Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Isolering af primære humane Colon tumorceller fra Kirurgiske Væv og Dyrkning dem direkte på Soft Elastic Substrater for Traction Cytometry

doi: 10.3791/52532 Published: June 4, 2015

Abstract

Kræftceller svare matrix mekanisk stivhed på en kompleks måde under anvendelse af en koordineret, hierarkisk mekanisk-kemisk system bestående af adhæsionsreceptorer og tilhørende signaltransduktion membranproteiner, den cytoskeletale arkitektur og molekylære motorer 1, 2. Mechanosensitivity forskellige cancerceller in vitro er undersøgt primært med immortaliserede cellelinier eller murine afledte primære celler, ikke med primære humane cancerceller. Derfor er lidt kendt om mechanosensitivity af primære humane coloncancer-celler in vitro. Her er en optimeret protokol udviklet som beskriver isolering af primære humane colon celler fra raske og kræft kirurgiske humane vævsprøver. Isoleret colonceller derefter med held dyrket på blødt (2 kPa stivhed) og stiv (10 kPa stivhed) polyacrylamid-hydrogeler og stiv polystyren (~ 3,6 GPa stivhed) substrater funktionaliseret af en ekstracellulær matrix (fibronectinI dette tilfælde). Fluorescerende mikroperler er indlejret i bløde geler nær cellekulturen overflade, og trækkraft assay udføres for at vurdere cellulære kontraktile spændinger ved hjælp af gratis open access software. Desuden immunfluorescensmikroskopi på forskellige stivhed substrater giver nyttige informationer om primær celle morfologi, cytoskelet organisation og vinculin indeholdende fokale adhæsioner som funktion af substrat stivhed.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

I de senere år er det blevet mere klart, at mekanisk mikromiljø, udover bio-kemiske faktorer, spiller en vigtig rolle i reguleringen af ​​celle- funktioner. Celler kan sanse og reagere på substratet stivhed, hvorpå de er klæbet til (som i 2D kultur) eller omgivet af (som i 3D kultur) 3-7. Ved at gøre dette kan celler modulere deres differentiering 3, morfologi 4, migration / motilitet 5, biofysiske egenskaber 6, vækst 7, og andre processer.

Kræftceller også reagere på 2D- og 3D-matrix stivhed ved hjælp af en koordineret, hierarkisk mekanisk-kemisk kombination af adhæsionsreceptorer og tilhørende signaltransduktion membranproteiner, den cytoskeletal arkitektur og molekylære motorer 1, 2. For eksempel brystepitelceller celler (MEC'er) danne normale acinære parenkym når de dyrkes på 150 Pa substrater, der svarer til stivhedenaf sunde brystvæv. Interessant, de udviser kendetegnende for et udviklingsland tumor, både strukturelle og transkriptionelle, når dyrket på stivere substrater (> 5.000 Pa), der efterligner stivheden af en tumor stroma 8. Endvidere viser et andet eksperiment, bryst tumorigenese er ledsaget af collagentværbinding og ECM afstivning 9. Nylige eksperimenter viser, at human colon carcinoma (HCT-8) celler vise metastase lignende fænotype (MLP), når de dyrkes på 2D substrater med fysiologisk relevant stivhed (20-47 kPa), men ikke på meget stiv (3,6 GPA) substrater 10- 12 .Disse celler første form tumor-lignende celle klynger og derefter tage afstand fra hinanden, startende fra periferien. Da dette epitel til afrundede morfologiske (E til R overgang) sker ændringer, de formere sig, reducere celle-celle og celle-ECM vedhæftning og blive vandrende. HCT-8 celler dyrket på meget hårde polystyren substrater ikke udviser dissemaligne træk. Således er det blevet antaget, at HCT-8 celler bliver metastatiske grund af deres eksponering for passende mikromiljø. Det er værd at bemærke, at disse forsøg udføres med immortaliserede cancercellelinier eller murine afledte primære celler, ikke med primære humane cancerceller.

