Automatically Generated

Summary

We describe methods of manipulating Xenopus laevis immature oocytes, in vitro maturation of oocytes to eggs, and intracytoplasmic sperm injection. This protocol allows degradation of some maternal proteins and overexpression of genes of interest at fertilization, and hence is valuable to study roles of specific factors in early embryonic development.

Abstract

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during oogenesis. In order to study roles of such maternal factors in early embryonic development, it is desirable to manipulate their functions from the very beginning of embryonic development. Conventional ways of gene interference are achieved by injection of antisense oligonucleotides (oligos) or mRNA into fertilized eggs, enabling under- or over-expression of specific proteins, respectively. However, these methods normally require more than several hours until protein expression is affected, and, hence, the interference of gene functions is not effective during early embryonic stages. Here, we introduce an experimental system in which expression levels of maternal proteins can be altered before fertilization. Xenopus laevis oocytes obtained from ovaries are defolliculated by incubating with enzymes. Antisense oligos or mRNAs are injected into defolliculated oocytes at the germinal vesicle (GV) stage. These oocytes are in vitro matured to eggs at the metaphase II (MII) stage, followed by intracytoplasmic sperm injection (ICSI). By this way, up to 10% of ICSI embryos can reach the swimming tadpole stage, thus allowing functional tests of specific gene knockdown or overexpression. This approach can be a useful way to study roles of maternally stored factors in early embryonic development.

Introduction

Xenopus laevis er et udbredt, kraftfuld model organisme for at studere udviklingen ^1. Dette skyldes Xenopus æg er usædvanligt stort (ca. 1,2-1,4 mm, i forhold til pattedyr modstykker er ca. 0,1 mm) og rigelig. Æg indeholder moderen syntetiseret og gemte komponenter, som er nok til at drive fosterudviklingen indtil midten af ​​blastula overgang (MBT, der forekommer i den fase 8-8,5 med 4.000-8.000 celler). MBT er ledsaget af zygotisk genom aktivering, som derefter producerer embryonale genprodukter, som styrer yderligere udvikling.

Talrige undersøgelser har til formål at identificere maternelle faktorer er vigtige for udvikling. Mange undersøgelser er afhængige af injektion af antisense oligonukleotider (oligoer), herunder morpholino oligonukleotider i befrugtede embryoner, i hvilket tilfælde nedbrydning af maternelle proteiner kan observeres på gastrula trin ^2-4. Alternativt mRNA'er injiceres befrugtede embryos at forstyrre genfunktioner eller spore skæbner overudtrykt proteiner. Men injektion i en celle embryoer normalt ikke påvirker ekspressionsniveauer af maternelle proteiner på de meget tidlige embryonale stadier før MBT.

Heasman og Wylie etablerede værten overførselsmetode til at overvinde dette problem ^5. I deres metode, manuelt defolliculated oocyter injiceret med antisense oligo og overføres til værten hunner ^6. Proteiner nedreguleret før befrugtning, så kan undersøges roller nedreguleret proteiner i den tidlige fosterudvikling. Denne moderens udtynding metode førte til identifikationen af flere unikke udviklingsmæssige roller maternelle proteiner, som revideret i ^7.

I denne rapport, vi detalje vores nyligt udviklede metode, hvor moderens udtømning eller overekspression af mRNA før befrugtning opnås uden manuel defolliculation og vært overførsel8. Manuel defolliculation kræver en masse tid og vært overførsel ofte brug for dygtige teknikker og den specifikke licens til dyr kirurgi, hvilket hæmmer den hyppige brug af moderens udtynding metode. Defolliculation og vært overførsel er erstattet af enzymatisk defolliculation ^9,10 og ICSI (ICSI) ^11-13 hhv. ICSI for æg blev oprindeligt brugt til at fremstille transgene frøer ^12. Sperm og embryonale kerner blev også transplanteret ind i vitro modnet padder oocytter ^11,14,15. Her viser vi vores trin-for-trin metode til at injicere sæd til in vitro modnet oocytter, der var pre-injiceret med antisense-oligoer eller mRNA.

