Summary
Biz indüktif eşleşmiş plazma kütle spektrometresi (ICPMS) için ayrı bir damlacık örnek giriş sistemi sunuyoruz. Bu 90 ila 7000 Hz arası frekanslarda 40-60 um boyut aralığında yüksek tek dağılımlı damlacıklarını üreten ucuz ve tek kullanımlık mikroakışkan çip dayanmaktadır.
Abstract
Bu protokol, indüktif eşleşmiş plazma kütle spektrometresi (ICPMS) için numune giriş sistemi gibi bir tek düşük maliyetli mikroakışkan çip imalatı ve kullanımı anlatılmaktadır. çip perfluoroheksan (PFH) tek dağılımlı sulu örnek damlacıkları üretir. Boyut ve sıvı damlacıklarının sıklığı sırasıyla 40-60 um aralığı içinde ve 90 ila 7000 Hz arasında değişiklik gösterebilir. damlacıklar PFH ikinci akışı ile çip çıkarılacağını ve fırlatma sırasında bozulmadan kalır. Bir ısmarlama desolvation sistemi PFH kaldırır ve ICPMS içine damlacıkları ulaştırmaktadır. Burada, dar bir şiddet dağılımına sahip çok kararlı sinyalleri damlacıkların bir tekli dağılırlık gösteren ölçülebilir. Bu besleme sistemi kantitatif bir sığır kırmızı kan hücrelerinin demir belirlemek için kullanılabileceğini göstermektedir. Gelecekte, giriş cihazının özellikleri kolayca ek mikroakışkan modüllerin entegrasyonu ile uzatılabilir.
Introduction
Indüktif olarak birleştirilmiş plasma kütle spektrometrisi (ICPMS) sıvı numune Element analizi yaygın besleme sistemi 1 gibi sprey odaları ile kombinasyon halinde girdaplar kullanılarak gerçekleştirilir. Bu örnek giriş sistemi, numune çok-dağılımlı bir sprey oluşturmak için bir püskürtücü ile püskürtülür. Bir alt sprey odası, büyük damlacıklar filtrelemek için kullanılır. Bu yöntem, yüksek numune tüketimi (> 0.3 ml dk -1) 2 ve tamamlanmamış bir örnek taşımacılığı ile ilişkilidir. Bu nedenle, sadece mikrolitre örnek hacimleri, biyolojik adli, toksikolojik ve klinik çalışmalarla 3'de olduğu gibi, mevcut uygulama için pratik olur. Örnek tüketimini azaltmak için, küçük meme boyutları ile nebülizerler 3 geliştirilmiştir. Bununla birlikte, daha az püskürtme memesi boyutu sindirilmemiş biyolojik sıvılar veya konsantre tuz çözeltilerinin örnekleri 3 analiz edilecek olduğunda tıkanma riskini arttırır.
ark. 4 tarafından önerilmişti. Yazarlar, bir piezo-elektrik tahrikli micropump tarafından üretilen tek dağılımlı ayrı mikro damlacıkların şeklinde ICPMS bir sıvı enjekte edilir. Bu çok sistem geniş uygulama bulamadık olsa da, bu ICPMS ayrık damlacık giriş kavramının daha da geliştirilmesi başlattı. Bugün, piezo-elektrik 30, 50, 70 ve 100 um büyüklüğünde ve 100-2,000 Hz frekanslarında damlacıklar oluşturabilir sistemleri, dağıtma tahrik satın alınabilir. damlacıklar% 100 verim 5 yakın olan ICPMS içine taşınabilir. Bu Mikrodamlacık dağıtıcıları kantitatif tek nanopartiküller 5,6 ölçüm yanı sıra bireysel biyolojik hücrelerin 7 karakterize etmek için uygulanmıştır. Termal püskürtme teknolojisi 8 göre benzer bir sistem biyolojik numunelerin 9 analizinde test edildi. AVAide rağmenetikel tek damlacık tanıtım sistemleri küçük bir örnek hacimleri için kullanılabilir, çok verimli ve nanopartiküllerin ve hücrelerin analizi için umut vericidir, onlar birkaç sınırlamaları vardır. (Özel ayarlar 10 kullanılmadığı sürece) sabit meme büyüklüğü için, damlacık büyüklüğü sadece biraz değiştirilebilir. Sıvı (pH, tuz içeriği) fiziksel özelliklerinde değişiklik damlacık özelliklerinin (boyut, enjeksiyon hızı) değiştirebilir. Ayrıca, bu cihazlar nispeten daha pahalı tıkanma yatkındır ve temizlenmesi zordur.
Damlacıklar oluşturmak için diğer bir yöntem, damlacık, mikroflüidik 11 alanında iyi bilinmektedir. Son yıllarda damlacık Mikroakiskan (biyo) kimyasal reaksiyonlar 12-15 ve tek hücre çalışmaları 16,17 için ilgi kazanmıştır. Buna ek olarak, bu teknik, elektrosprey iyonizasyon kütle spektrometresi 18,19 örnekleri verilmesi için ve matris destekli lazer desorpsiyon / iyonlaştırma örnekleri hazırlanması için uygulandın kütle spektrometresi 20,21.