En nylig undersøgelse foreslår, at augmented cellulære trækkraft stress kan anvendes som en potentiel biofysisk signatur for metastatiske celler 13 .Den undersøgelse omfatter måling trækkraft for forskellige humane cancercellelinier på polyacrylamidgeler. Det konstateres, at metastatiske cancerceller kan udøve væsentlig højere trækkraft stress sammenlignet med ikke-metastatiske celler i alle tilfælde 13. Men disse resultater direkte modstrid med de tidligere offentliggjorte resultater om murine afledt brystkræft cellelinier 14. Også, fremhæver en nylig undersøgelse bemærkelsesværdige forskelle mellem immortaliserede og primære humane celler i deres cytoskeletal remodeling protein profilering og celleoverlevelse proteinekspression 15. Derfor er det vigtigt at revidere mange af de biofysiske målinger, herunder trækkraft til primære humane cancerceller. Dette vil behandle spørgsmålet om, hvorvidt de primære celler rekapitulere immortaliseret cancer cellelinjer trækkraft tendens.

Protokollen beskrevet her er optimeret til isolering af primære humane colon-celler (både raske og kræft), og til dyrkning af dem på bløde substrater (polyacrylamid hydrogeler) samt på Petriskåle. Protokollen er baseret på fordøjelse og deraf følgende enzymatisk dissociation af kirurgisk vævsprøve i enkelt cellesuspension 16. Så vidt vi ved, er dette den første påvisning af dyrkning isoleret primær colon tumor og normale celler direkte på bløde hydrogel substrater med indlejret fluorescerende mikroperler til trækkraft cytometri. Gennemsigtige gel substrater tillader også immunfarvning. Denne analyse afslørede forskelle i F-actin organisation ogfokale sammenvoksninger i primære humane kolon celler som substrat stivhed ændringer. Denne cellekultur platform giver mulighed for at udforske forskellige biofysiske egenskaber af primære humane celler såsom celle stivhed og trækkraft som parametre for kræft prognosticering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Den nedenfor beskrevne protokol følger retningslinjerne fra UIUC menneskelig videnskabsetisk komité.

1. Indsamling og fordøjelse af Kirurgisk vævsprøve

  1. Opsaml tumorvævsprøve lige efter kolon resektion (figur 1A og 1B). Saml væv fra en tilstødende sunde websted.
  2. Overfør vævet straks til en 15 ml hætteglas indeholdende 12 ml HBSS opløsning. Opbevar hætteglasset på is inde i en isoleret skum kassen.
  3. Transportere væv, der indeholder hætteglasset til en vævskultur hætte til yderligere bearbejdning inden for 45 min. Opbevar hætteglasset på en isblok inde i hætten.
  4. Hæld den medfølgende væv i en 6-brønds plade indeholdende 6-7 ml HBSS opløsning ved anvendelse af en pipette.
    Bemærk: Mængden af ​​væv per brønd er ikke kritisk i dette skylletrin.
  5. Hold 6 brønds plade på en is blok. Skyl vævet i HBSS opløsning to gange.
  6. Skær væv rent ind adskilte sektioner med sterile LAFsor. Hakkekød væv i mindre sektioner ikke er større end 1-2 mm 3 i størrelse med en steril skalpel.
  7. Et mærket 0,1% trypsin hætteglas (indeholdende 1 ml 0,1% trypsin opløsning) før overførsel vævet vejes. Overfør ~ 20 mg væv til hver af de 0,1% trypsin hætteglas med en pipette.
  8. Forsøge at minimere overførslen af ​​HBSS i trypsin hætteglasset for at undgå yderligere fortynding af trypsin.
  9. Trypsin hætteglas efter væv overførsel veje; dokumenterer forskellen som vævsmasse.
  10. Hæld ~ 20 mg væv og 1 ml trypsin i hver brønd i en plade med 24 brønde.
  11. Sæt plade med 24 brønde på rysteapparat i køleskab ved 4 ° C i 16-20 timer. I løbet af denne ventetid periode eller på et tidligere tidspunkt, forberede polyacrylamid gel substrater og funktionalisere dem med ECM-proteiner som beskrevet i afsnit 3.