Protocol

BEMÆRK: Alle eksperimenter med frøer blev udført efter kravene i det britiske indenrigsministerium. 1. Fremstilling af Xenopus laevis oocyter Cirka en uge før ægudtagningen, injicere kvindelige frøer med 150 U Gravid Mare Serum Gonadotropin (PMSG) for pre-priming ved at bruge 1 ml steril sprøjte med en 27 G nål. Injektion sker subkutant i dorsal lymfeknuder sac. BEMÆRK: Det er optimalt at bruge frøer, der ikke lægger æg i lang tid (mindst mere end halvdelen året), eller som aldrig har lagt æg før. Store pre-primet frøer i en vandtank indstillet til 18 ° C i lyset kontrolleret rum (07:00 til 19:00: den, fra 07:00 til 07:00: off). På dagen for ægudtagning, forberede 1 L 1X Modificerede Barths opløsning (MBS) fra 10x MBS lager ved fortynding med dobbelt destilleret vand (Hedeselskabet 2 O), og tilføj penicillin og streptomycin ved den endelige koncentration på 10 ug / mlhver (MBS + PS). 10x MBS lager består af 880 mM NaCl, 10 mM KCI, 24 mM NaHCO3, 8,2 mM MgSO4 .7H 2 O, 3,3 mM Ca (NO3) 2 .4H 2 O, 4,1 mM CaCl2 .6H 2 O, 100 mM HEPES, pH 7,5. Bedøver en præ-primet frog ved subkutan injektion på 120 mg (i 400 pi) i tricaine methansulfonat (MS222). Hold den injicerede frø i en lille tank med vand. Efter 10 minutter, så tjek den bedøvede frøen ved at dreje det over siden med succes bedøvede frøer reagerer ikke på dette. Hvis anæstesi er ufuldstændig, tilsættes is i tanken og vente på endnu 10 min. Pick up frøen fra den lille tank og sted liggende på ryggen på en fugtig klud. Ved hjælp af pincet og en lille kirurgisk saks, klemme huden og gøre et lille snit (2 cm) i den nedre del af maven, lateralt i forhold til midterlinjen. Foretag en anden indsnit på den anden side. Efter skæring huden, løfte muskel lag with pincet og gøre indsnit i musklen lag. Observer ovarie efter musklen lag skæres og trække ovarie ud fra indsnit ved anvendelse af pincetter. Transfer ekstraheret æggestok til et 50 ml rør med MBS opløsning. BEMÆRK: Prøv at indsamle så meget æggestok som muligt fra begge indsnit. Slagte kvindelige frøen ved afblødning, efterfulgt af frysning til efterfølgende hensigtsmæssig bortskaffelse. Skyl den udpakkede æggestok et par gange med MBS + PS indtil blod vaskes væk. Derefter overføre æggestok til en 9 cm petriskål indeholdende MBS + PS BEMÆRK: Kontroller kvaliteten af ​​oocytter under et dissektionsmikroskop på dette punkt. Hvis oocytter er tilsyneladende dårlig kvalitet, såsom oocyter med ujævn pigmentering i halvt dyr (figur 1A), ikke forarbejde yderligere og i stedet få en ny æggestok. Ideelt set bør oocytter have lige så pigmenterede dyr halvkugler og være tilnærmelsesvis ligeligt størrelse. Drille æggestokken i små stykker(1-2 cm 2) og indsamle 5 ml af oocytter i en ny 50 ml rør. Skyl 5 ml iturevne æggestok et par gange med MBS + PS og tilføje MBS + PS til 15 ml. Tilføj 7 enheder af enzymet til defolliculation til ovariet suspension (se Materialer List). BEMÆRK: Opløs frysetørret enzym med 10 ml Hedeselskabet 2 O (28 enheder / ml). Placer hætteglasset i 30 minutter på is med lejlighedsvis mild hvirvel. Aliquot 250 pi og opbevares ved -80 ° C indtil anvendelse. Inkubér æggestokkene stykke med enzymet i 1 time med forsigtig rystning på rysteapparatet (hastighed på 15 o / min, svarende til ca. 0,014 xg). BEMÆRK: næsten fuldstændig fjernelse af follikelceller, 2 timer til 2 timer 15 min inkubation med enzymet er normalt ikke nødvendig. Længere inkubation er nødvendig for oocyt kerneoverførsel eksperiment 16. Efter 1 times inkubation, afhente et lille antal behandlede oocytter (10-20 oocytter) og overføres til en 6 cm petriskål indeholdende MBS + PS Kontroller Electroluxnt af defolliculation under et dissektionsmikroskop. Hvis oocytter er adskilt fra hinanden og i det mindste delvist defolliculated (figur 1B), straks videre til det næste stop reaktionen (trin 18). Hvis oocytter stadig er stærkt omgivet af follikelceller, inkuberes i en ekstra 15 minutter på maksimum. Tilføj masser af MBS + PS for at standse reaktionen og kassér supernatanten. Gentag vask for 10 gange. BEMÆRK: Tilføj MBS + PS ved at hælde til væggen i et 50 ml rør, men ikke direkte til oocytter. Efter suspension i MBS + PS, små umodne oocytter tendens til at flyde på toppen af ​​vaskebuffer og kassér sådanne små flydende oocytter. Efter vask, overførsel til en 9 cm petriskål indeholdende MBS + PS BEMÆRK: Fra dette trin fremefter holde oocytter ved 16-18 ° C så meget som muligt. Dette kan gøres ved at holde oocytter indeholdende skål på en temperatur-kontrolleret fase. Vælg stage VI oocytter efter Dumont klassificeringfor efterfølgende anvendelse og overførsel til et nyt 9 cm petriskål indeholdende MBS + PS Oocyte overførsel kan ske ved hjælp af et glas pipette med en passende spids størrelse (større end oocyte størrelse). BEMÆRK: God kvalitet oocytter skal have en jævnt pigmenteret dyr halvkugle med klar kontrast mellem dyret halvkugle og vegetabilsk halvkugle, og være omtrent lige store (figur 1C). Stage VI oocytter repræsenterer fuldt udvokset oocytter, der kan reagere på progesteron (oocyt diameter er ca. 1,2-1,4 mm). 2. Injektion af antisense oligonucleotider eller mRNA i oocytter BEMÆRK: Alle trin i dette afsnit bør gøres på 16-18 ° C på et mikroskop scene udstyret med temperatur-kontrollerede cirkulerende vand eller på en plastik kasse fyldt med is. Overfør 200-300 udvalgte oocytter i en ny 9 cm petriskål fyldt med MBS + PS, hvor mikroinjektion vil blive udført. BEMÆRK: i EACh betingelse er 200-300 oocytter anvendes normalt. I alt er cirka 1.000 oocytter anvendt i et eksperiment. Til fremstilling af injektion af antisense-oligoer eller mRNA, skubbe metal stemplet af en mikroinjektor. Fyld et glas kapillarrør med mineralolie hjælp sprøjte og indsæt glaskapillar fyldt med olie til metal stempel mikroinjektor. BEMÆRK: Et glas kapillar er trukket af mikropipette aftrækker. Disse nåle holdes i en kasse uden at beskadige tips. Skær spidsen af ​​nålen ved hjælp af små kirurgiske sakse under et mikroskop ved at sigte så lille diameter tip til injektion som muligt. BEMÆRK: nålespidsen kan skærpes ved hjælp af en mikro smedje eller mikropipette beveler. For at affase nålen i en vinkel på 25 ° forbedrer kapaciteten til at trænge oocyt væg. Placer en lille strimmel parafilm på scenen af ​​et dissektionsmikroskop og dispensere en 3 pi dråbe af antisense oligo- eller mRNA opløsning. Flyt tip af injektionsnålen ind i den lille dråbe af opløsning og fylde nålen med den opløsning, der skal injiceres. BEMÆRK: Hvis spidsen af ​​kanylen er for lille, bør luftbobler forekommer på spidsen af ​​metallet stemplet. Derefter gøre en større spids på kanylen, indtil dette ikke sker. Mark kanylen ca. 0,5 mm væk fra spidsen. Dette mærke anvendes som en indikator for injektion dybde. Sæt spidsen af ​​nålen ind i en oocyt langs den ækvatoriale grænse ved at sigte til midtpunktet af oocyt (under kimblære), mens forsigtigt holder den modsatte side af oocyt til injektionspunktet med pincet for at forhindre uønsket oocyt bevægelse under injektion . BEMÆRK: Find arealet fri for follikelceller (figur 1B), og indfør nålen fra at stedet da selv en fin nål ikke ofte kan trænge et lag af follikelceller. Skub 4.6 ng / 4,6 nl eller 9,2 ng / 9,2 nl af AntisENSE