वर्णित के रूप में microinjector सेट करें।
      नोट: इंजेक्शन सुई की नोक आकार कदम 2.6 में वर्णित प्रक्रिया का पालन करके संभव के रूप में छोटे रूप में रखा जाता है। व्याससुई के 20-40 माइक्रोन है। कुशल इंजेक्शन अनुमति हो सकती है 2.4 चरण में वर्णित के रूप में सुई टिप बेवल करने के लिए।
    7. शुक्राणु विभाज्य लायें और शुक्राणु कमजोर पड़ने बफर (SDB; 250 मिमी sucrose, 75 मिमी KCl, 0.5 मिमी spermidine, 0.2 मिमी Spermine, 200 माइक्रोन HEPES पीएच 7.5) में शुक्राणु निलंबन पतला।
      नोट: एक सुई आकार पर और इतने पर निर्भर करता कमजोर पड़ने अलग किया जा सकता है। एक प्रारंभिक कोशिश के रूप में 30,000 शुक्राणु / μl शेयर से 120 गुना पतला और यदि आवश्यक हो तो आगे समायोजित करें।
    8. एक विदारक माइक्रोस्कोप के मंच पर parafilm का एक छोटी सी पट्टी रखें। Pipetting द्वारा शुक्राणु इंजेक्शन समाधान मिक्स और शुक्राणु समाधान के कुछ μl बूंद बांटना।
    9. , सुई में पतला शुक्राणु निलंबन चूसो एक खुर्दबीन स्लाइड पर 0.3 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / DAPI युक्त दस लगातार बूंदों में 4.6 nl इंजेक्षन, और जल्दी से एक फ्लोरोसेंट खुर्दबीन पर इंजेक्शन प्रति वितरित शुक्राणु की संख्या गिनती।
      नोट: इंजेक्शन प्रति 1-2 शुक्राणु निशाना लगाओ। यदि आवश्यक हो, अधिक शुक्राणु इंजेक्शन समाधान पतलाऔर एक वांछित एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए जब तक फिर से इंजेक्शन प्रति शुक्राणु की संख्या की जाँच करें।
    10. परीक्षण इंजेक्शन समाधान निकालें और एक उचित एकाग्रता के साथ एक नया शुक्राणु इंजेक्शन समाधान भरें।
    11. 100 परिपक्व oocytes के लिए शुक्राणु समाधान के 4.6 nl इंजेक्षन।
      नोट: यह लगातार समाधान इंजेक्षन करने के लिए महत्वपूर्ण है। सबसे पहले 4.6 NL (आम तौर पर 1-2 सेकंड) बाहर खदेड़ना के लिए आवश्यक समय निर्धारित करते हैं। निम्नलिखित प्रक्रिया को दोहराएं; एक oocyte में इंजेक्षन, एक oocyte में इंजेक्षन कुछ सेकंड के लिए प्रतीक्षा करें, इंजेक्शन समाधान में एक सुई और नकली इंजेक्शन निकालने के लिए, कुछ सेकंड के लिए प्रतीक्षा करें। यह सतत इंजेक्शन भी सुई की नोक के अवरुद्ध रोकता है। वैकल्पिक रूप से, एक पंप का उपयोग विधि 13 में इस्तेमाल किया जा सकता है।
    12. बाद लगभग 100 इंजेक्शन, शेष शुक्राणु समाधान बेदखल करना और (वितरण से पहले ऊपर और नीचे एक ही शुक्राणु समाधान का उपयोग, लेकिन पिपेट) शुक्राणु समाधान फिर से भरना।
      नोट: सुई अच्छी तरह से शुक्राणु समाधान चूसना नहीं करता है, जरूरत के टिप कटौतीLe। इस स्थिति में सुधार नहीं होता है, तो एक नई सुई तैयार करते हैं।
    13. सभी oocytes इंजेक्ट कर रहे हैं जब तक इंजेक्शन प्रक्रिया को दोहराएं।
      नोट: डिम्बाणुजनकोशिका गुणवत्ता अच्छी है और इंजेक्शन सफल होता है, इंजेक्ट oocytes के संकुचन इंजेक्शन समय के 20 मिनट के भीतर देखा जाता है।
    14. 16 डिग्री सेल्सियस या 18 के लिए इंजेक्शन व्यंजन हटो   सी इनक्यूबेटर °।
    15. 4-5 घंटा इंजेक्शन के बाद, आईसीएसआई भ्रूण की दरार दर की जाँच करें।
      नोट: उन भ्रूणों की दरार कूंड़ सामान्य निषेचित भ्रूण के उन लोगों के रूप में स्पष्ट नहीं हो सकता है। कुछ भ्रूण भी कई शुक्राणु इंजेक्शन की वजह से हो सकता है जो असामान्य चोली, दिखाते हैं।
    16. ऊष्मायन मध्यम करने के लिए असामान्य रूप से cleaved भ्रूण सहित स्थानांतरण cleaved भ्रूण (500 मिलीलीटर की तैयारी: Ficoll (4%), 5 10x एमएमआर की मिलीलीटर और 1,000x पुनश्च शेयर के 500 μl के 20 ग्राम)।
    17. 16 में या तो भ्रूण सेते   रातोंरात डिग्री सेल्सियस या 18 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर।
    18. अगली सुबह, स्थानांतरण Embryऔर 0.1x एमएमआर ओएस भ्रूण जीवित गिनती।
    19. औसत पर, शुक्राणु इंजेक्शन oocytes की लगभग 10% तैराकी टैडपोल चरण (चित्रा 3A) को विकसित कर सकते हैं।