Son zamanlarda, biz ICPMS 22 örnek tanıtımı için bir mikroakışkan tabanlı sistemi tanıttı. Bizim tanıtım sisteminin temel bileşeni sıvı destekli damlacık ejeksiyon (LADE) çip. Bu çip, tamamen poli (dimetilsiloksan) (PDMS) oluşur. İlk kanal kavşağı olarak sulu örnek solüsyonu (Şekil 1) tek dağılımlı damlacıkları oluşturmak için kullanılır odaklama akış. Bu amaçla ve karışmayan taşıyıcı faz perfluoroheksan (PFH) çok uçucu (58-60 ° C 23 kaynama noktası) (Şekil 1) kullanılır. Bunlar PFH özellikler istikrarlı bir damlacık oluşturma ve taşıyıcı faz hızlı çıkarılmasını sağlamak. Bu kuşak yöntem daha az numune sıvı etkisi özelliklerinde değişiklikler, diğer damlacık jeneratörlere kıyasla. Damlacık boyutu, sulu faz ve PFH akış oranlarını değiştirerek geniş bir aralıkta ayarlanabilir. Bir alt ORTA olaraky kavşak, daha PFH en az 1 m sn akış hızını arttırmak için ilave edilir -1. Bu hızlarda sıvı damlacık imha (Şekil 1 ek) olmadan stabil ve düz jet çip (Şekil 1) dışarı atılabilir. Bu çift-kavşak tasarımı damlacık nesil bağımsız jet dengesini kontrol sağlar. damlacıkları özelleştirilmiş taşıma sistemi ile ICPMS taşınır. Bu sistem, bir düşen boru ve PFH kaldırmak için bir zar desolvator içerir. sulu damlacıkların kuru artıklar daha sonra ICPMS plazma ve bir kütle detektörü önlemler iyonları iyonize edilebilir. çip ön kısmı fıçı şeklinde damlacık taşıma sistemi ile sıkı bir bağlantı sağlamaktır. meme ile temas önlenir, çünkü PFH damlacıklar sulu numunenin çıkarma, faydalıdır. Bu da hücre süspansiyonu ya da işbirliği ile çalışırken bir sorun olabilir meme tıkanması riskini düşürürncentrated tuz çözeltileri. Yumuşak litografi PDMS tarafından imal LADE cips, (çip başına malzeme maliyeti yaklaşık $ 2) ucuz atılabilir ve değiştirmek kolaydır. Manuel çalışma, sadece küçük bir miktar gerektirir üretimi ile birlikte her bir deney, yeni bir çip ile gerçekleştirilebilir. Bu nedenle, bir zahmetli temizlik gerekli değildir ve çapraz kontaminasyonu en aza indirilmiştir.
Burada, LADE yumuşak litografi ile çip ve ICPMS için uygulama imalat açıklanmıştır. Bir sulu çözelti ve bir hücre süspansiyonu ile ölçüm örnekleri sunulmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. SU-8 Ana Fabrikasyon (Şekil 2)
NOT: toz parçacıkları nedeniyle arızaları önlemek için bir temiz oda SU-8 ana kalıp imalat gerçekleştirin. İki gofret imalat, mikroakışkan özellikleri ve olmayan biriyle bir gofret için gereklidir.
- Mikroakışkan çip için ana kalıpları hazırlayın. İlk silikon gofret bir yapışma tabakası uygulayın.
- 200 ° C de 10 dakika süre ile bir silikon gofret dihidrat. RT aşağı gofret soğutun ve aşağıdaki protokol ile SU-8 ile bir spin lak ve spin kaplama o kadar 2002 onu yüklemek.
- Dağıtın yaklaşık 3 ml gofret üzerine karşı.
- Bütün gofret üzerine karşı yayılması için 10 saniye boyunca 500 rpm hızda gofret dönerler.
- Yaklaşık 2 um karşı yüksekliğe ulaşmak için 30 saniye için 2000 rpm'de gofret dönerler.
- Bir aseton batırılmış bez ile gofret kenarından aşırı karşı Kaldır önlemek içinBir sonraki adımda sıcak plaka gofret yapışmasını. Sıcak bir plaka üzerinde 95 ° C'de 60 saniye için gofret pişir.
- Ultraviyole ışık (80 mj / 365 nm'de cm 2) ile tüm gofret Açığa. Post-fırında 120 sn 95 ° C gofret.
- Aşağı gofret soğutun ve hemen tekrar SU-8 2050 için aşağıdaki protokol kullanılarak kaplamaz gofret dönmeye:
- 20 sn için 100 rpm'de gofret Spin (yaklaşık 3 ml SU-8, bu adım sırasında karşı dağıtmak).
- Bütün gofret üzerine karşı yayılması için 10 saniye boyunca 500 rpm hızda gofret dönerler.
- Yaklaşık 40 um bir karşı kalınlığı ile sonuçlanarak, 30 saniye boyunca 3250 rpm'de gofret dönerler.
- Yine, fazlalık, 65 ° C'de bir aseton emdirilmiş bez ve yumuşak fırında 180 saniye için bir sıcak plaka üzerinde ince bisküvi ile gofret kenarından ve 95 ° C'de 360 saniye boyunca karşı çıkarın.
- Sti tarafından photomask hazırlayınBir soda-kireç camı için CKING. Maske tasarımı için bakınız Şekil 3. Hazırlanan maske ile (365 nm'de ölçülen 160 mj / cm 2) ultraviyole ışığı ile karşı ortaya çıkarmak için bir maske hizalama kullanın. 65 ° C sıcaklıkta 60 saniye boyunca bir sıcak plaka üzerinde tekrar maruz gofret fırında 95 ° C'de 360 saniye boyunca karıştırılmıştır.
- Oda sıcaklığına gofret soğutulduktan sonra karşı geliştirmek için 5 dakika boyunca geliştirici ile doldurulmuş, cam bir Petri tabağına daldırın. Yavaşça maruz kalmayan SU-8 kaldırmak için petri çalkalayın. Izopropanol ile gofret durulayın ve bir azot tabancası ile kuru darbe.