oligos eller et passende volumen af ​​mRNA (250 pg til 13,8 ng) ved hjælp af fodkontakten. Detaljer for antisense oligo fremstilling er beskrevet i 7. Overfør de injicerede oocytter i en 6 cm petriskål fyldt med MBS + PS suppleret med 0,1% BSA (oocyt inkubering medium; sterilisere opløsningen ved anvendelse af en 0,45 um porestørrelse filter). Inkuberes oocytterne ved 16 ° C eller 18 ° C i 1-2 dage. BEMÆRK: oocytter injiceret kan underkastes in vitro modning flere timer efter injektion, i hvilket tilfælde injektion af 4,6 ng antisense-oligoer er at foretrække. En generel regel er, at jo kortere inkubationstiden er, jo bedre den efterfølgende embryonale udvikling. 3. In vitro-modning (IVM) af oocytter Om aftenen den oocytmodning eksperiment, hente progesteron stamopløsning (30 mM i ethanol) fra -80 ° C fryser og opløse bundfald ved værelse temperatur med lejlighedsvis vortex. BEMÆRK: progesteron lager normalt efterladt ved stuetemperatur i 30 min til 1 time. Tilsæt 5 pi af progesteron lager i 50 ml MBS + PS (Modning medium; slutkoncentrationen af ​​progesteron på 3 uM) og rystes på et rysteapparat i 30 minutter til at distribuere progesteron i opløsningen lige. Forbered agarose-coatede 6 cm skåle for in vitro modning behandling. Tilsæt 1 g agarose til 50 ml 1X MBS uden magnesium og calcium. Opløs agarose ved opvarmning i en mikrobølgeovn. Hæld et lille volumen af ​​agaroseopløsningen til 6 cm skåle til at dække bunden af ​​retter. Vent i mindst 30 min, indtil størkning. BEMÆRK: Agarose belægning forhindrer klæbning af oocytter til retter. Når in vitro-modnede oocytter er tæt knyttet til retter, er det mest sandsynligt, at oocytter vil blive aktiveret af de stimuli, som de modtager under frigørelse fra dishes. Hæld 5-8 ml Modning medium til agarose-coatede skåle og overføre 200-300 oocytter i hver 6 cm skåle. BEMÆRK: Prøv at overføre oocyter med en minimal mængde oocyte inkubationsmedium. Der inkuberes i 16 timer ved 16 ° C. BEMÆRK: For eksempel starte behandlingen ved 5 pm og færdig kl 9 på den næste dag. 4. ICSI (ICSI) Frosne sædceller stock forberedelse BEMÆRK: Følgende sperm forberedelse bør ske, før du starter oocytmodning eksperiment, og frosne sæd lagrene holdes på -80 ° C til ICSI. Saml testiklerne fra en mandlig frog ved at følge trin 1,4-1,11, bortset trække fedt og testikler ud fra indsnit ved anvendelse af pincetter og fjernelse testikler fra fedt. Vask testikler i 1x Marc Modified Ringers (MMR, 100 mM NaCI, 2 mM KCI, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES, pH 7,4). Fjerne fedt end blodkar ved at rulle vaskede testiklerne på en ren silkepapir og derefter ved at fjerne de resterende blodkar ved hjælp af pincet. Placer hver testis i en 3,5 cm petriskål indeholdende 1 ml 1x MMR. Skær på langs med fine saks, og rive i små stykker med en pincet, indtil ingen store stykker tilbage. Pipette op og ned ved 1 ml plastik tip, hvis ende er skåret, og belastning 1 ml af den knuste testis opløsning i en glashomogenisator. Homogeniseres dem med 2-3 slag og derefter hældes opløsningen på en 50 um porefilter fastgjort til toppen af ​​en 15 ml centrifugerør. Lad opløsningen gå gennem filteret. Gentag trin 4.1.7 ved at resuspendere den resterende cut testis i 1 ml 1x MMR. Endelig vaskes homogenisatoren et par gange med 1x MFR og videregive det gennem filteret. Gentag trin 4.1.5 til 4.1.8 for andre testis og pool to testikler i en 15 ml centrifugerør. Spin cellerne ved 800 xg ved 46 C i 20 min. Supernatanten fjernes, og resuspenderes pelleterede celler i 2 ml 1x MMR. Derefter overføres til et nyt rør. BEMÆRK: Sørg for, at ingen synlige