2. Enzymatisk Dissociation af vævsprøve til Single Cell Suspension og dyrkning isolerede celler på ECM funktionaliserede Elastic Substrates og Stive Polystyren Retter

  1. Efter 16-20 timers inkubation i trypsin godt ved 4 ° C på rysteapparat, overføre væv fra 4 ° C trypsin til 4 ° C komplet vækstmedier hætteglas (indeholdende 2-3 ml komplet vækstmedium) under anvendelse af en pipette. Sikre minimal overførsel af trypsin i vækstmedier.
    Bemærk: Komplet vækstmedier formulering er som følger: RPMI 1640 basen medium suppleret med hesteserum til en slutkoncentration på 10% og penicillin-streptomycin til 1% af den samlede opløsning.
  2. Anbring væv, der indeholder hætteglasset medier i et varmt vandbad ved 37 ° C i 12-15 min.
  3. Overfør væv til et 15 ml hætteglas indeholdende HBSS løsning med en pipette, ryst forsigtigt.
  4. Gentag 2.3.
  5. Fjerne væv fra HBSS opløsning og overføres til 0,1% collagenase opløsning (i HBSS) hætteglas indeholdende 1 ml opløsning. Inkuber i 45 minutter ved 37 ° C og 5% CO2 miljø i en befugtet cellekultur inkubator. I løbet af venteperioden, varm growth medier i et 15 ml hætteglas ved 37 ° C i vandbad.
  6. Træk alle væv fragmenter i pipette minimering collagenase fremførsel. Skub blot væv fragmenter i forvarmet dyrkningsmedier hætteglas.
  7. Placer en 40 um godt indsatsfilterholderen i hver brønd i en 6-brønds plade. Fugt filteret med 1 ml celledyrkningsmedier.
  8. Der tritureres væv i medier med en 10 ml glas pipette flere gange, indtil vævet er fuldstændigt dissocieret.
  9. Opretholde pipettespidsen så tæt som muligt på bunden af ​​hætteglasset.
  10. Deponere opløsningen på filteret for at fjerne snavs og udissocierede dele.
  11. Centrifuger filtreret cellesuspension i medier ved 150 xg i 5 minutter ved stuetemperatur.
  12. Fjern supernatanten bagefter og resuspender cellepelleten med 2 ml frisk kulturmedier.
  13. Tæl celler under anvendelse af et hæmocytometer (hvis påkrævet). Frø isoleret primære celler på ekstracellulære matrix (ECM) funktionaliserede geler og polystyren retter på ønskede koncentration.

3. Forberedelse og Funktionalisering af forskellige Stivhed Polyacrylamid (PA) Gels og polystyren Substrater

Bemærk: visuel demonstration af § 3, seerne / læserne henvises til en nylig Journal of visualiseret Forsøg (JOVE) artikel 17.