- Bir mikroskop altında gofret inceleyin. Durumunda gelişmemiş, özellikleri kalıntıları karşı adım 1.7'de açıklandığı gibi, bir kaç dakika için tekrar gofret geliştirmek.
- 200 ° C de 2 saat süre ile gofret pişirme herhangi bir kalıntı çözücü çıkarın. Bir adım profiler ile özelliklerin yüksekliğini kontrol edin. Ölçülen yüksekliği istenilen yükseklikten farklı durumda bu proto ile başlarTekrar col ve adım 1.1.4 spin hızı adapte.
- Gofrete PDMS yapışmasını önlemek için, küçük bir porselen çanak içinde 1 H, 1 H, 2 H, 2H -perfluorodecyltrichlorosilane 50 ul ile birlikte kurutma cihazı yerleştirerek bu silanize. 100 mbar'a kadar desikatör içinde basıncı azaltmak ve 12 saat süre ile gofret inkübe edin.
- Boş PDMS parçaları adım 1.10 yöntemi kullanarak başka silikon gofret silanize. Tek bir desikatörde aynı anda zaman Silanize hem gofret kaydetmek için.
2. LADE Chip İmalatı
Not: LADE çip yapışkanla bağlama, 24 ile birbirine bağlanan iki adet PDMS parçaları üzerinden yapılır. İlk bölüm mikroakışkan özellikler içerir. diğer kısmı düz ve kanalları mühürlemek için kullanılır. Birlikte Gümrüklü, onlar damlacık taşıma sistemi ile çip arayüzü için gerekli yuvarlak şeklini. Burada, imalatıİki parça ve bunların bağlama tarif edilmektedir. Bütün işlem aşamaları, Şekil 4'te gösterilmiştir.
- Sertleştirme maddesi PDMS 4 gr ön-polimer 40 g karıştırılarak PDMS 44 g hazırlanması (bu en çok 6 fiş neden olur). Ücretsiz kabarcık (bu yaklaşık 20 dakika sürer) kadar bir desikatörde PDMS degas.
- Yapılandırılmış yarısı çoğaltma kalıplama.
- Gofret üstüne döküm formu yerleştirin ve tasarım etrafında rehberlik yapıları kullanarak yerine oturtun (Şekil 5). Düz PDMS yarı yarıya azaltmak için yerine oturtulmasına yap.
- Döküm şeklinde yaklaşık 3 degased PDMS 4 g dökün ve 150 ° C 'de sıcak bir plâka üzerinde 6 dakika boyunca bırakın. Döküm şeklinde tedavi PDMS soğumasını ve dikkatli bir şekilde spatula kullanarak döküm formu gofret kaldırın.
- Mikroakışkan kanalların herhangi bir bulaşmayı önlemek için temas wi önce oldu çip yan kapağıbant ile gofret th. Dikkatle aşırı PDMS kaldırmak için PDMS kısmının kenarı boyunca bandı kesti.
- Düz PDMS yarıları boş Silanlanmış gofret ile 2.2.3 yukarıda belirtilen adımları 2.2.1 tekrar imal.
- Bant soyun ve bir biyopsi zımba ile yapılandırılmış parçaya sıvı bağlantı delikler. Depolama sırasında bantla yapıları koruyun.
- Ajan 24 kür PDMS kullanarak yapıştırma araya PDMS parçaları bağ.
- Tedavi edilmeyen silikon gofret alın ve PDMS 6,000 rpm'de 30 saniye için sertleştirici ile kat spin. Spin kaplayıcı dışarı gofret alın.
- Yapılandırılmış yarıya bandı çıkarın ve gofret üzerine aşağı bakacak yapılar ile koyun. Yavaşça hava kabarcıklarını çıkarmak için PDMS üstüne itin.
- Boş PDMS yarıya bandı çıkarın. Gofret bir yapılandırılmış yarı yarıya azaltmak alın ve elle düz PDMS yarı yarıya azaltmak üstüne hizalayın. Yavaşça sıkmakhava kabarcıklarını çıkarmak ve oda sıcaklığında 24 saat için bir araya çip tedavi izin araya parçası. Bu kanallar çökmeye neden olabilir yürürlüğe birlikte parçaları itmeyin.
- Çıkış memesini açmak için bir maket bıçağı ile meme kanalı dik gösterge hattı boyunca çip ucunu kesin. Düz sıvı fırlatma için gerekli olan bir düz kesim sağlamak için bir hizalama cihazı kullanın. Mikroakışkan kanalları ve toz parçacıkları kusurlar için bir mikroskop altında çip kontrol edin. Depolama sırasında cips korumak için giriş delikleri üzerinde bir kaset koy.
- Bir kuru azot kaynağına ve pota çip her girişlerine boru ile bir Woulff şişe bağlayın. Deposit 50 Woulff şişenin alt kısmında 1 H, 1 H, 2 H, 2H -perfluorodecyltrichlorosilane ul ve kapatın.
- 1 H, 1, H taşıyan nitrojen akımı ile 20 dakika boyunca tüm kanallar reçeteye göre mikroakışkan kanal Silanize 2H, yaklaşık 1 ml / saniye akış hızında 2H -perfluorodecyltrichlorosilane. cips deneyler için hazır ve oda sıcaklığında en az birkaç hafta muhafaza edilebilir.
Ölçüm / Damlacık Ulaştırma Sistemi 3. hazırlıklar
NOT: Kurulum için istikrarlı bir destek yapısı oluşturmak için gerekli olduğundan, bir optik masanın üstünde tüm damlacık taşıma sistemini kurmak. Bütün damlacık taşıma sisteminin şeması Şekil 6'da gösterilmektedir.