Representative Results

इन विट्रो परिपक्व oocytes में उपयोग करते हुए आईसीएसआई भ्रूण के भ्रूण विकास (चित्रा 3A) जांच की गई थी। MII चरण के लिए जीवी oocytes की परिपक्वता दरों चर रहे हैं और काफी हद तक डिम्बाणुजनकोशिका गुणवत्ता पर निर्भर करता है। अच्छा प्रयोगों में, जीवी oocytes की लगभग 100% अंत में MII चरण में अंडे बनने, oocyte परिपक्वता की प्रोजेस्टेरोन और दिखाने के संकेत का जवाब। सभी परिपक्व oocytes आईसीएसआई के अधीन और इंजेक्शन cleaved अंडे के बारे में 25% (चित्रा 3 ए, एन = नियंत्रण के लिए 13 oligo इंजेक्शन oocytes तले और एन = नहीं oligo इंजेक्शन oocytes के लिए 7) थे। लगभग 60% या नियंत्रण oligo इंजेक्शन oocytes या गैर इंजेक्शन oocyte से उत्पादित cleaved भ्रूण का 80%, क्रमशः, ब्लासटुला / गेसट्रुला चरण में पहुंच गया। ब्लासटुला / गेसट्रुला भ्रूण के 82% एन में अच्छी गुणवत्ता के थे जबकि ब्लासटुला / गेसट्रुला भ्रूण के अलावा, oligo इंजेक्शन के नमूने में भ्रूण के लगभग आधे (असामान्य दरार और apoptosis की लगभग कोई संकेत नहीं) अच्छी गुणवत्ता के थेपर इंजेक्शन के नमूने (चित्रा 3A)। गैर इंजेक्शन के नमूने में 60% और cleaved भ्रूण की 29% (चित्रा 3A) ने किया, जबकि अंत में, 41% और oligo इंजेक्शन के नमूने में cleaved भ्रूण की 11%, क्रमशः, मांसपेशियों की प्रतिक्रिया और तैराकी टैडपोल चरणों पर पहुंच गया। ये आईसीएसआई भ्रूण सामान्य और असामान्य भ्रूण (3B चित्रा) का मिश्रण हैं। उनमें से कुछ कायापलट से गुजरना और मेंढ़कों 8 परिपक्व करने के लिए विकसित करना। इन परिणामों के IVM और आईसीएसआई द्वारा पीछा जीवी oocytes में antisense oligonucleotides, इंजेक्शन, कुशल जल्दी भ्रूण के विकास की अनुमति देता है कि सलाह देते हैं। Antisense oligos खुद के इंजेक्शन भ्रूण विकास कम हो जाती है, हम अभी भी इस तरह के विकास की दरों की जाँच के रूप में कई प्रयोगात्मक प्रयोजनों के लिए पर्याप्त भ्रूण प्राप्त करने में सक्षम हैं, आरटी पीसीआर, इतने पर पश्चिमी धब्बा और।

चित्र 1
अंजीर ure 1: Xenopus की विशिष्ट उदाहरण में इन विट्रो परिपक्वता प्रयोगों के लिए अच्छी गुणवत्ता या खराब गुणवत्ता के oocytes laevis। (ए) खराब गुणवत्ता oocytes की एक उदाहरण है। उदाहरण के लिए, बद रंजकता दिखा oocytes बाद के प्रयोगों के लिए इस्तेमाल नहीं कर रहे हैं। प्रत्येक Xenopus डिम्बाणुजनकोशिका व्यास में लगभग 1.2-1.4 मिमी है laevis। (बी) के एक आंशिक रूप से defolliculated डिम्बाणुजनकोशिका। डिम्बाणुजनकोशिका के ठीक आधे रक्त वाहिकाओं की उपस्थिति से पहचाना जा सकता है जो कूप कोशिकाओं द्वारा कवर किया जाता है। एक तीर कूप कोशिकाओं से मुक्त और इंजेक्शन की सुई से इंजेक्शन है जिसमें एक क्षेत्र से पता चलता है। (सी) समान रूप से आकार के होते हैं और जानवर गोलार्द्ध और वनस्पति गोलार्द्ध के बीच स्पष्ट विपरीत के साथ समान रूप से pigmented पशु गोलार्द्धों जो बताते हैं कि अच्छी गुणवत्ता oocytes, का एक उदाहरण है।

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चित्रा 2:। Xenopus पहले और परिपक्वता के बाद oocytes laevis oocyte परिपक्वता के बाद, स्पष्ट सफेद धब्बे पशु गोलार्द्धों और कूप कोशिकाओं के शीर्ष पर दिखाई खुली हैं। प्रत्येक Xenopus laevis डिम्बाणुजनकोशिका लगभग व्यास में 1 मिमी है।

चित्र तीन
चित्रा 3: इन विट्रो परिपक्व oocytes में से उत्पादित आईसीएसआई भ्रूण का विकास। प्रत्येक चरण के लिए आईसीएसआई भ्रूण की (ए) विकास संक्षेप। नियंत्रण IVM और आईसीएसआई द्वारा पीछा antisense oligonucleotides के (नियंत्रण oligo इंजेक्शन) या इंजेक्शन (गैर इंजेक्शन) के बिना, तले साथ oocytes इंजेक्शन थे। प्रत्येक चरण में भ्रूण की इसी संख्या सलाखों के ऊपर दिखाया गया है। ± SEM के दिखाया गया है इसका मतलब। एन = 4-13 स्वतंत्र प्रयोगों / अलग चemales। (बी) आईसीएसआई भ्रूण जीवित के उदाहरण हैं। ये tailbud चरण भ्रूण लगभग 200 oocytes एक प्रारंभिक सामग्री के रूप में इस्तेमाल किया गया, जिसमें एक प्रयोग है, में तैयार किए गए।

Discussion

हम यहाँ विस्तार मातृ कारकों खलाना करने के लिए या निषेचन से पहले बहिर्जात कारकों overexpress करने के लिए एक नई विधि। इस प्रणाली के दो microinjections की आवश्यकता है, लेकिन इसके बजाय मेजबान हस्तांतरण विधि 7,17 में इस्तेमाल मेंढ़क की सर्जरी, रुक जाती है। यह जानवरों की देखभाल के मामले में मेंढक सर्जरी कदम दूर करने के लिए हो सकता है। इसके अलावा, हम हम प्रयोगों की सफलता को प्रभावित करता है कि एक जैविक कारक से छुटकारा मिल सकता जिसका अर्थ है कि स्थानांतरण के प्रयोगों के लिए मेजबान महिला मेंढ़क की गुणवत्ता के लिए खाते में लेने की जरूरत नहीं है। इसलिए इस प्रणाली में PMSG-primed मेंढ़क से प्राप्त oocytes की गुणवत्ता सफल प्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण है कि एक प्रमुख जैविक कारक है। oocytes की गुणवत्ता अंडाशय या बाद defolliculation के संग्रह के बाद आंका जा सकता है। कोई असामान्यता इन चरणों में मनाया जाता है, यह एक नए मेंढक से एक और अंडाशय इकट्ठा करने के लिए हो सकता है। आप डिम्बाणुजनकोशिका गुणवत्ता की जांच कर सकते हैं जब एक और मुद्दा oocyte परिपक्वता के बाद है। यदि progesteron के कम से कम 80%ई-इलाज किया oocytes परिपक्वता के लक्षण दिखाने के लिए, आप आगे के विश्लेषण के लिए भ्रूण की पर्याप्त संख्या प्राप्त करने में सक्षम नहीं हो सकता है। एंजाइमी defolliculation के बजाय पुस्तिका defolliculation का उपयोग भी defolliculation के लिए आवश्यक श्रम को कम करने के लिए इस प्रणाली का उपयोग करने का एक और फायदा है। हालांकि, यह पुस्तिका defolliculation एंजाइमी उपचार की तुलना में एक बेहतर विकास दे सकता है कि अभी भी संभव है।

चित्रा 3 में दिखाया गया है, इन विट्रो का लगभग 10% तैराकी टैडपोल मंच तक पहुँच सकते हैं oocytes परिपक्व। ये आंकड़े 8 और नए इंजेक्शन प्रयोगों रिपोर्ट में उन लोगों सहित 13 स्वतंत्र प्रयोगों से एकत्र कर रहे हैं। होस्ट हस्तांतरण विधि का तबादला oocytes की 30-60% neurula चरण 17 तक पहुँच सकते हैं के बाद से सार्थक डेटा प्राप्त करने के लिए प्रत्येक उपचार में 75-150 oocytes की जरूरत है। हमारे विधि सामान्य रूप से cleaved भ्रूण का लगभग 40-60% तक पहुँच सकते हैं के बाद से प्रत्येक प्रयोगात्मक समूह में 200-300 oocytes के साथ शुरू होता हैपेशी प्रतिक्रिया चरण। इन आंकड़ों के दोनों तरीकों एक उचित विकास दर का समर्थन करते हैं। हम अब तक इस दृष्टिकोण कायापलट के माध्यम से विकास का समर्थन करता है, यह दर्शाता है कि इस तकनीक का उपयोग कर नियंत्रण mRNA के इंजेक्शन और नियंत्रण antisense oligo इंजेक्शन oocytes से 10 जिंदा मेंढ़क प्राप्त किया है।

हमारे डिम्बाणुजनकोशिका हेरफेर-आईसीएसआई विधि जल्द ही निषेचन के बाद, बहुत जल्दी भ्रूण के विकास के दौरान मातृ कारकों की भूमिका परीक्षण करने के लिए एक अवसर प्रदान करता है। इसके अलावा, निषेचन से पहले क्रोमेटिन संशोधित कारकों की overexpression यह संभव विकास के लिए आवश्यक मातृ क्रोमेटिन राज्यों को समझने के लिए निषेचन से पहले मातृ क्रोमेटिन फिर से तैयार करने के लिए कर सकते हैं। यह रणनीति भी इस तरह ये भी निषेचन से पहले व्यक्त किया जा सकता है के बाद से ट्रांसक्रिप्शन उत्प्रेरक की तरह प्रेरक nuclease (talen) 18,19 और CRISPR / CAS9 20,21 के रूप में मौजूदा जीन संपादन सिस्टम के साथ अच्छी तरह से काम कर सकते हैं। इसलिए, हमारे नए दृष्टिकोण एक potenti हैअल भविष्य में कई अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जाएगा।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pregnant Mare Serum Gonadotropin (PMSG)  MSD Animal Health Vm 01708/4309 PMSG-Intervet 5000iu powder and solvent for solution for injection
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (MS222) Sigma A5040 For anesthesia
Liberase TM Research Grade Roche 05 401 127 001 For oocyte defolliculation. Store at -20 °C.
Drummond Nanoject Drummond Scientific Company 3-000-205/206 For microinjection
glass capillary  Alpha laboratories 7” Drummond #3-000-203-G/XL For microinjection
Micropipette Puller  SUTTER Instrument Model D-97 For microinjection
UltraPure Agarose Invitrogen 16500-500 For in vitro maturation and ICSI
14 ml ultra-clear centrifuge tube  Beckman Coulter United Kingdom Ltd 344060 For sperm purification
OptiPrep Density Gradient Medium (Iodixanol) Sigma D1556 For sperm purification
Digitonin Sigma D141 Cell permeabilization reagent
Shaker Hybaid  HB-SHK-1 For oocyte defolliculation
Dissecting microscope (Stereo zoom microscope) ZEISS Semi SV6 For oocyte collection and microinjection
50 μm pore filter CellTrics 04-0042-2317 For sperm purification
Ultracentrifuge Beckman Coulter Optima L-100XP For sperm purification
50 ml centrifuge tube Cellstar Greiner Bio-One 227261 or 210261 Oocyte collection and defolliculation reaction
15 ml centrifuge tube FALCON 352097 For sperm purification
90 mm Petri dish  Thermo Scientific 101VR20/C
Easy-Grip Cell Culture Dish, 60 x 15 mm FALCON 353004
Easy-Grip Cell Culture Dish, 35 x 15 mm FALCON 351008

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References

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विकास जीवविज्ञान अंक 96, oocyte परिपक्वता intracytoplasmic शुक्राणु इंजेक्शन भ्रूण के विकास मातृ कारकों मातृ कमी micromanipulation जीन हस्तक्षेप
हेरफेर और<em&gt; इन विट्रो</emके&gt; परिपक्वता<em&gt; Xenopus laevis</emIntracytoplasmic शुक्राणु इंजेक्शन द्वारा पीछा&gt; Oocytes, भ्रूण के विकास का अध्ययन करने के लिए
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Miyamoto, K., Simpson, D., Gurdon, J. B. Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development. J. Vis. Exp. (96), e52496, doi:10.3791/52496 (2015).

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