  1. Indfører publicerede protokoller 18, 19, aktivere 12 mm2 dækglas kemisk at sikre kovalent binding af hydrogelen.
    1. Først behandle glas dækglas med 3- Aminopropyltrymethoxysilane (ATS) i 7 minutter ved stuetemperatur.
    2. Fjern ATS helt med DI vand skylning og behandle dækglas med 0,5% glutaraldehyd (fortyndet i PBS fra 70% Glutaraldehyd stamopløsning) opløsning i 30 minutter.
  2. Opnå 2 kPa gel løsninger ved at blande 5% w / v acrylamid-opløsning og 0,05% N, N '-methylenebisacrylamide (bis) opløsning i 10 mM HEPES-bufret saltvand 20. Anvende 8% w / v acrylamid og 0,13% N, N '-methylenebisacrylamide (bis) opløsning i 10 mM HEPES-bufret saltvand i 10 kPa gel 20.
    1. I begge tilfælde anvendes 1: 200 ammoniumpersulfat (10% vægt / volumen) og 1: 2.000 N, N, N ', N' tetramethylethylendiamin (TEMED) som igangsætter og katalysator for polymerisationsprocessen hhv.
    2. Også tilsættes 100 pi fluorescerende perler på 2 kPa gel løsning som betroede markører 21, 22.
  3. Indbetal et fald på 20 pi præ-polymer PA gel løsning på 12 mm 2 aktiveret glas dækglas. Placer en anden 12 mm 2 regelmæssig glas dækglas på drop. Sørg for, at dråben spredes mellem dækglas grund kapillaritet. Vend sandwich til 2 kPa geler til at sikre, at de fleste af perlerne komme nær cellekulturen overflade.
  4. Hærde PA gel til 45 minutter ved stuetemperatur.
  5. Skrælle øverste dækglas under anvendelse af en enkelt kant barbermaskine.
    Bemærk: Under skrælning, løsrivelse fortsætter fra den ene kantaf sandwich. Gelen forbliver klæbende til den aktiverede objektglasset.
  6. Opbevar gelerne i PBS-opløsning før anvendelse.
  7. Funktionalisere PA geler og glas med ECM-molekyler, human fibronectin i en koncentration på 50 ug / ml efter offentliggjorte metoder 23.
    1. Kort beskrevet inkuberes substrater med 2 ml ren hydrazinhydrat O / N.
    2. Fjern hydrazinhydrat og skyl substraterne grundigt med deioniseret vand.
    3. Vask substrater med 5% eddikesyre i 30 minutter.
    4. Fjerne eddikesyre og skyl substraterne grundigt med deioniseret vand.
    5. Holde substraterne nedsænket i DI vand i 30 minutter.
    6. Inkubér substrater med oxiderede fibronectin i 35 min ved en koncentration på 50 pg / ml.
    7. Skyl substraterne med PBS på rysteapparat ved lav rpm i 10 min.
    8. Inkuber alle underlag ved 37 ° C i 2-3 ml dyrkningsmedier til 30 min før udpladning af cellerne.
      Bemærk: Plate celler i en tyndt populated måde (1,000-3,000 celler / cm2). Hver gel-dækket glas slip skal være indeholdt i en 35 mm petriskål. Tillad celler til at klæbe helt, før nogen mikroskopi (mindst O / N).