- Dikey paslanmaz çelik boru ekli bir 50 cm özel bir siklonik poli (metil metakrilat) (PMMA) adaptörü takın. Bir kütle akış kontrolörü ile bir helyum kaynağına adaptörü takın. Damlacık görünüm için zıt sitelerde adaptörü (yüksek hız) kamera ve bir lamba takın.
- Çelik borunun ortasında bir kartuş ısıtıcısı yerleştirin ve poli (vinil klorür) (PVC) boru ve bir Legris tüp kullanmakkonnektör membran desolvator girişi çelik borunun ucunu bağlamak için.
- Doğrudan ICPMS girişine bağlı olan bir laminer akış adaptör, bir başka PVC boru ile desolvator çıkışını bağlayın. Bir kütle akış kontrolörü ile argon kaynağı laminer akış adaptörünü bağlayın ve daha sonra istikrarlı bir çalışma koşulu sağlamak için Argon karıştırmak için kullanabilirsiniz.
- Adaptörü yanı sıra bir su terazisi ile dikey çelik boru hizalayın. Hizalama doğru değilse, bu damlacıkların önemli kayıplara yol açabilir. Gazlar sistemi ısınmak süre boyunca dışarı sızmasını önlemek için adaptöre bir fiş takın.
- . Yukarıda bahsedilen tüm gaz akışlarını ve Tablo 1 ayarları kullanarak cihazları başlatın sistem 15 dakika için ısıtın. kartuş ısıtıcı, sıcaklık stabilize peşin açmak için 2 saat gerekiyor.
- Siklonik helyum adaptörünün yükseklikte bir rafa şırınga pompaları yerleştirin. Arasındaki mesafeyi tutunşırınga pompaları ve mümkün olduğunca kısa adaptör.
4. Ölçümler
Not: Aşağıdaki protokol için kullanılabilir çözeltiler ve süspansiyonlar, çeşitli genel anlamda yazılmıştır. Ancak, hücre süspansiyonları, damlaları çoğunluğu sadece bir hücre taşıyan sağlamak için tek bir hücre analizi gerçekleştirilir <1 x 10 7 hücre / ml bir konsantrasyonda olacak şekilde seyreltilir. Şırınga çıkış aşağı işaret ve onlar aşağı işaret şekilde boru yüklemek böylece hücrelerin ölçümler bir açıyla şırınga pompaları yer için.
- Hortum şırıngalara bağlanır. Yük perfluoroheksan ile iki adet 5 ml'lik şırınga ve bir numune çözeltisi ya da süspansiyonu ile bir 1 ml şırınga ile. Şırıngalar ve tüp içinde sıkışıp tüm kabarcıklar çıkarın.
- Bir şırınga pompası şırınga takın ve çip girişlerine bağlayın. Başlangıç ayarlarını gelen kullanarak şırınga pompaları BaşlangıçTablo 1 (veya daha yüksek akış hızları). Akar stabilize 3 ila 5 dakika verin.
- Bir doku ile çip ucundan fazla sıvıyı çıkarın. sıvılar artık düz bir jet çip çıkartmak gerekir. Düz fırlatma, bir doku ile silerek elde edilemezse çip takın ve bu adımla başlamak.
- Adaptörün fişini çıkarın ve dikkatlice adaptörü içine çip takın. FC-40 Gerekirse çip yağlayın. Bir çip deneyler, en az 2 saat süre ile kullanılabilir.
- Tablo 1 tavsiye edilen ölçüm ayarları içinde olmak üzere akış hızını değiştirin. PFH Alt akış hızı PFH kaydeder, ancak aynı zamanda İzobarik etkileşimler nedeniyle sinyal arka plan, azaltır.
- (Seçilen akış hızlarına bağlı olarak) stabilize sistemi 2-5 dakika verin. Ilgi Analitlerin yüksek sinyal yoğunluğu için ICPMS optimize.
- Arda, tüm g akışlarını ayarlamakbunlar analit maksimum sinyal yoğunluğu kadar kütle akış kontrolörleri ile gazlar (Tablo 1 'de tavsiye edilen aralıklar bakınız) elde edilir. Plazma güç ve aynı şekilde ICPMS üzerine (üreticinin tavsiye aralıklara göre) odaklama lensi gerilimleri Dinle.
- 10 msn bir bekleme süresi ICPMS ayarlayın (kullanılan çok ICPMS için uygulanan ancak bir süre çözüldü satın sağlamak için diğer enstrümanlar ile ayarlanabilir). Imalatçının protokolü kullanılarak, özelde, m / z sinyalinin kayıt başlatın.
- Ölçümden sonra, değerlendirme için veri analizi programı ham veri aktarımı. Bin sayıları karşı bin merkezi değerlerini ortaya çıkan bir dahili-fonksiyonu, ve arsa ile 10 msn başına sayılarında veriler,. Bir Gauss fonksiyonu ile çizilen frekans dağılımı histogramı her tepe takınız. Ortalama ve uyum sigma sırasıyla, ortalama sinyal yoğunluğu ve standart sapmasını temsil eder.
- Eleman veya bir örnekle aynı akış hızlarında ilgi elemanları ihtiva eden bir tek ya da çok elemanlı standart solüsyonu ölçün.
- Mikroskop üzerine bir petri çanağına bir LADE çip yerleştirin. Daha iyi bir görüntü kalitesi için bir yuvarlak olmayan çipini kullanın. 2. adımda anlatılan, ama kısmen yuvarlak şekilli bir yerine basit bir dikdörtgen döküm formu kullanarak bu çip Üretiyor.
- Damlacık nesil başlatmak için adımları 4.2.1 ile 4.1 izleyin. Adım 5.1'de kullanılan akış oranları akış hızında ayarlayın.
- Bir mikroskop (20X objektif) bağlı bir yüksek hızlı kamera ile sulu damlacıkların Kayıt görüntüleri. Kayıtları ortalama damlacık çapı elde etmek Basu 25 ile damlacık morfometrisi ve velosimetri yazılımı gibi bir görüntü analiz yazılımı kullanın.
- Damlacık varsayarak bir küresel nesne, damlacık hacmini hesaplamak için ortalama damlacık çapı kullanın.
- Bu hacim ve kn itibarendamlacık bir analitin kendi konsantrasyonu gelen atomu sayısını hesaplar. Tespit etkinliği elde etmek için atomu sayısına göre damlacık başına ölçülen iyonların sayısına bölün. Bilinmeyen bir numunede atomların sayısını hesaplamak için bu algılama verimliliğini kullanın.
NOT: Her fiş arasındaki farklılıklar 22 küçük olduğu için, bu akış hızı, aynı kalması durumunda, her çip veya çözüm damlacık boyutu ölçümü tekrar gerekli değildir. Belirli bir akış oranlarına göre damlacık boyutları ve frekansların bir listesi Verboket ve ark. 22 tarafından yayınlanmıştır.
- Bu hacim ve kn itibarendamlacık bir analitin kendi konsantrasyonu gelen atomu sayısını hesaplar. Tespit etkinliği elde etmek için atomu sayısına göre damlacık başına ölçülen iyonların sayısına bölün. Bilinmeyen bir numunede atomların sayısını hesaplamak için bu algılama verimliliğini kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
sunulan sistem çözeltiler ya da hücreler ya da nano-tanecikleri içeren süspansiyonlar küçük hacimli ölçülmesi için kullanılabilecektir. Tek hücrelerden oluşan bir standart solüsyon ve karakterizasyonu Bir ölçüm örnekleri, burada gösterilmektedir. Diğer örnekler Verboket ve ark. 22 bulunabilir.
Tipik haliyle, bir çözeltinin, tek bir damlasının sinyal çok kısa bir olaydır. Genellikle, bir kaç 100 mikro-saniye 26 sürer. Burada kullanılan ICPMS ile. Bu gibi kısa sinyaller zamansal çözülemez (süresi 10 msn yaşamak) Şekil 7a ve Şekil Na standart solüsyonu sinyalleri ve frekans dağılımı histogramı göstermek 7b. damlacıkları bir zamansal titreme> 10 msn ile plazmadan varıyoruz. algılama eşitlenmemiş. Bir (201 ± 24), iki (381 ± 34) ya da üç (560 ± 45) 'in sinyalleri damlacıkları, bir bekleme süresi içinde tespit edilir. Sinyal yoğunluğu düşük varyasyon yüksek dro önerirplet monodispersiteye. İlk atık pik olasılıkla damlacık parçaları sonucudur; Bu parçalanma nedeni halen araştırılmaktadır.
(Fe, standart çözelti kullanılarak) 5 de tarif kalibrasyon yaklaşımı, fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde süspansiyon haline getirilmiş bir sığır / buzağı kırmızı kan hücrelerinin Fe içeriğinin belirlenmesi (çapı 6-7 mm) için test edilmiştir. 1 x 10 7 hücre ml -1 süspansiyon damlacıklarının büyük bir kısmı yerine tek bir hücre. Şekil 8, frekans dağılımı histogram hücrelerden sinyalleri gösterir sağlamak için kullanılmıştır. Ortalama olarak her hücre (bkz Verboket ark. 22) 5.3 ± 1.2 x 10 8 Fe atomları içeriyordu.
Damlacık nesil, hızlanma ve ejeksiyon Şekil 1. Mikrografik. Bir akış odaklama ayr olarakiyonu, tek dağılımlı sulu damlacıkların PFH akımı oluşturulur. Ek PFH ikinci bir bağlantıya ilave edilir. Daha sonra, sıvı akımı bir memeden LADE çip çıkarılır. Oklar akış yönünü gösterir. Ölçek çubuğu 500 mikron. Ankastre: LADE çip püskürtülmesinin ardından PFH kabukta sulu damlanın mikrografiği. Ölçek çubuğu 100 um. 22 izniyle uyarlanmıştır. Telif hakkı 2014 American Chemical Society. Bu rakam PS Dittrich laboratuvarında yayınlanmasından bu yana yapılan araştırma verileri ile modifiye edilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
SU-8 işleme Şekil 2. şematik. Önce bir yapışma tabakası kaplanır. Bir silikon gofret spinSU-8 2002 ile kaplı yumuşak pişmiş, sel ultraviyole ışık ve sonrası pişmiş ile gözler önüne serdi. Bu katmanın üzerine mikroakışkan yapılar üretilmektedir. gofret pişmiş SU-8 2050 ve yumuşak ile kaplanmış spin. mikroakışkan yapılarının tasarım photomask ile mor ötesi ışık ile maruz bırakılması ile gofret aktarılır. Bir temas sonrası fırında sonra, fotodirenç geliştirilen ve bir hardbake yapılır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Aşağıdaki özellikleri içeren LADE çip için photomask Şekil 3. Tasarım: döküm formu için) kılavuz yapılar, b) damlacık hızlanma PFH için bir giriş c) damlacık oluşturma, d) bir giriş için PFH için bir giriş Sulu numune için.çip ucunu keserek e) Gösterge hattı. Kanal genişlikleri f) 40 mikron, g) = 20 mm ve h) = 25 mm =. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4. LADE çip üretim süreci şeması. İlk yapılandırılmış ve düz PDMS parça çoğaltma kalıplama tarafından üretilmektedir. İki adet yapıştırıcı ile bağlanma ile bir araya birleştirilir. Son olarak, yonga ucu kesilir ve mikroakışkan kanallar Silanlanmış edilir. 22 izniyle uyarlanmıştır. Telif hakkı 2014 American Chemical Society. Bu rakam yayınlanmasından bu yana modifiye edilmiştir. büyük halini görmek için buraya tıklayınız Bu rakam.
Şekil 5. LADE çip için alüminyum döküm formunun Teknik çizim. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Kurulum (ölçekli değildir) Şekil 6. şematik çizim. Sistem LADE çip, bir siklonik adaptörü, ısıtmalı çelik boru, bir membran desolvator ve bir ICPMS oluşur. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayınız .
pload / 52525 / 52525fig7highres.jpg "/>
Bu sinyallerin Şekil 7. (A) kg -1 Na standart solüsyon 1 mg yapılan damlacıklarının sinyaller. (B) Frekans dağılımı histogramı. 10 msn'de bir (sarı) zaman sinyallerini, iki (kırmızı) veya üç (mavi) damlacıkları yaşamak kaydedildi. Ortalama ve sinyallerin standart sapma uygun Gauss fonksiyonu ile tespit edilmiştir. kullanılan akış hızları 0.5, 50, ve 60 ul dakika vardı - damlacık hızlanma için damlacık nesil için 1 sulu örnek, PFH ve PFH, sırasıyla. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
56 Fe + Şekil 8. Frekans dağılımı histogramı ge sinyallerikırmızı kan hücreleri tarafından nerated. ortalama ve sinyallerin standart sapma, Gauss fonksiyonu oturtulması yoluyla belirlendi. sırasıyla, damlacık hızlanma için damlacık nesil için hücre süspansiyonu, PFH 1 ve PFH - kullanılan akış oranları 2, 80, ve 80 ul dk.
| O gaz akış hızı | 0.6-0.8 L dk -1 | |
| Kartuş ısıtıcı | 30 W | |
| Desolvator membran sıcaklığı | 160 ° C | |
| Desolvator süpürme gaz akış hızı | 3-4 L dk -1 | |
| Ar gaz akışı oranı | 0.1 L dk -1 | |
| ICP plazma gücü | 1.300 W | |
| Örnek akış hızı | başlatmak | 1 ul dk -1 |
| ölçüm | 0,3-15 ul dk -1 | |
| PFH damlacık oluşturma Akış hızı | başlatmak | 60 ul dk -1 |
| ölçüm | 35-80 ul dk -1 | |
| PFH damlacık ivme Akış hızı | başlatmak | 60 ul dk -1 |
| ölçüm | 35-80 ul dk -1 |
Tablo 1. Başlat ayarları ICPMS ve şırınga pompaları için ölçüm ayarlarını önerilen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cips imalatı çok güvenilir olmasına rağmen, özel dikkat gerektiren imalat sırasında bazı kritik noktalar vardır. İlk olarak, montaj sırasında temizlik toz çip kirlenmesini önlemek için son derece önemlidir. Toz kanallarını bloke ve istikrarlı bir damlacık nesil önleyebilirsiniz. İkinci olarak, bu uç meme kanalına dik kesilir özellikle önemlidir. kesme açısı güçlü püskürtme açısını arttırır. Sıvı bir açıyla dışarı atılır ise püskürtülen damlacıklar kaybına neden olabilir.
Kurulum oluştururken kararlı olduğundan emin olun. metal borunun ve adaptörün dikey hizalama önemlidir. Ayrıca ölçümler sırasında özel dikkat edilmesi gereken bazı noktalar vardır. adaptöre çipin yerleştirilmesi dikkatle yapılmalıdır. Bu yerleştirme sırasında jet bozulur ve durur olduğunu olabilir. Hücreler pozisyon ve orie ile ölçümler içinenjektör pompaları ve boru ntation önemlidir. Bunların düzgün yerleşim şırınga ve tüp hücrelerin yerleşme azaltabilir.