blodlegemer er til stede. Forbered et skridt gradient i en 14 ml ultra-klar centrifugerør. Nederste lag: 4 ml 30% iodixanol. Anden bundlag: 1 ml 20% iodixanol. Tredje bundlag: 5 ml 12% iodixanol. Øverste lag: testisceller i 2 ml 1x MMR. Overlay gradienterne meget forsigtigt med en 1 ml pipettespids (overlay langsomt for ikke at forstyrre den nederste fase). BEMÆRK: Bare et lag på 30% iodixanol bør også arbejde for kun at isolere sperm. Spin i SW40 rotor ved hjælp af ultracentrifuge ved 10.000 xg ved 4 ° C i 15 min (deceleration uden pause). Fjern forsigtigt røret fra ultracentrifuge. Bekræft en grænseflade mellem hvert lag af gradienten og pellet nederst. Opsaml sperm fraktion fra pelleten. Resuspender sperm pelLad i 1x MMR til at vaske ud iodixanol. Centrifugering ved 800 xg ved 4 ° C i 20 min. BEMÆRK: Hvis en masse sperm stadig i suspensionen efter spin, re-spin-supernatanten ved 3.220 xg ved 4 ° C i 20 minutter, og samle den pelleteret sperm. Bortkast supernatanten og resuspender sperm pellet i 1 ml 1X Fremstilling Buffer Nuclear (NPB, 250 mM saccharose, 0,5 mM Spermidin trihydrochlorid, 0,2 mM spermin tetrahydrochlorid, 1 mM EDTA, 15 mM Hepes, pH 7,7) 13. Derefter overføres til et Eppendorf-rør. Der tilsættes 50 pi 10 mg / ml Digitonin opløsning i 1x NPB (Resuspender Digitonin pulver i DMSO ved 50 mg / ml og fryse alikvoter ved -80 ° C. Før brug fortyndes 50 mg / ml portion til 10 mg / ml med 1x NPB. Ubrugt 10 mg / ml Digitonin kan fryses og opbevares ved -20 ° C og genbruges) til 1 ml af sperm opløsning. Der inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur. Tjek en permeabilization renten med DAPI farvning (0,3 ug / ml DAPI som en finakoncentration l). Hvis mindre end 95% af cellerne er permeabiliseres inkuberes lidt længere. BEMÆRK: Nogle gange, hvis for mange sædceller inkuberes samtidigt (især når sperm indsamles fra flere testikler), er det vanskeligt at permeabilisere, i hvilket tilfælde det kan være nødvendigt at tilsætte en yderligere lille mængde Digitonin; for eksempel hvis 20% af sædcellerne ikke permeabiliseret, tilsættes yderligere 20 pi Digitonin. Stop permeabilisering ved tilsætning af 10% BSA til 3% slutkoncentration. Spin cellerne ved 4 ° C. BEMÆRK: Prøv så lidt centrifugering hastighed som muligt ved at starte med 100 xg i 5 min. Hvis ikke tilstrækkelig øge hastigheden og / eller tid. Vask cellerne med 0,3% BSA i 1X NPB og centrifugeres ved samme hastighed som trin 4.1.22. Mellemtiden forberede Sperm Opbevaring Buffer (SSB, 2 ml 2x NPB, 120 pi 10% BSA, 1,2 ml autoklaveret glycerol, 680 pi H2O). Der tilsættes 500 pi SSB til spermpellet. Pipette flere gange op og ned for at opblande med et snit spids for ikke at beskadige cellerne. Tillad at ækvilibrere natten over ved 4 ° C. Pipette cellerne op og ned flere gange med et snit spids. Fortynd et par mikroliter 10 gange i 1x MMR eller i 1x PBS til at tælle celler ved hjælp af hæmocytometer. Frys som portioner på 30.000 sperm / ul (eller højere) direkte ved -80 ° C og opbevares ved -80 ° C i en enkelt anvendelse portioner. ICSI til in vitro modnet oocytter BEMÆRK: Alle processer, der involverer oocytter bør gøres på 16-18 ° C. Forbered et glas pipette til at overføre modne oocytter. BEMÆRK: glaspipette skal være bred nok til at rumme oocytter uden at klemme. Seksten timer efter flytning oocytter til progesteron medium, overførsel modnet oocytter i en 6 cm agarose-belagt fad fyldt med MBS + PS til vask. BEMÆRK: Det er vigtigt, matured oocytter skal behandles yderst forsigtigt. Groft behandling af oocytter kan fremkalde spontan aktivering før sperm injektion. Count modnet oocytter