4. Trækkraft Mikroskopi og immunfluorescensmikroskopi Analyser

  1. Trækkraft Microscopy Assay
    1. Varm 0,25% trypsin-EDTA / 10% SDS-opløsning ved 37 ° C i vandbad i 10 minutter før trækkraft eksperimenter starter.
    2. Fjern en gel fra cellekultur inkubator på et tidspunkt og sted på den fluorescerende inverteret mikroskop etape (32X forstørrelse).
    3. Finde en enkelt celle i synsfeltet. Fjern petriskålen låg.
    4. Læs fase kontrast billede af celle (f.eks, figur 3).
    5. Skift billedbehandlingstype til fluorescens og vælg passende filter. Flyt ikke mikroskopbordet eller prøve i løbet af denne tid.
    6. Tage et billede af den fluorescerende kugler displaced af cellulær trækkraft (figur 4C).
    7. Tilsæt 1 ml trypsin / SDS løsning på petriskål at frigøre cellen fra gel. Flyt ikke mikroskopbordet eller prøve i løbet af denne tid. Også tage en kontrol billede af cellen for at sikre fuldstændig fjernelse fra gel.
    8. Tag en reference (null kraft) billede af perlerne efter cellen er fjernet.
    9. Gentag trin 4.1.2-4.1.8 for alle andre geler.
    10. Lav en billedstak hjælp ImageJ fra de to billeder, der er erhvervet i trin 4.1.6 og 4.1.8 for hver enkelt sag. For at generere billedstak, bruge følgende sekvens af kommandoer i ImageJ efter åbning billederne: Billede → Stacks → Billeder at stable.
    11. For at opnå felt forskydningen og trækkraft, bruge ImageJ plugins efter offentliggjorte metoder 21, 22 Få koder og detaljerede tutorials for disse plugins ved hjælp af følgende link:. https://sites.google.com/site/qingzongtseng/imagejplugins.
      1. Juster billederne i stakken ved hjælp af 'Skabelon Matching "plugin. Anvendelse følgende sekvens af kommandoer i ImageJ efter åbning af billedstak genereret i trin 4.1.10: Plugins → Skabelon Matching → Juster Skiver i Stack → OK. Gem billedet stakken dermed. Bruge denne nye billedstak i de følgende trin.
      2. Opnå felt forskydningen ved hjælp af PIV (partikel billedet Velocimetri) plugin (figur 4D). Anvendelse følgende sekvens af kommandoer efter åbning af billedstak gemte i trin 4.1.11.1: Plugins → PIV → Iterativ PIV (Basic) → OK → Accepter denne PIV og output → OK. Gem PIV output i samme mappe som i det oprindelige billede stakken. Brug dette som input i næste trin.
      3. Endelig bruger FTTC (Fouriertransformation trækkraft cytometri) plugin for at opnå den trækkraft kort (Figur 4E). Anvendelse følgende sekvens af kommandoer: Plugins → FTTC → InsERT materialeegenskaber, dvs, Youngs modul og Poissons forhold for PA-gel → OK → Vælg PIV uddatafilen gemte i trin 4.1.11.2 → OK. Gem FTTC resulterer i den samme mappe som i billedet stakken og PIV output.
  2. Immunfluorescensmikroskopi Assays
    1. Tag substraterne, der skal immunfarvet til den laminare hætte og fjerne dyrkningsmediet.
    2. Skyl substraterne med PBS og fikseres cellerne med 4% paraformaldehyd i PBS i 20 minutter ved stuetemperatur.
    3. Vask substrater med PBS i 3 gange (5 min hver gang). Følgelig inkuber substraterne med 500 pi signal forstærker i 30 minutter og skyl med PBS.
    4. Cellerne inkuberes med monoklonalt anti-vinculin antistof ved en 1: 250 fortynding i PBS i 45 minutter ved stuetemperatur. Vask substrater med PBS i 3 gange (5 min hver gang).
    5. Inkuber prøverne med sekundært antistof Alexa Fluor 488 gede-anti-muse-IgG ved en 1: 200 fortyndingi PBS ved stuetemperatur i 30 minutter. Vask substrater med PBS i 3 gange (5 min hver gang).
    6. At visualisere F-actin struktur, inkuberes celler med TRITC phalloidin konjugater ved en koncentration 50 ug / ml i 45 minutter ved stuetemperatur. Vask substrater med PBS i 3 gange (5 min hver gang).
    7. Billede prøverne ved hjælp af konfokal scanning laser mikroskop (Figur 5A - 5D).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Den ovenfor beskrevne protokol er anvendt med succes til flere vævsprøver (n = 12) fra fire forskellige patienter under retningslinjerne fra Institutional Review Board. Figur 1A viser en repræsentativ colorektal tumor lige efter operationen, hvorfra vævssnit til cellekulturer opnås. En typisk vævssnit i HBSS opløsning efter overførsel til den laminare hætte til videre behandling er vist i figur 1B. En skematisk af fordøjelse og enzymatisk dissociation af kirurgisk vævsprøve i enkeltcelle-suspension er vist i figur 2.

Efter vellykket væv dissociation, er isolerede primære humane celler podet på PA geler og polystyren retter. Fase kontrast mikrografer (figur 3A og 3B) illustrerer repræsentative morfologi af primære humane coloncancer og normale celler som en funktion af substrat stivhed. Det er klart,primære kolon celler (både sunde og kræft) spredes mere på polystyren retter sammenlignet med PA geler (figur 3A og 3B).

Trækkraft assays udføres på ECM (fibronectin) overtrukket bløde 2 kPa geler efter bekræftelse af invasiv adenokarcinom fra patologisk H & E-farvning (figur 4A). PA geler er ensartet overtrukket med fibronectin som vist i figur 4B. For at lette sammenligning bør alle trækkraft forsøg til tumor og sunde kolon celler udføres samtidigt. Figur 4C viser et øjebliksbillede af de nanostørrelse fluorescerende kugler indlejret inde i gelen. Fra fordrevne og reference perle billeder, er felterne forskydning opnået ved hjælp af ImageJ PIV plugin 21, 22. En repræsentant felt genereret af invasive kolon tumorceller på 2 kPa gel perle forskydning vises i figur 4D. Figur 4E viser trækkraft stress opnået ved hjælp ImageJ FTTC plugin svarende til forskydning felt i figur 4D 21, 22.

