수술 조직에서 기본 인간 대장 종양 세포의 분리 및 견인 세포 계측법 부드러운 탄성 기판에 직접 배양
Summary
A protocol is described to extract primary human cells from surgical colon tumor and normal tissues. The isolated cells are then cultured on soft elastic substrates (polyacrylamide hydrogels) functionalized by an extracellular matrix protein, and embedded with fluorescent microbeads. Traction cytometry is performed to assess cellular contractile stresses.
Abstract
암 세포 접착 수용체 이루어지는 코디 계층 – 기계 화학적 시스템과 관련된 신호 전달 막 단백질, 세포 골격 구조, 분자 모터 (1, 2)을 사용하여 복잡한 방식으로 기계적 강성 매트릭스 응답. Mechanosensitivity를 다른 암세포의 시험관에 하지 일차 인간 암 세포 불멸화 세포주 또는 일차 세포를 쥐 유래, 주로 연구 하였다. 따라서, 작은 시험관 일차 인간 대장 암 세포의 mechanosensitivity 대해 공지되어있다. 여기서, 최적화 프로토콜은 건강한 인간 암 수술 조직 샘플로부터 일차 인간 결장 세포의 분리를 설명하는 현상된다. 고립 대장 세포를 피브로넥틴 (세포 외 기질에 의해 기능화 기판 폴리 아크릴 아마이드 하이드로 겔과 강성 폴리스티렌 (~ 3.6 GPa의 강성) (10 kPa의 강성) (2 kPa의 강성) 부드럽고 뻣뻣한에 성공적으로 배양이 경우에). 형광 마이크로 비드를 세포 배양 표면 근방 소프트 겔에 포함되고, 정지 마찰 분석법 자유로운 개방형 액세스 소프트웨어를 이용하여 세포 수축 응력을 평가하기 위해 수행된다. 또한, 다른 강성 기판상의 면역 형광 현미경 검사는 기판의 강성의 함수로서 초점 유착을 함유하는 일차 전지의 형태, 세포 골격 조직 및 vinculin에 대한 유용한 정보를 제공한다.
Introduction
기계적인 미세 환경은, 생화학 적 요인 외에, 세포 기능을 조절하는데 중요한 역할을한다는 것이 최근 점점 분명하게되었다. 세포를 감지하고이 3-7 (2D 배양에서와 같이)에 부착 또는 (3D 배양에서와 같이)에 의해 포위되어있는 기판의 강성에 응답 할 수있다. 이렇게함으로써, 세포 분화 3, 4 형태, 이주 / 운동성 5 바이오 물성 (6), (7)의 성장 및 기타 프로세스를 변조 할 수있다.
암세포는 또한 접착 수용체의 조정, 계층 – 기계 화학적 결합과 관련된 신호 전달 막 단백질, 세포 골격 구조, 분자 모터 (1, 2)을 사용하여 2 차원 및 3 차원 매트릭스 강성 응답한다. 예를 들어, 유선 상피 세포 (MEC의) 150 아빠 기판에 배양 할 때 강성과 유사 정상적인 선포 실질을 형성건강한 유방 조직. 흥미롭게도, 이들은 종양 기질 (8)의 강성을 모방 딱딱한 기판 (> 5,000 PA)에서 배양 구조와 전사 모두 현상 종양의 특징은 나타낸다. 또 다른 실험은 유방 종양 콜라겐 가교 ECM 9 보강 동반되는 것을 나타낸다. 최근의 실험들은 생리적으로 중요한 강성 (20-47 kPa의)을 갖는 2 차원 기판에서 배양 있지만 (3.6 GPA) 기판 상에 매우 뻣뻣하지 않을 때 인간 결장암 (HCT-8) 세포 표현형 (MLP) 등의 전이를 표시하는 것을 보여준다 10- 제 12 .These 셀 폼과 같은 종양 세포 클러스터와 그 주변부터 서로 해리. 변화는 그들은 세포 – 세포 및 세포 – ECM 부착을 줄이고, 철새가, 확산, 발생 (R 전환에 E) 둥근 형태이 상피로. 이 발생하지 않는 매우 어려운 폴리스티렌 기판에 HCT-8 세포 배양악성 특징. 따라서이 HCT-8 세포 인해 적절한 미세 환경에 대한 노출로 전이 될 수 있음을 가정하고있다. 이들 실험이없는 일차 인간 암 세포 불멸화 암 세포주 또는 일차 쥐 유래 세포로 수행되는 것을 주목할 필요가있다.