Burada sunulan LADE çip mevcut ticari damlacık jeneratörleri üzerinde birçok avantajı vardır. Sistem, daha sağlamdır, kanal geometrisinin değiştirilmesi ile uzatılabilir, daha geniş bir damlacık boyutu aralığı sağlar ve atılmalıdır. Tek bir kullanım cihazı küçük kanallar yapışmasına neden olabilir ve her zaman kolayca yıkanamaz örneğin nanopartiküller ya da hücre süspansiyonları için olduğu gibi, tuzlar ya da katı artıklarının yüksek bir muhtevasına sahip numunelerin analizi için özel bir ilgi konusudur. MS içine LADE tarafından üretilen tek mikro damlacıkların taşıma hala sisteminde bir sınırlayıcı bir adımdır ve daha da optimize edilmesi gerekir. Mevcut damlacık taşıma tertibatı, aksi takdirde ek spektral ve spektral olmayan müdahaleler oluşturmak ve plazma dengesizliklere neden, ama sti olur PFH buharı, kaldırır rağmenMS de damlacık geliş ve tamamlanmamış bir damlacık taşıma yüksek bir zamansal titreme ll sonuçları. Ticari kullanılabilir damlacık giriş sistemleriyle karşılaştırıldığında bu kurulum için taşıma sistemi daha fazla ekipman gerektirir. Mevcut yonga örnek tanıtımı sadece için tasarlanmıştır. Ancak, hafif tasarım, gelişmiş tanıtımı değişiklikler ve numune hazırlama ile bulut gibi, seyreltme 27-29, ultra hızlı 30 karıştırma, kimyasal reaksiyonlar 31, ayırma 32-34, veya hücre 35,36 sıralama, on-chip uygulanacak adımlar. Gelişmiş tanıtım cihazlar altında biz örneğin bir tek çip ile sırayla örnek ve standart damlacıkların giriş veya paralel anlıyorum. Bu verimi artırmak ve kantitatif analiz doğruluğunu artıracak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicon wafer 100 mm | Si-Mat (Kaufering, Germany) | ||
| SU-8 2002 | Microchem Corp. (Massachusetts, U.S.A.) | ||
| SU-8 2050 | Microchem Corp. (Massachusetts, U.S.A.) | ||
| Acetone | Merk VWR (Darmstadt, Germany) | 100014 | |
| MR-developer 600 | Microresist Technology GmbH (Berlin, Germany) | ||
| Isopropanol | Merk VWR (Darmstadt, Germany) | 109634 | |
| 1H,1H,2H,2H-perfluorodecyltrichlorosilane | ABCR-Chemicals (Karlsruhe, Germany) | AB111155 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit (PDMS) | Dow Corning (Michigan, U.S.A.) | 39100000 | |
| Perfluorohexane 99% | Sigma-Aldrich (Missouri, U.S.A.) | 281042 | |
| FC-40 | ABCR-Chemicals (Karlsruhe, Germany) | AB103511 | |
| Phosphate-buffered saline | Life Technologies (Paisley, U.K.) | 10010-015 | |
| Red blood cells in phosphate-buffered saline | Rockland Immunochemicals Inc. (Pennsylvania, U.S.A.) | R400-0100 | |
| Single-element standard solutions Na, Fe | Inorganic Ventures (Virginia, U.S.A.) | ||
| Multielement standard solution | Merck Millipore (Massachusetts, U.S.A.) | IV | |
| Nitric acid | Sub-boiled | ||
| Ultrahigh-purity water | Merck Millipore (Massachusetts, U.S.A.) | ||
| Hot plate HP 160 III BM | Sawatec (Sax, Switzerland) | used for wafer preparation | |
| Spin modules SM 180 BM | Sawatec (Sax, Switzerland) | used for wafer preparation | |
| High resolution film photomask | Microlitho (Essex, U.K.) | ||
| Step profiler Dektak XT advanced | Bruker (Massachusetts, U.S.A.) | ||
| Hot plate MR 3002 | Heidolph (Schwabach, Germany) | used for replica molding | |
| 1.5 mm biopsy puncher | Miltex (Pennsylvania, U.S.A.) | 33-31AA/33-31A | |
| Spin coater WS-400 BZ-6NPP/LITE | Laurell (Pennsylvania, U.S.A.) | used for adhesive bonding | |
| Syringe pump neMESYS | Cetoni (Korbussen, Germany) | ||
| 1 ml syringe | Codan (Lensahn, Germany) | 62.1002 | |
| 5 ml syringe | B. Braun (Melsungen, Germany) | 4606051V | |
| PTFE tubing | PKM SA (Lyss, Switzerland) | PTFE-AWG-TFT20.N | |
| Quadrupole-based ICPMS ELAN6000 | PerkinElmer (Massachusetts, U.S.A.) | ||
| Membrane desolvator CETAC6000AT+ | CETAC Technologies (Nebraska, U.S.A.) | only the desolvator unit is used | |
| High speed camera Miro M110 | Vision Research (New Jersey, U.S.A.) | ||
| Data analysis program Origin pro | OriginLab Corp. (Massachusetts, U.S.A.) | version 8.6 | |
| Microscope | Olympus (Tokyo, Japan) | IX71 |
References
- Todoli, J. -L., Mermet, J. -M. Liquid sample introduction in ICP spectrometry: A Practical Guide. , Elsevier. Amsterdam. 10-1016 (2008).
- Sutton, K. L., B'Hymer, C., Caruso, J. A. Ultraviolet absorbance and inductively coupled plasma mass spectrometric detection for capillary electrophoresis - A comparison of detection modes and interface designs. J. Anal. At. Spectrom. 13 (9), 885-891 (1998).
- Todoli, J. -L., Mermet, J. -M. Sample introduction systems for the analysis of liquid microsamples by ICP-AES and ICP-MS. Spectrochim. Acta, Part B. 61 (3), 239-283 (2006).
- Olesik, J. W., Hobbs, S. E. Monodisperse dried microparticulate injector - A new tool for studying fundamental processes in inductively-coupled plasma. Anal. Chem. 66 (20), 3371-3378 (1994).
- Gschwind, S., Hagendorfer, H., Frick, D. A., Günther, D. Mass quantification of nanoparticles by single droplet calibration using inductively coupled plasma mass spectrometry. Anal. Chem. 85 (12), 5875-5883 (2013).
- Garcia, C. C., Murtazin, A., Groh, S., Horvatic, V., Niemax, K. Characterization of single Au and SiO2 nano- and microparticles by ICP-OES using monodisperse droplets of standard solutions for calibration. J. Anal. At. Spectrom. 25 (5), 645-653 (2010).
- Shigeta, K., et al. Sample introduction of single selenized yeast cells (Saccharomyces cerevisiae) by micro droplet generation into an ICP-sector field mass spectrometer for label-free detection of trace elements. J. Anal. At. Spectrom. 28 (5), 637-645 (2013).
- Orlandini v. Niessen, J. O., Schaper, J. N., Petersen, J. H., Bings, N. H. Development and characterization of a thermal inkjet-based aerosol generator for micro-volume sample introduction in analytical atomic spectrometry. J. Anal. At. Spectrom. 26 (9), 1781-1789 (2011).
- Orlandini v. Niessen, J. O., Petersen, J. H., Schaper, J. N., Bings, N. H. Comparison of novel and conventional calibration techniques for the analysis of urine samples using plasma source mass spectrometry combined with a new dual-drop-on-demand aerosol generator. J. Anal. At. Spectrom. 27 (8), 1234-1244 (2012).
- Shigeta, K., et al. Application of a micro-droplet generator for an ICP-sector field mass spectrometer - optimization and analytical characterization. J. Anal. At. Spectrom. 28 (5), 646-656 (2013).
- Teh, S. -Y., Lin, R., Hung, L. -H., Lee, A. P.
- Zheng, B., Tice, J. D., Ismagilov, R. F. Formation of arrayed droplets by soft lithography and two-phase fluid flow, and application in protein crystallization. Adv. Mater. 16 (15), 1365-1368 (2004).
- Theberge, A. B., et al. Microfluidic platform for combinatorial synthesis in picolitre droplets. Lab Chip. 12 (7), 1320-1326 (2012).
- Li, L., et al. Nanoliter microfluidic hybrid method for simultaneous screening and optimization validated with crystallization of membrane proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103 (51), 19243-19248 (2006).
- Zhang, Q., Liu, X., Liu, D., Gai, H. Ultra-small droplet generation via volatile component evaporation. Lab Chip. 14 (8), 1395-1400 (2014).
- Baret, J. C., Beck, Y., Billas-Massobrio, I., Moras, D., Griffiths, A. D. Quantitative cell-based reporter gene assays using droplet-based microfluidics. Chem. Biol. 17 (5), 528-536 (2010).
- Brouzes, E., et al. Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (34), 14195-14200 (2009).
- Pei, J., Li, Q., Lee, M. S., Valaskovic, G. A., Kennedy, R. T. Analysis of samples stored as individual plugs in a capillary by electrospray ionization mass spectrometry. Anal. Chem. 81 (15), 6558-6561 (2009).
- Kelly, R. T., Page, J. S., Marginean, I., Tang, K., Smith, R. D. Dilution-free analysis from picoliter droplets by nano-electrospray ionization mass spectrometry. Angew. Chem., Int. Ed. 48 (37), 6832-6835 (2009).
- Küster, S. K., et al. Interfacing droplet microfluidics with matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry: label-free content analysis of single droplets. Anal. Chem. 85 (3), 1285-1289 (2013).
- Pabst, M., Jefimovs, K., Zenobi, R., Dittrich, P. S. High-Resolution Droplet-Based Fractionation of Nano-LC Separations onto Microarrays for MALDI-MS Analysis. Analytical Chemistry. 86 (10), 4848-4855 (2014).
- Verboket, P. E., Borovinskaya, O., Meyer, N., Günther, D., Dittrich, P. S. A New Microfluidics-Based Droplet Dispenser for ICPMS. Analytical Chemistry. 86 (12), 6012-6018 (2014).
- Ammerman, C. N., You, S. M. Determination of the boiling enhancement mechanism caused by surfactant addition to water. J. Heat Transfer. 118 (2), 429-435 (1996).
- Samel, B., Chowdhury, M. K., Stemme, G. The fabrication of microfluidic structures by means of full-wafer adhesive bonding using a poly(dimethylsiloxane) catalyst. J Micromech Microeng. 17 (8), 1710-1714 (2007).
- Basu, A. S. Droplet morphometry and velocimetry (DMV): a video processing software for time-resolved, label-free tracking of droplet parameters. Lab Chip. 13 (10), 1892-1901 (2013).
- Dziewatkoski, M. P., Daniels, L. B., Olesik, J. W. Time-resolved inductively coupled plasma mass spectrometry measurements with individual, monodisperse drop sample introduction. Anal. Chem. 68 (7), 1101-1109 (1996).
- Abate, A. R., Hung, T., Mary, P., Agresti, J. J., Weitz, D. A. High-throughput injection with microfluidics using picoinjectors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107 (45), 19163-19166 (2010).
- Bremond, N., Thiam, A. R., Bibette, J. Decompressing emulsion droplets favors coalescence. Phys. Rev. Lett. 100 (2), 024501 (2008).
- Niu, X., Gulati, S., Edel, J. B., deMello, A. J. Pillar-induced droplet merging in microfluidic circuits. Lab Chip. 8 (11), 1837-1841 (2008).
- Song, H., Ismagilov, R. F. Millisecond kinetics on a microfluidic chip using nanoliters of reagents. J. Am. Chem. Soc. 125 (47), 14613-14619 (2003).
- Song, H., Chen, D. L., Ismagilov, R. F.
- Lombardi, D., Dittrich, P. S. Droplet microfluidics with magnetic beads: a new tool to investigate drug-protein interactions. Anal. Bioanal. Chem. 399 (1), 347-352 (2011).
- Edgar, J. S., et al. Compartmentalization of chemically separated components into droplets. Angew. Chem., Int. Ed. 48 (15), 2719-2722 (2009).
- Edgar, J. S., et al. Capillary electrophoresis separation in the presence of an immiscible boundary for droplet analysis. Anal. Chem. 78 (19), 6948-6954 (2006).
- Baret, J. C., et al. Fluorescence-activated droplet sorting (FADS): efficient microfluidic cell sorting based on enzymatic activity. Lab Chip. 9 (13), 1850-1858 (2009).
- Agresti, J. J., et al. Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107 (9), 4004-4009 (2010).