Figur 5 viser F-actin og vinculin indeholdende fokale adhæsioner af primære humane colon-celler på bløde 2 kPa geler og stive polystyren substrater. Nr actin fiber var til stede i de mindre spread celler på bløde geler (figur 5A1 - 5A2). Punktat vinculin indeholder fokale sammenvoksninger er til stede på bløde geler (figur 5B1 - 5B2). Omvendt primære celler viser godt spredt morfologi, veldefinerede actin stress fibre og diskrete aflange fokale sammenvoksninger på stive polystyren substrater (figur 5C - 5D).

Figur 1
Figur 1. (A) Tumor efter kolon resektion. (B) Vævssnit fra tumoren for celle isolation. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2. Skematisk af fordøjelse og enzymatisk dissociation af kirurgisk vævsprøve i enkelt celle suspension. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3. Vellykket primære humane colon cellekultur (både kræft og normal) på forskellige stivhed geler og på polystyren skålen. Fasekontrast billeder viser tyPical morfologi (A) tumorceller og (B) Normale celler på forskellige stivhed substrater. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4. (A) H & E-farvning bekræfter invasiv adenokarcinom. (B) Fibronectin-farvning afslører, at geler ensartet overtrukket med ECM molekyler. (C) Nanoscale perler indlejret i gel som betroede markører. (D) felt genereret af tumorceller på bløde PA under anvendelse PIV plugin i ImageJ som beskrevet i 4.1.11.2 Repræsentant forskydning. (E) Trækkraft stress udøvet af tumorceller på blød gel svarende til forskydningen feltet i (D) opnået via FTTC stik i i ImageJ som beskrevet i 4.1.11.3. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5
Figur 5. immunfluorescensfarvning af F-actin og vinculin på blød gel og på hårde polystyren substrater. Nr actin fiber var til stede i mindre spredning (A1) tumorcelle eller (A2) normal celle på bløde 2 kPa geler. Punktat vinculin indeholder fokale sammenvoksninger er til stede på bløde geler (B1 - B2). Omvendt primære celler viser godt spredt morfologi, veldefinerede actin stress fibre (C1 - C2) og diskrete aflange fokale sammenvoksninger (D1 - D2) på stive polystyren substrater.2 / 52532fig5large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Cellular trækkraft stress har for nylig vist sig som en potentiel biofysisk indikator for metastatisk tilstand 13. Dog findes der ingen eksperimentelle trækkraft data med primære tumorceller i litteraturen til dato. Desuden er direkte dyrkning isolerede primære kolon celler på forskellige stivhed polyacrylamidgeler ikke rapporteret endnu. Derfor etablerer vi en optimeret primær kolon celledyrkningsbetingelser på geler og polystyren (figur 2). Fluorescerende mikroperler indkapsling nær cellekultur overflade under forberedelse blød gel muliggør måling af felt forskydning og trækkraft genereret af primære humane celler (figur 4C, 4D og 4E). Desuden kan immunofluorescens assays give vigtige oplysninger om cytoskelet organisation og fokale sammenvoksninger som substrat stivhed ændringer (figur 5A - 5D). Bemærk, at forskellige kræft og normal immortaliseret cellelinjer også vise augmented spredning, actin stress bundt dannelse og modne langstrakte fokale adhæsioner med forøget stivhed substrat 4, 24-25.

Protokollen kan let vedtaget / modificeret til isolering af primære celler fra kirurgiske væv fra forskellige humane organer eller andre dyr. Inkubationstiden for vævet i dissociation agenser - trypsin og collagenase - skal optimeres empirisk for hvert program. Hertil kommer, at filteret størrelse til at fjerne snavs og udissocierede væv dele er også en vigtig parameter for at vælge baseret på forventede maksimale cellestørrelse i suspenderet tilstand (40 pm i denne protokol).