최근 연구 증강 셀룰러 트랙션 응력 전이성 세포 13 국지적 연구는 폴리 아크릴 아미드 겔에서 다른 인간 암 세포주에 대한 견인력을 측정하는 것을 포함하는 잠재적 생물 리 학적 특성으로서 사용될 수 있다는 것을 제안한다. 또한, 전이성 암세포가 모든 경우에 13 비 전이성 세포에 비해 상당히 높은 트랙션 응력을 발휘할 수있는 것을 알 수있다. 그러나,이 결과는 직접적으로 유도 뮤린 유방암 세포주 (14)에 앞서 발표 결과와 모순. 또한, 최근의 연구는 세포 골격 리모델링 프로 불후 및 기본 인간의 세포 사이에 현저한 차이를 강조TEIN 프로파일과 세포 생존 단백질 발현 15. 따라서, 일차 인간 암 세포에 대한 견인을 포함한 생물 물리학 적 분석의 많은 방문하는 것이 중요하다. 일차 세포가 불멸화 된 암 세포주 견인 경향 요점을 되풀이 것인지 이는 질문을 다룰 것이다.
여기에 설명 된 프로토콜은 부드러운 기판 (폴리 아크릴 아마이드 하이드로 겔)뿐만 아니라에 페트리 접시에 그들을 배양 (건강과 암 모두) 주 인간의 대장 세포의 분리에 최적화되어 있습니다. 프로토콜은 소화 및 단일 세포 현탁액 (16)에 외과 적 조직 샘플의 결과의 효소 분해에 기초한다. 우리가 아는이 직접 세포 계측법 견인 용 내장형 형광 마이크로 비드와 부드러운 하이드로 겔 기판에 절연 차 대장 암과 정상 세포를 배양의 첫 번째 데모입니다. 투명 겔 기판은 또한 면역 염색을 할 수 있습니다. 이 분석은 밝혀 F – 굴지 조직의 차이기판 강성 변화와 같은 주요 인간의 대장 세포에 초점 유착. 이 세포 배양 플랫폼은 암 사전 진단을위한 매개 변수로 셀 강성과 견인 1 차 인간 세포의 다양한 생물 물리학 적 특성을 탐구의 가능성을 열어.
Protocol
Representative Results
Discussion
셀룰러 견인 스트레스는 최근 전이 상태 (13)의 잠재적 인 생물 물리학 적 지표로 떠오르고있다. 그러나 차 종양 세포와의 실험 견인 데이터는 현재까지 문헌에 존재하지 않습니다. 또한, 다른 강성 폴리 아크릴 아마이드 젤에 직접 배양 고립 된 차 대장 세포는 아직보고되지 않습니다. 따라서, 우리는 겔 및 폴리스티렌 (도 2)에 최적화 된 일차 결장 세포 배양 조건을 확립한다….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This project was funded by the National Science Foundation ECCS grant 10-02165, and the Interdisciplinary Innovation Initiative Program, University of Illinois grant 12035. M.Y. A. was funded at UIUC from NIH National Cancer Institute Alliance for Nanotechnology in Cancer ‘Midwest Cancer Nanotechnology Training Center’ Grant R25 CA154015A. Immnunostaining and confocal microscopy imaging were carried out at the Institute for Genomic Biology (IGB), UIUC. M.Y.A. acknowledges the discussions with B. J. Williams of UIUC regarding the isolation experiments. M.Y.A. acknowledges C. Nemeh and Abdul Bhuiya of UIUC for assistance in schematic and materials list preparation.
Materials
| Reagents | |||
| HBSS | Life technologies | 14175-095 | |
| PBS | Lonza | 17-516F | |
| Trypsin | Worthington | LS003736 | |
| Collagenese | Worthington | LS004176 | |
| 3- Aminopropyltrymethoxysilane (ATS) | Sigma-Aldrich | 281778 | |
| Glutaraldehyde | Polysciences, Inc. | 01201-5 | |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich | A4058 | |
| N- methylenebisacrylamide (bis) | Sigma-Aldrich | M1533 | |
| HEPES buffer solution | Sigma-Aldrich | 83264 | |
| Ammonium persulfate | Bio-Rad | 161-0700 | |
| Nˊ-tetramethylethylenediamine (TEMED) | Bio-Rad | 161-0801 | |
| Human fibronectin | BD biosciences | 354008 | |
| Hydrazine hydrate | Sigma-Aldrich | 18412 | Hazardous |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT15710 | |
| Signal enhancer | Life technologies | I36933 | |
| Monoclonal anti vinculin antibody | Sigma-Aldrich | V9131 | |
| Alexa fluor 488 goat anti-mouse IgG | Life technologies | A11001 | |
| TRITC phalloidin conjugates | Sigma-Aldrich | P1951 | |
| 0.1 µm fluroscent beads | Life technologies | F8801 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life technologies | 25200-056 | |
| Materials | |||
| 12 mm2 glass cover slips | Corning | 2865-12 |
References
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