ved at bekræfte forekomsten af hvide pletter, hvilket indebærer kimblære fordeling (figur 2). Hvis modning er mindre end 80%, er det usandsynligt at opnå tilstrækkelig antal overlevende embryoner til yderligere analyser. BEMÆRK: Resterende follikelceller skrælles af efter oocytmodning (figur 2). Overfør oocytter fra MBS vask til en ny agarose-coated 6 cm skål fyldt med injektion medium (Forbered 500 ml: 30 g Ficoll (6%), 20 ml 10x MFR og 500 pi 1.000 x PS lager). Inkuber i mindst 30 min før start ICSI. Opsæt mikroinjektor som beskrevet i trin 2,2-2,4. BEMÆRK: spids størrelse kanylen holdes så lille som muligt ved at følge proceduren beskrevet i trin 2.6. Diameterenaf nålen er 20-40 um. At affase nålespidsen som beskrevet i trin 2.4 kunne give en effektiv injektion. Hent sperm aliquot og fortyndes sperm suspension i Sperm fortyndingsbuffer (SDB, 250 mM Sucrose, 75 mM KCI, 0,5 mM spermidin, 0,2 mM spermin, 200 uM HEPES pH 7,5). BEMÆRK: Fortynding kan varieres afhængig af en nål størrelse og så videre. Fortynd 120 tidspunkter af 30.000 sædceller / pl lager som et første forsøg og justere yderligere, hvis det er nødvendigt. Placer en lille stribe af Parafilm på scenen af ​​et dissektionsmikroskop. Bland sperm injektionsopløsning ved pipettering og dispensere et par pi dråbe af sperm opløsning. Suck den fortyndede sæd suspension ind i nålen injiceres 4,6 nl i 10 på hinanden følgende dråber indeholdende 0,3 ug / ml DAPI på et objektglas, og hurtigt tælle antallet af sperm afgivet per injektion på et fluorescerende mikroskop. BEMÆRK: Sigt 1-2 sperm per injektion. Hvis det er nødvendigt, fortyndes sperm injektion løsning mereog kontrollere antallet af sperm per injektion igen, indtil opnåelse af en ønsket koncentration. Skub test injektionsopløsning og fylde en ny sperm injektion løsning med en ordentlig koncentration. Injicer 4,6 nl af sædceller opløsningen på 100 modnet oocytter. BEMÆRK: Det er vigtigt løbende at injicere opløsningen. Først bestemme den nødvendige tid til at skubbe 4,6 nl (normalt 1-2 sek). Gentag følgende proces; injicerer på en oocyt, vent et par sekunder, fjerne en nål og mock-injektion i injektion løsning, vent et par sekunder, injicerer på en oocyt. Denne kontinuerlige injektion forhindrer også blokering af nålespidsen. Alternativt kan fremgangsmåden anvendelse af en pumpe anvendes 13. Efter cirka 100 injektioner, skubbe den resterende sperm løsning og re-fylde sperm løsning (bruger den samme sæd løsning, men pipette op og ned, før dispensering). BEMÆRK: Hvis nålen ikke sutte sperm løsning godt, klippe spidsen af ​​behovetle. Hvis dette ikke forbedre situationen, udarbejde en ny nål. Gentag injektion processen, indtil alle oocyter injiceres. BEMÆRK: Hvis oocyt kvaliteten er god, og injektionen er lykkes, sammentrækning af injicerede oocytter set inden for 20 minutter efter injektionen tid. Flyt injicerede retter til 16 ° C eller 18   ° C inkubator. 4-5 timer efter injektionen, skal du kontrollere spaltning på ICSI embryoner. BEMÆRK: spaltning furer i disse embryoner kan ikke være så klar som de normale befrugtede embryoner. Nogle embryoner viser også unormale kløfter, der kan være forårsaget af flere sperm injektion. Overfør spaltet embryoner herunder unormalt spaltede embryoner til inkubationsmedium (Forbered 500 ml: 20 g Ficoll (4%), 5 ml 10x MFR og 500 pi 1.000 x PS lager). Inkuber embryoner i enten 16   ° C eller 18 ° C inkubator natten over. Næste morgen, overførsel EmbryOS til 0,1 x MMR og tælle overlevende embryoner. I gennemsnit kan ca. 10% af sperm-injicerede oocytter udvikle til swimming haletudse stadium (figur 3A).

Representative Results

Fosterudvikling af ICSI embryoner ved in vitro-modnede oocytter blev undersøgt (figur 3A). Modning satser GV oocytter til MII scenen er variable og afhænger i høj grad af oocyt kvalitet. I gode forsøg, næsten 100% af GV oocytter reagere på progesteron og viser tegn på oocytmodning, endelig bliver æg på MII stadium. Alle modnede oocytter blev underkastet ICSI og ca. 25% af injicerede æg spaltede (figur 3A, n = 13 for kontrollen krypteret oligo-injicerede oocytter og n = 7 for ikke oligo-injicerede oocytter). Ca. 60% eller 80% af spaltede embryoner, der er fremstillet af kontrol oligo-injicerede oocytter eller ikke-injicerede oocyt henholdsvis nåede blastula / gastrula fase. Blandt blastula / gastrula embryoner, ca. halvdelen af ​​embryoner i oligo-injicerede prøver var af god kvalitet (næsten ingen tegn på unormal spaltning og apoptose), mens 82% af blastula / gastrula embryoer var af god kvalitet i npå-injicerede prøver (figur 3A). Endelig 41% og 11% af spaltede embryoner i oligo-injicerede prøver nåede muskulære respons og svømning haletudse etaper, henholdsvis mens 60% og 29% af spaltede embryoner i ikke-injicerede prøver gjorde (figur 3A). Disse ICSI embryoer er blandingen af normale og unormale fostre (figur 3B). Nogle af dem undergå metamorfose og udvikle sig til modne frøer 8. Disse resultater tyder på, at injektion af antisense-oligonukleotider i GV oocytter efterfulgt af IVM og ICSI, muliggør effektiv tidlig fosterudvikling. Selv om injektion af antisense oligo selv nedsætter fosterudvikling, er vi stadig i stand til at opnå tilstrækkeligt embryoner til mange eksperimentelle formål såsom kontrol udviklingsmæssige satser, RT-PCR, western blot og så videre. Fig ure 1: Typiske eksempler på Xenopus laevis oocytter af god kvalitet eller dårlig kvalitet til in vitro modning eksperimenter. (A) Et eksempel på dårlig kvalitet oocytter. For eksempel er oocytter viser fragmentarisk pigmentering ikke anvendes til efterfølgende eksperimenter. Hver Xenopus laevis oocyt er ca. 1,2-1,4 mm i diameter. (B) En delvist defolliculated oocyt. Den højre halvdel af oocytten er dækket af follikelceller, som kan skelnes ved tilstedeværelsen af ​​blodkar. En pil viser et område uden follikelceller og i hvilken kanylen injiceres. (C) Et eksempel på god kvalitet oocytter, der er lige store og vise jævnt pigmenterede dyr halvkugler med tydelig kontrast mellem dyret halvkugle og vegetabilsk halvkugle. 2496 / 52496fig2highres.jpg "/> Figur 2:. Xenopus laevis oocytter før og efter modning Efter oocytmodning, klare hvide pletter i toppen af animalske halvkugler og follikelceller er pillet ud. Hver Xenopus laevis oocyt ca. 1 mm i diameter. Figur 3: Udvikling af ICSI embryoner, der er fremstillet af in vitro modnet oocytter. Er opsummeret (A) Udvikling af ICSI embryoner til hver etape. Oocyter blev injiceret med kontrol krypteret antisense-oligonukleotider (kontrol oligo injektion) eller uden injektion (ikke injektion), efterfulgt af IVM og ICSI. Det tilsvarende antal embryoner i hver fase vises over søjlerne. Middelværdi ± SEM er vist. N = 4-13 uafhængige forsøg / anderledes females. (B) Eksempler på overlevende ICSI embryoner. Disse tailbud embryoer blev fremstillet i et forsøg, hvor ca. 200 oocyter blev anvendt som et udgangsmateriale.

Discussion

Vi her detalje en ny metode til at udtømme maternelle faktorer eller at overudtrykke ydre faktorer før befrugtningen. Dette system kræver to mikroinjektioner, men i stedet springer operationen af frøer, der anvendes i værtslandet overførselsmetode ^7,17. Det er optimalt at fjerne frøen kirurgi skridt i forhold til dyrenes pleje. Desuden har vi ikke til at tage hensyn til kvaliteten af ​​host kvindelige frøer til overførsel eksperimenter, hvilket betyder, at vi kan slippe af med en biologisk faktor, der påvirker succes eksperimenter. Derfor vil der i dette system kvaliteten af ​​oocytter opnået fra PMSG-primede frøer er en væsentlig biologisk faktor, der er afgørende for vellykkede eksperimenter. Kvaliteten af ​​oocytter kan bedømmes efter indsamling af ovarie eller efter defolliculation. Hvis en abnormalitet observeres ved disse faser, er det optimalt at samle en anden æggestok fra en ny frø. Et andet punkt, når du kan kontrollere oocyt kvalitet er efter oocytmodning. Hvis mindre end 80% af progesterone-behandlede oocytter viser tegn på modning, kan du ikke være i stand til at opnå det nok antal embryoner til yderligere analyser. Brugen af ​​enzymatisk defolliculation stedet for manuel defolliculation er også en anden fordel ved at anvende dette system til at reducere arbejdskraft kræves for defolliculation. Det er dog stadig muligt at manuel defolliculation kan give en bedre udvikling end den enzymatiske behandling.

Som vist i figur 3, næsten 10% af in vitro modnet oocytter kan nå svømning haletudse fase. Disse data samles fra 13 uafhængige forsøg, herunder dem, der rapporteres i ⁸ og nye indsprøjtning eksperimenter. Host overførselsmetode brug 75-150 oocytter i hver behandling for at opnå meningsfulde data siden 30-60% af de overførte oocytter kan nå neurula stadium ^17. Vores metode starter normalt med 200-300 oocytter i hver forsøgsgruppe da ca. 40-60% af spaltede embryoner kan nåmuskulære respons fase. Disse data tyder på, at begge metoder understøtter en rimelig udviklingsmæssig sats. Vi har indtil videre fået 10 live frøer fra kontrol mRNA-injicerede og kontrol antisense oligo-injicerede oocytter ved hjælp af denne teknik, hvilket indikerer, at denne tilgang understøtter udvikling gennem metamorfose.

Vores oocyt manipulation-ICSI-metoden giver mulighed for at afprøve rollen som maternelle faktorer under meget tidlig fosterudvikling, kort efter befrugtningen. Derudover kan overekspression af kromatin modificerende faktorer, før befrugtning gør det muligt at omforme maternal chromatin inden befrugtning for forståelsen maternelle chromatin stater nødvendig for udviklingen. Denne strategi kan også fungere godt med de nuværende gen redigering systemer såsom Transcription aktivator-lignende effektor nuklease (talen) ^18,19 og CRISPR / CAS9 ^20,21 da disse kan udtrykkes selv før befrugtningen. Derfor er vores nye tilgang har en Potential skal anvendes til mange anvendelser i fremtiden.

Materials

Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Pregnant Mare Serum Gonadotropin (PMSG)	MSD Animal Health	Vm 01708/4309	PMSG-Intervet 5000iu powder and solvent for solution for injection
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (MS222)	Sigma	A5040	For anesthesia
Liberase TM Research Grade	Roche	05 401 127 001	For oocyte defolliculation. Store at -20oC
Drummond Nanoject	Drummond Scientific Company	3-000-205/206	For microinjection
glass capillary	Alpha laboratories	7” Drummond #3-000-203-G/XL	For microinjection
Micropipette Puller	SUTTER Instrument	Model D-97	For microinjection
UltraPure Agarose	Invitrogen	16500-500	For invitro maturation and ICSI
14 ml ultra-clear centrifuge tube	Beckman Coulter United Kingdom Ltd	344060	For sperm purification
OptiPrep Density Gradient Medium (Iodixanol)	Sigma	D1556	For sperm purification
Digitonin	Sigma	D141	Cell permeabilization reagent
Shaker	Hybaid	HB-SHK-1	For oocyte defolliculation.
Dissecting microscope (Stereo zoom microscope)	ZEISS	Semi SV6	For oocyte collection and microinjection
50 μm pore filter	CellTrics	04-0042-2317	For sperm purification
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima L-100XP	For sperm purification
50 ml centrifuge tube	Cellstar Greiner Bio-One	227261 or 210261	Oocyte collection and defolliculation reaction
15 ml centrifuge tube	FALCON	352097	For sperm purification
90 mm Petri dish	Thermo Scientific	101VR20/C
Easy-Grip Cell Culture Dish, 60×15 mm	FALCON	353004
Easy-Grip Cell Culture Dish, 35×15 mm	FALCON	351008