En begrænsning ved metoden er, at et par bløde geler kan mangle konsekvent lokalisering af de fluorescerende perler nær cellekultur overflade (afsnit 3.3), som kan påvirke følgende trækkraft cytometri målinger (afsnit 4.1). Dette kan let omgås ved at undersøgegeloverfladen for bead tæthed og fordeling med fluorescerende mikroskopi før cellekultur. Følgelig kan geler med relativt ikke-homogen vulst fordeling kasseres. En anden metode er at anvende en nyligt foreslåede metode, der muliggør en præcis lokalisering af perlerne nær cellekulturen overflade 17.

Forsigtighed bør tages for at begynde at behandle de kirurgiske prøver, så snart de modtages, helst inden for 45 minutter. Det mest kritiske trin i protokollen er den optimale eksponeringstid af vævet i trypsin og collagenase løsning til at opnå isolation udbytte, men bevarer tilstrækkelig cellelevedygtighed. Før dyrkning af cellerne på bløde hydrogeler, skal bekræftes med fluorescerende mikroskopi perlen tæthed og fordeling. Også, skal erhverves efter bekræfter, at cellen er helt frigjort fra geloverfladen en null kraft image.

Sammenfattende er en protokol, beskrevet, at resultaterne dissocierede enkeltceller suspension fra kirurgisk kræft / normal vævsprøve. Denne isolation af enkelte primære tumorceller fra kirurgiske prøver efterfulgt af deres kultur på bløde og hårde underlag tillader forskellige downstream biofysiske målinger, fx celle stivhed ved hjælp af AFM, intracellulær reologi hjælp mikroinjicerede partikler, cellemigration / motilitet og vesikel dynamik analyser. Disse målinger kan anvendes til cancer prognose. Protokollen er med succes blevet anvendt til udvinding og kultur murine cardiomyocytes samt 26. Metoden præsenteres her, kan anvendes til at isolere primære humane celler fra kirurgiske væv af forskellige organer og til kultur dem direkte på anden stivhed substrat for mechanobiology studier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
HBSS Life technologies 14175-095
PBS Lonza 17-516F
Trypsin Worthington LS003736
Collagenese Worthington LS004176
3- Aminopropyltrymethoxysilane (ATS)  Sigma-Aldrich 281778
Glutaraldehyde Polysciences, Inc. 01201-5
Acrylamide Sigma-Aldrich A4058
N-methylenebisacrylamide (bis) Sigma-Aldrich M1533
HEPES buffer solution Sigma-Aldrich 83264
Ammonium persulfate Bio-Rad 161-0700
Human fibronectin BD biosciences 354008
Hydrazine hydrate Sigma-Aldrich 18412 Hazardous
Acetic acid Sigma-Aldrich A6283
Paraformaldehyde  Electron Microscopy Sciences RT15710
Signal enhancer Life technologies I36933
Monoclonal anti vinculin antibody  Sigma-Aldrich V9131
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG Life technologies A11001
TRITC phalloidin conjugates  Sigma-Aldrich P1951
0.1 µm fluroscent beads Life technologies F8801
0.25% Trypsin-EDTA Life technologies 25200-056
Materials
12 mm2 glass cover slips Corning 2865-12

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ingber, D. E. Can cancer be reversed by engineering the tumor microenvironment. Semin. Cancer Biol. 18, 356-364 (2008).
  2. Kumar, S., Weaver, V. M. Mechanics, malignancy, metastasis: the force journey of a tumor cell. Cancer Metastasis Rev. 28, 113-127 (2009).
  3. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
  4. Yeung, T., et al. Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion. Cell Motil. Cytoskeleton. 60, 24-34 (2005).
  5. Pelham, R. J., Wang, Y. L. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, (25), 3661-3665 (1997).
  6. Solon, J., Levental, I., Sengupta, K., Georges, P. C., Janmey, P. A. Fibroblast adaptation and stiffness matching to soft elastic substrates. Biophys. J. 93, 4453-4461 (2007).
  7. Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. Substrate flexibility regulates growth and apoptosis of normal but not transformed cells. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 279, 1345-1350 (2000).
  8. Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).
  9. Levental, K. R., et al. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell. 139, 891-906 (2009).
  10. Tang, X., et al. Mechanical force affects expression of an in vitro metastasis-like phenotype in HCT-8 cells. Biophys. J. 99, 2460-2469 (2010).
  11. Ali, M. Y., Saif, M. T. A. Substrate Stiffness Mediated Metastasis Like Phenotype of Colon Cancer Cells is Independent of Cell to Gel Adhesion. Cell. Mol. Bioeng. (2014).
  12. Ali, M. Y., Chuang, C. Y., Saif, M. T. A. Reprogramming cellular phenotype by soft collagen gels. Soft Matter. (2014).
  13. Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential. PLoS ONE. 7, (2), e32572 (2012).
  14. Indra, I., Undyala, V., Kandow, C., Thirumurthi, U., Dembo, M., Beningo, K. A. An in vitro correlation of mechanical forces and metastatic capacity. Phys. Biol. 8, (1), (2011).
  15. Alge, C. S., Hauck, S. M., Priglinger, S. G., Kampik, A., Ueffing, M. Differential protein profiling of primary versus immortalized human RPE cells identifies expression patterns associated with cytoskeletal remodeling and cell survival. J. Proteome Res. 5, (4), 862-878 (2006).
  16. Oikonomou, E., Kothonidis, K., Zografos, G., Nasioulas, G., Andera, L., Pintzas, A. Newly established tumourigenic primary human colon cancer cell lines are sensitive to TRAIL-induced apoptosis in vitro and in vivo. Br. J. Cancer. 97, (1), 73-84 (2007).
  17. Knoll, S. G., Ali, M. Y., Saif, M. T. A. A novel method for localizing reporter fluorescent beads near the cell culture surface for traction force microscopy. J. Vis. Exp. (91), (2014).
  18. Wang, Y. L., Pelham, R. Preparation of a flexible, porous polyacrylamide substrate for mechanical studies of cultured cells. Methods in Enzymology. 298, 489-496 (1998).
  19. Tang, X., Ali, M. Y., Saif, M. T. A. A novel technique for micro-patterning proteins and cells on polyacrylamide gels. Soft Matter. 8, 3197-3206 (2012).
  20. Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties. Current Protocols in Cell Biology. 10-16 (2010).
  21. Tseng, Q., et al. Spatial organization of the extracellular matrix regulates cell–cell junction positioning. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, (5), 1506-1511 (2012).
  22. Chopra, A., et al. Augmentation of integrin-mediated mechanotransduction by hyaluronic acid. Biomaterials. 35, (1), 71-82 (2014).
  23. Damljanovic, V., Lagerholm, B. C., Jacobson, K. Bulk and micropatterned conjugation of extracellular matrix proteins to characterized polyacrylamide substrates for cell mechanotransduction assays. Biotechniques. 39, (6), 847-851 (2005).
  24. Tilghman, R. W., et al. Matrix rigidity regulates cancer cell growth and cellular phenotype. PLoS ONE. 5, (9), e12905 (2010).
  25. Ulrich, T. A., de Juan Pardo, E. M., Kumar, S. The mechanical rigidity of the extracellular matrix regulates the structure, motility, and proliferation of glioma cells. Cancer Res. 69, 4167-4174 (2009).
  26. Williams, B. J., Anand, S. V., Rajagopalan, J., Saif, M. T. A. A self-propelled biohybrid swimmer at low Reynolds number. Nat. Commun. 5, (2014).
Isolering af primære humane Colon tumorceller fra Kirurgiske Væv og Dyrkning dem direkte på Soft Elastic Substrater for Traction Cytometry
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ali, M. Y., Anand, S. V., Tangella, K., Ramkumar, D., Saif, T. A. Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry. J. Vis. Exp. (100), e52532, doi:10.3791/52532 (2015).More

Ali, M. Y., Anand, S. V., Tangella, K., Ramkumar, D., Saif, T. A. Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry. J. Vis. Exp. (100), e52532, doi:10.3791/52532 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter