Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

בידוד של תאי גידול במעי גס אנושיים ראשוניים מרקמות כירורגי וCulturing אותם ישירות על מצעים אלסטיים רכים לגרירה Cytometry

doi: 10.3791/52532 Published: June 4, 2015

Abstract

תאים סרטניים להגיב למטריקס קשיחות מכאנית באופן מורכב באמצעות מערכת מתואמת, היררכית mechano-כימי מורכבות מקולטנים הידבקות וחלבוני קרום הולך האותות הקשורים, ארכיטקטורת cytoskeletal, ומנועים מולקולריים 1, 2. Mechanosensitivity של תאי סרטן שונים במבחנה הם חקר בעיקר עם קווים הנציחו תא או תאים ראשוניים בעכברים נגזרים, לא עם תאי סרטן אנושיים ראשוניים. לפיכך, מעט מאוד ידוע על mechanosensitivity של תאי סרטן המעי הגס אנושיים ראשוניים במבחנה. כאן, פרוטוקול מותאם מפותח המתאר את הבידוד של תאי מעי גס אנושיים ראשוניים מדגימות אנושיות כירורגית בריאה וסרטניות ברקמה. תאי מעי גס מבודדים אז הם מתורבתים בהצלחה על רך (2 kPa נוקשות) ונוקשה (10 kPa נוקשות) הידרוג polyacrylamide וקלקר קשיח (~ 3.6-GPA נוקשות) מצעים פונקציונליות על ידי מטריקס (פיברונקטיןבמקרה הזה). microbeads פלורסנט מוטבע בג'לי רך ליד משטח תרבית תאים, וassay המתיחה מבוצע על מנת להעריך לחצי התכווצות סלולריים באמצעות תוכנת גישה פתוחה בחינם. בנוסף, מיקרוסקופיה immunofluorescence על מצעי קשיחות שונים מספקת מידע שימושי על מורפולוגיה העיקרית תא, ארגון שלד התא וvinculin מכילה הידבקויות מוקד כפונקציה של קשיחות מצע.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

בשנים האחרונות זה הפך להיות ברור יותר ויותר כי מיקרו-סביבה מכאנית, בנוסף לגורמים ביו-כימיים, ממלא תפקיד חשוב בויסות פונקציות תא. תאים יכולים לחוש ולהגיב לקשיחות המצע שעליו הם דבקים (כמו בתרבות 2D) או מוקפת ב( כמו בתרבות 3D) 3-7. בעשותם כך, תאים יכולים לווסת בידולם 3, מורפולוגיה 4, הגירה / תנועתיות 5, נכסים ביו-פיזי 6, צמיחת 7, ותהליכים אחרים.

תאים סרטניים גם להגיב למטריצת קשיחות 2D and 3D באמצעות שילוב מתואם, היררכי mechano-כימי של קולטני הידבקות וחלבוני קרום הולך האותות הקשורים, ארכיטקטורת cytoskeletal, ומנועים מולקולריים 1, 2. לדוגמא, תאי אפיתל החלב (MECs) טופס parenchyma acinar הנורמלי כאשר בתרבית על 150 מצעי אבא שדומה לנוקשותשל רקמת שד בריאה. מעניין לציין, הם מפגינים סימני ההיכר של גידול מתפתח, גם מבני ותעתיק, כאשר בתרבית על מצעים נוקשה (> 5000 אבא) המחקים את הנוקשות של סטרומה גידול 8. בנוסף, ניסוי נוסף מראה כי tumorigenesis השד מלווה בcrosslinking קולגן וECM התקשות 9. ניסויים שנעשו לאחרונה מראים כי קרצינומה מעי גס אנושית (HCT-8) תאים להציג גרורות כמו פנוטיפ (MLP) כאשר הם בתרבית על מצעי 2D שיש נוקשות רלוונטיות מבחינה פיזיולוגית (20-47 kPa), אבל לא על נוקשה מאוד (3.6 GPA) מצעים 10 12 .These תאי צבירי תאים כמו גידול בצורה הראשונה ולאחר מכן לנתק את זה מזה, החל מהפריפריה. כאפיתל זה למעוגל מורפולוגיים (E למעבר R) שינוי מתרחש, הם מתרבים, להפחית תאי תאים והידבקות התא-ECM, והפכו נודד. HCT-8 תאים בתרבית על מצעי קלקר מאוד קשים אינו מציגים אלהתכונות ממאירות. כך זה כבר שיערו כי HCT-8 התאים להפוך לגרורתי בשל חשיפתם למייקרו-הסביבה מתאימה. ראוי לציין שניסויים אלה מבוצעים עם קווים הנציחו תא סרטני או תאים ראשוניים בעכברים נגזרים, לא עם תאי סרטן אנושיים ראשוניים.

מחקר שנערך לאחרונה מציע כי לחץ מתיחה סלולארי Augmented עשוי לשמש כחתימת biophysical פוטנציאל לתאים גרורתי 13 מחקר .the כרוך מדידת כוח מתיחה לשורות תאי הסרטן אנושיות שונות על ג'ל polyacrylamide. הוא מצא כי תאי סרטן גרורתי יכולים להפעיל לחץ מתיחה גבוה יותר באופן משמעותי בהשוואה לתאים שאינם גרורתי בכל המקרים 13. עם זאת, תוצאות אלה ישירות בסתירה לממצאים שפורסמו קודם לכן בשורות תאי סרטן השד בעכברים נגזרו 14. כמו כן, מחקר שנערך לאחרונה מדגיש הבדלים ראויים לציון בין תאים אנושיים הנציחו והעיקריים בפרו שיפוץ cytoskeletalפרופיל חלבון והביטוי חלבון הישרדות תא 15. לפיכך, חשוב לבקר רב של מבחני biophysical כוללים מתיחה לתאי סרטן אנושיים ראשוניים. זה יעסוק בשאלה אם התאים הראשוניים לשחזר מגמת מתיחת שורות תאי הסרטן הונצחה.

הפרוטוקול המתואר כאן הוא מותאם לבידוד של תאים ראשוניים אדם מעי גס (גם בריאים וסרטניים), ועבור culturing על מצעים רכים (הידרוג polyacrylamide), כמו גם על צלחות פטרי. הפרוטוקול מבוסס על מערכת עיכול ודיסוציאציה האנזימטית הסוגר של דגימת רקמה כירורגית לתוך תא בודד השעיה 16. למיטב ידיעתנו, זה הוא ההפגנה הראשונה של culturing גידול במעי הגס ראשוני מבודד ותאים נורמלים ישירות על מצעים רכים הידרוג'ל עם microbeads פלורסנט המשובץ למתיחת cytometry. מצעי ג'ל שקופים גם לאפשר immunostaining. assay זה מתגלה הבדלים בארגון F- אקטין והידבקויות מוקד בתאי מעי גס אנושיים עיקריים שינויי מצע נוקשות. פלטפורמת תרבית תאים זה מפותחת את האפשרות לחקור מאפייני biophysical שונים של תאים אנושיים העיקריים כגון תא נוקשות ומתיחה כפרמטרים לprognostics הסרטן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

הפרוטוקול המתואר להלן כדלקמן ההנחיות של ועדת אתיקה במחקר האנושי UIUC.

1. איסוף ועיכול של דגימת רקמת כירורגי

  1. לאסוף את דגימת רקמת גידול מייד אחרי כריתת מעי גס (איור 1 א ו -1 B). לאסוף רקמה מאתר בריא סמוך גם כן.
  2. העברת הרקמה מייד לבקבוקון המכיל 15 מיליליטר 12 מיליליטר פתרון HBSS. שמור את הבקבוקון על קרח בתוך תיבת קצף מבודדת.
  3. להעביר את הבקבוקון המכיל רקמות למכסת מנוע בתרבית רקמה לעיבוד נוסף בתוך 45 דקות. שמור את הבקבוקון על גוש קרח בתוך מכסה המנוע.
  4. יוצקים את הרקמה שסופקה לצלחת 6 היטב המכילה 6-7 מיליליטר של פתרון HBSS בעזרת פיפטה.
    הערה: הסכום של רקמה לכל גם הוא לא קריטי בשלב זה שטיפה.
  5. שמור את צלחת 6 גם על גוש קרח. יש לשטוף את הרקמה בפתרון HBSS פעמיים.
  6. לחתוך רקמות נקיות למקטעים מופרדים עם scis סטריליסור. רקמת בשר טחון לחלקים קטנים יותר שאינו עולה על 1-2 מ"מ 3 בגודלו עם להב אזמל סטרילי.
  7. שוקל בקבוקון שכותרתו 0.1% טריפסין (המכיל 1 מיליליטר של 0.1% פתרון טריפסין) לפני העברת הרקמות. העבר ~ 20 מ"ג לרקמה כל אחד מבקבוקוני טריפסין 0.1% עם טפטפת.
  8. נסה למזער את העברת HBSS לתוך בקבוקון טריפסין, כדי למנוע דילול נוסף של טריפסין.
  9. לשקול את בקבוקוני טריפסין לאחר העברת רקמות; לתעד את ההבדל כמסת הרקמה.
  10. יוצקים ~ 20 מ"ג ורקמות מיליליטר 1 טריפסין לבאר כל צלחת גם 24.
  11. שים את הצלחת גם 24 על שייקר במקרר ב 4 מעלות צלזיוס במשך 16-20 שעות. במהלך תקופת ההמתנה זה או במועד מוקדם יותר, להכין מצעי ג'ל polyacrylamide וfunctionalize עם חלבוני ECM כאמור בסעיף 3.

2. אנזימתי דיסוציאציה של דגימת רקמה להשעית תא בודדת ותאים מבודדים Culturing על ECM פונקציונליות אלסטיים Substrates ומנות פוליסטירן קשיחים

  1. לאחר 16-20 שעות של דגירה בטריפסין גם ב 4 ° C על שייקר, להעביר רקמה מטריפסין 4 ° C עד 4 ° C בקבוקון שלם תקשורת צמיחה (המכיל 2-3 מיליליטר של תקשורת צמיחה מלאה) בעזרת פיפטה. להבטיח העברה מינימאלית של טריפסין לתקשורת צמיחה.
    הערה: ניסוח תקשורת צמיחה מלא הוא כדלקמן: מדיום 1640 RPMI בסיס בתוספת סרום סוס לריכוז סופי של 10% ופניצילין, סטרפטומיצין עד 1% מפתרון כולל.
  2. הנח את הרקמה המכילה בקבוקון תקשורת באמבט מים חם על 37 מעלות צלזיוס במשך 12-15 דקות.
  3. העברת הרקמה 15 מיליליטר בקבוקון המכיל פתרון HBSS בעזרת פיפטה, ללחוץ בעדינות.
  4. חזור על 2.3.
  5. הסרה של רקמה מפתרון HBSS והעברת 0.1% פתרון collagenase (בHBSS) בקבוקון המכיל פתרון 1 מיליליטר. דגירה של 45 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 בסביבת חממת תרבות תא humidified. במהלך תקופת ההמתנה, growt החםתקשורת h 15 מיליליטר בקבוקון על 37 מעלות צלזיוס באמבט מים.
  6. משוך את כל שברי הרקמה לתוך שריד collagenase צמצום פיפטה. הוצא רק שברי הרקמה לתוך צלוחיות תקשורת התרבות מחוממות מראש.
  7. מניחים מסנן היטב להוסיף 40 מיקרומטר לבאר כל צלחת גם 6. להרטיב את המסנן עם תקשורת ותרבות תא 1 מיליליטר.
  8. רקמת Triturate בתקשורת עם מספר פעמים פיפטה זכוכית 10 מיליליטר עד הרקמה ניתקה לחלוטין.
  9. לשמור על קצה פיפטה הקרוב ככל האפשר לבסיס של הבקבוקון.
  10. להפקיד את הפתרון על המסנן כדי להסיר שאריות וחלקי undissociated.
  11. צנטריפוגה מסוננת השעיה תא בתקשורת ב XG 150 במשך 5 דקות על RT.
  12. הסר את supernatant לאחר מכן וresuspend תא גלולה עם 2 מיליליטר תקשורת תרבות הטרי.
  13. ספירת התאים באמצעות hemocytometer (אם נדרש). זרע מבודד תאים ראשוניים על מטריצה ​​תאית (ECM) ג'לי פונקציונליות ומנות קלקר בריכוז רצוי.

3. הכנה וFunctionalization של ג'לי שונה נוקשות polyacrylamide (הרשות הפלסטינית) ומצעי פוליסטירן

הערה: הפגנה חזותית של סעיף 3, הצופים / קוראים מופנים לז'ורנל האחרון של ניסויי Visualized (יופיטר) סעיף 17.

  1. פרוטוקולי אימוץ פרסמו 18, 19, 12 מ"מ להפעיל 2 כיסוי זכוכית מחליק כימי כדי להבטיח קוולנטיים המחייב של הידרוג'ל.
    1. ראשית, כיסוי זכוכית פינוק מחליק עם 3 Aminopropyltrymethoxysilane (ATS) במשך 7 דקות ב RT.
    2. כיסוי הסר את ATS לחלוטין עם שטיפת המים DI ולטפל מחליק עם Glutaraldehyde 0.5% (בדילול מלא PBS 70% ממניות פתרון Glutaraldehyde) פתרון למשך 30 דקות.
  2. להשיג 2 פתרונות ג'ל kPa ידי ערבוב 5% w / פתרון acrylamide נ 'ושל 0.05% N, -methylenebisacrylamide פתרון' N (BIS) שבנאגר מלוח HEPES 10 מ"מ 20. השתמש 8% w / v וacrylamide 0.13% N, -methylenebisacrylamide פתרון 'N (BIS) ב 10 נאגר מלוח HEPES מ"מ לג'ל 10 kPa 20.
    1. בשני המקרים, להשתמש 1: 200 persulfate אמוניום (10% w / v) ו -1: 2000 N, N, N ', N' -tetramethylethylenediamine (TEMED) כיוזם והזרז לתהליך פילמור, בהתאמה.
    2. כמו כן, להוסיף 100 חרוזי ניאון μl לפתרון 2 ג'ל kPa כסמני אמונים 21, 22.
  3. להפקיד ירידה של 20 μl מראש פולימר פתרון ג'ל הרשות הפלסטינית על 12 מ"מ 2 להחליק את מכסה הזכוכית הופעלה. מקום אחר 12 מ"מ 2 כיסוי הזכוכית להחליק רגיל בירידה. ודא כי הירידה מתפשטת בין התלושים לכסות בשל קפילריות. הפוך את הכריך לג'לי 2 kPa כדי להבטיח שרוב חרוזים להתקרב משטח תרבית תאים.
  4. לרפא את הג'ל הרשות הפלסטינית במשך 45 דקות ב RT.
  5. לקלף להחליק את המכסה העליון באמצעות סכין גילוח קצה אחד.
    הערה: במהלך קילוף, ניתוק ממשיך מקצה אחדשל הכריך. ג'ל נשאר חסיד לשקופית הזכוכית הופעלה.
  6. אחסן את ג'לי בפתרון PBS לפני השימוש.
  7. Functionalize ג'לי הרשות הפלסטינית וזכוכית עם מולקולות ECM, פיברונקטין אדם בריכוז של 50 מיקרוגרם שיטות מיליליטר הבא שפורסמו / 23.
    1. בקצרה, דגירה מצעים עם O 2 מיליליטר מימה הידרזין טהור / ​​N.
    2. הסר מימה הידרזין ולשטוף את מצעים ביסודיות עם מים די.
    3. שטוף את מצעים עם 5% חומצה אצטית למשך 30 דקות.
    4. הסר חומצה אצטית ולשטוף את מצעים ביסודיות עם מים די.
    5. שמור את מצעים שקועים במי DI למשך 30 דקות.
    6. דגירה מצעים עם פיברונקטין חמצון במשך 35 דקות בריכוז של 50 מיקרוגרם / מיליליטר.
    7. יש לשטוף את מצעים עם PBS על שייקר בסל"ד נמוך במשך 10 דקות.
    8. דגירה כל מצעים על 37 מעלות צלזיוס בתקשורת ותרבות 2-3 מיליליטר במשך 30 דקות לפני ציפוי התאים.
      הערה: תאי פלייט בלאכלס בדלילותאופן ד (1,000-3,000 תאים / 2 סנטימטר). כל תלוש זכוכית מכוסה ג'ל צריך להיות כלול בצלחת פטרי 35 מ"מ. לאפשר לתאים לדבוק לחלוטין לפני כל מיקרוסקופיה (לפחות O / N).

4. מבחני מיקרוסקופית מיקרוסקופית הכוח וImmunofluorescence גרירה

  1. Assay מתיחה מיקרוסקופית כוח
    1. 0.25% טריפסין-EDTA 10% פתרון חם / SDS על 37 מעלות צלזיוס באמבט מים במשך 10 דקות לפני שניסויי מתיחה להתחיל.
    2. הסר ג'ל אחד מתרבית תאי החממה בזמן ומקום על הבמה הניאון הפוך מיקרוסקופ (הגדלה 32x).
    3. מצא את תא בודד בשדה הראייה. הסר את מכסה צלחת פטרי.
    4. קח תמונה בניגוד שלב של תא (לדוגמא, איור 3).
    5. לעבור את מצב ההדמיה לקרינה ובחר מסנן מתאים. אל תזיז את הבמה מיקרוסקופ או המדגם בתקופה זו.
    6. קח תמונה של displac חרוזי ניאוןאד על ידי מתיחה סלולרית (איור 4C).
    7. להוסיף 1 מיליליטר טריפסין פתרון / SDS לצלחת פטרי לנתק את התא מג'ל. אל תזיז את הבמה מיקרוסקופ או המדגם בתקופה זו. כמו כן, לקחת תמונת שליטה של ​​התא על מנת להבטיח הסרה מלאה מג'ל.
    8. קח תמונת התייחסות (כוח null) של חרוזים לאחר התא מוסר.
    9. חזרו על שלבי 4.1.2-4.1.8 לכל ג'לים האחר.
    10. הפוך ערימת תמונה באמצעות ImageJ משתי התמונות שנרכשו בשלב 4.1.6 ו4.1.8 לכל מקרה ומקרה. על מנת ליצור את ערימת התמונה, להשתמש הרצף הבא של פקודות בImageJ לאחר פתיחת התמונות: תמונת → → ערימות תמונות למחסנית.
    11. כדי להשיג את שדה העקירה וגרירה, להשתמש בתוספי ImageJ הבאים שיטות שפורסמו 21, 22 השג קודים ומדריכים מפורטים לתוספים אלה באמצעות הקישור הבא:. Https://sites.google.com/site/qingzongtseng/imagejplugins.
      1. יישר את התמונות בערימה באמצעות התוסף "התאמת תבנית '. השימוש הבא רצף של פקודות בImageJ לאחר פתיחת ערימת תמונה שנוצרה בשלב 4.1.10: תוספים → התאמת תבנית → פרוסות ישרו בסטאק → אישור. שמור את ערימת התמונה כתוצאה מכך. השתמש ערימת תמונה חדשה זו בשלבים הבאים.
      2. השג את שדה העקירה באמצעות תוסף PIV (velocimetry תמונת חלקיקים) (איור 4D). שימוש הבא רצף של פקודות לאחר פתיחת ערימת התמונה שנשמרה בצעד 4.1.11.1: התוספים → PIV PIV → איטרטיבי (יסוד) → אישור → קבל PIV זה ופלט → בסדר. שמור את פלט PIV באותה הספרייה כמו בערימת התמונה המקורית. להשתמש בזה כקלט בשלב הבא.
      3. לבסוף להשתמש FTTC (התמרת פורייה מתיחת cytometry) תוסף לך את מפת המתיחה (איור 4E). רצף השימוש הבא של פקודות: התוספים → FTTC → Insתכונות חומר ERT, כלומר, מודולוס של יאנג ומקדם פואסון של אישור → ג'ל הרשות הפלסטינית → בחרו את קובץ פלט PIV שמר בשלב 4.1.11.2 → אישור. שמור FTTC תוצאות באותה הספרייה כמו בערימת התמונה ופלט PIV.
  2. מבחני מיקרוסקופית immunofluorescence
    1. קח את מצעים לimmunostained למכסה המנוע למינרית ולהסיר את התקשורת והתרבות.
    2. יש לשטוף את מצעים עם PBS ולתקן את התאים עם paraformaldehyde 4% ב- ​​PBS עבור 20 דקות ב RT.
    3. שטוף את מצעים עם PBS במשך 3 פעמים (5 דקות בכל פעם). כתוצאה מכך, דגירה מצעים עם משפר אות 500 μl למשך 30 דקות ולשטוף עם PBS.
    4. דגירה תאים עם נוגדן אנטי vinculin חד שבטי בדילול 1: 250 ב PBS במשך 45 דקות ב RT. שטוף את מצעים עם PBS במשך 3 פעמים (5 דקות בכל פעם).
    5. דגירה הדגימות עם נוגדנים משני IgG אנטי עכבר 488 עיזים אלקסה פלואוריד בדילול 1: 200PBS ב RT למשך 30 דקות. שטוף את מצעים עם PBS במשך 3 פעמים (5 דקות בכל פעם).
    6. כדי להמחיש את מבנה F- אקטין, דגירה תאים עם TRITC phalloidin conjugates ב 50 מיקרוגרם / מיליליטר ריכוז במשך 45 דקות ב RT. שטוף את מצעים עם PBS במשך 3 פעמים (5 דקות בכל פעם).
    7. תמונת הדגימות באמצעות מיקרוסקופ לייזר סריקת confocal (איור 5 א '- 5D).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

הפרוטוקול שתואר לעיל מועסק בהצלחה לדגימות רקמה מרובות (n = 12) מארבעה חולים שונים תחת הנחיות של ועדת הבדיקה המוסדית. איור 1 א ממחיש גידול מעי גס נציג מייד לאחר הניתוח שממנו סעיפי הרקמות לתרביות תאים מתקבלים. סעיף רקמה טיפוסי בפתרון HBSS לאחר העברה למכסה המנוע למינרית לעיבוד נוסף מוצג באיור 1. סכמטי של מערכת עיכול וניתוק האנזימטית של דגימת רקמה כירורגית לתוך השעיה תא בודדת מוצג באיור 2.

לאחר ניתוק רקמה מוצלח, תאים אנושיים עיקריים מבודדים הם זורעים על ג'לי הרשות הפלסטינית ומנות קלקר. micrographs ניגוד שלב (איור 3 א ו3B) להמחיש את מורפולוגיה הנציג של סרטן מעי גס וראשוני של אדם תאים נורמלים כפונקציה של קשיחות מצע. ברור שתאי מעי גס ראשוני (גם בריאים וסרטניים) להפיץ יותר על מנות קלקר בהשוואה לג'לי הרשות הפלסטינית (איור 3 א ו3B).

מבחני מתיחה מבוצעים על ECM (פיברונקטין) מצופה 2 ג'לי kPa רך לאחר אישור של אדנוקרצינומה פולשנית מהכתמת פתולוגי H & E (איור 4 א). ג'לי הרשות הפלסטינית הם מצופים באופן אחיד עם פיברונקטין כפי שמוצג באיור 4. על מנת להקל על השוואה, כל ניסויי המתיחה לגידול ותאי מעי גס בריאים צריכים להתבצע באותו הזמן. איור 4C מציג תמונת מצב של חרוזי ניאון ננו מוטבעים בתוך ג'ל. מהתמונות שנעקרו וחרוז התייחסות, שדות העקירה מתקבלים באמצעות תוסף ImageJ PIV 21, 22. שדה עקירת נציג חרוז שנוצר על ידי תאים סרטניים במעי הגס פולשנית על 2 ג'ל kPa מוצג באיור 4D. איור 4E תערוכות stre מתיחהss שהושג באמצעות תוסף ImageJ FTTC המתאים לעקירת שדה באיור 21 4D, 22.

איור 5 מראה את F- אקטין וvinculin מכיל הידבקויות מוקד של תאי מעי גס אנושיים ראשוניים על 2 ג'לי kPa רך ומצעי קלקר קשיחים. אין סיבים אקטין היו נוכחים בתאי התפשטות פחות על ג'לי רך (איור 5A1 - 5A2). vinculin punctate מכילה הידבקויות מוקד נמצא על ג'לי רך (איור 5B1 - 5B2). לעומת זאת, תאים ראשוניים מראים מורפולוגיה גם התפשטות, סיבי אקטין מתח מוגדר היטב והידבקויות בדידות מוארכות מוקד על מצעי קלקר קשיחים (5C דמויות - 5D).

איור 1
גידול באיור 1. (א) לאחר כריתת מעי גס. סעיפי רקמות (ב ') מהגידול לבידוד תא. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. סכמטי של מערכת עיכול וניתוק האנזימטית של דגימת רקמה כירורגית לתוך השעיה תא בודדת. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
3. תרבות איור מוצלחת תא מעי גס אנושי ראשוני (שני סרטן ונורמלי) על ג'לי נוקשות שונה ועל קלקר צלחת. בניגוד שלב תמונות להראות tyמורפולוגיה של pical (א) בתאי גידול ו- (ב) תאים רגיל על מצעים קשיח שונים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
צביעת איור 4. (א) H & E מאשרת אדנוקרצינומה פולשנית. מכתים (B) פיברונקטין מגלה כי ג'לי מצופים באופן אחיד עם מולקולות ECM. חרוזים (C) ננומטריים מוטבעים בתוך ג'ל כסמני אמונים. שדה עקירת נציג שנוצר על ידי תאים סרטניים על ג'ל הרשות הרך באמצעות תוסף PIV בImageJ כפי שמתואר ב4.1.11.2 (ד '). (ה) לחץ המופעל על ידי גרירה תאים סרטניים בג'ל רך המתאים לעקירת שדה ב( ד ') שהושג באמצעות תקע FTTC בImageJ כפי שמתואר ב4.1.11.3. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5. מכתים Immunofluorescent של F- אקטין וvinculin בג'ל רך ועל מצעי קלקר קשים. אין סיבים אקטין היה נוכח בתא פחות התפשטות (A1) גידול או (A2) התא נורמלי על 2 ג'לי kPa רך. vinculin punctate מכילה הידבקויות מוקד נמצא על ג'לי רך (B1 - B2). לעומת זאת, תאים ראשוניים מראים מורפולוגיה גם התפשטות, סיבי אקטין מתח מוגדר היטב (C1 - C2) והידבקויות בדידות מוארכות מוקד (D1 - D2) על מצעי קלקר קשיחים.2 52532fig5large.jpg "target =" / _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

לחץ מתיחה סלולרי התפתח לאחרונה כמחוון biophysical פוטנציאל של מדינה גרורתי 13. עם זאת, אין נתונים מתיחה ניסיוניים עם תאי גידול ראשוניים קיימים בספרות עד כה. כמו כן, תאי מעי גס ראשוני מבודדים ישירות culturing על ג'ל polyacrylamide הקשיחות שונה לא דיווחו עדיין. לפיכך, אנו קובעים תנאי תרבית תאי מעי גס ראשוני מותאמים על ג'לי ופוליסטירן (איור 2). אנקפסולציה microbeads פלורסנט ליד משטח תרבית התאים במהלך הכנת ג'ל רכה מאפשרת המדידה של שדה עקירה ומתיחה שנוצרה על ידי תאים אנושיים ראשוניים (איור 4C, 4D ו4E). בנוסף, מבחני immunofluorescence יכולים לספק מידע חשוב לגבי ארגון שלד תא והידבקויות מוקד שינויי מצע נוקשות (איור 5 א - 5D). שים לב שהסרטן שונה ותא הונצח רגילקווים גם להראות augmented מתפשטת, היווצרות חבילה אקטין מתח ובוגר הידבקויות מוקד מוארכות עם קשיחות מוגברת מצע 4, 24-25.

ניתן לאמץ את הפרוטוקול בקלות / שונה לבידוד של תאים ראשוניים מרקמות כירורגית של איברים אנושיים שונים או בעלי חיים אחרים. זמן הדגירה של רקמה בסוכני הניתוק - טריפסין וcollagenase - צריך להיות מותאם באופן אמפירי עבור כל יישום. בנוסף, גודל המסנן להסרת פסולת וחלקי רקמת undissociated הוא גם פרמטר חשוב לבחור בהתבסס על גודל מרבי צפוי תא במצב מושעה (40 מיקרומטר בפרוטוקול זה).

מגבלה אחת של השיטה היא שכמה ג'לי רך עשוי חסר לוקליזציה של חרוזי הניאון ליד משטח תרבית התאים (סעיף 3.3) שעלול להשפיע לרעה על מתיחת cytometry מדידות (סעיף 4.1) הבאה עקבית. זה ניתן לעקיפה בקלות על ידי בחינהמשטח ג'ל לצפיפות חרוז והפצה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי לפני תרבית תאים. כתוצאה מכך, ג'לים עם הפצת חרוז יחסית שאינה הומוגנית יכול להיות מושלך. גישה נוספת היא להשתמש בשיטה מוצעת לאחרונה, המאפשרת איתור מדויק של חרוזים קרובים לפני שטח תא תרבות 17.

זהירות יש לנקוט כדי להתחיל עיבוד הדגימות כירורגית כמו ברגע שהם קיבלו, רצוי תוך 45 דקות. השלב הקריטי ביותר בפרוטוקול הוא את זמן חשיפה האופטימלי של הרקמות בפתרון טריפסין וcollagenase כדי להשיג תשואת בידוד, עדיין שומר על כדאיות תא מספיק. לפני culturing התאים על הידרוג רך, צפיפות חרוז וההפצה צריכה להיות אישרו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. כמו כן, תמונת כוח null צריכה להיות שנרכשה לאחר אישור שהתא מנותק לחלוטין ממשטח ג'ל.

לסיכום, פרוטוקול מתואר כי מחדשיש תוצאות ניתקו השעיה תאים בודדים ממדגם כירורגית סרטני / נורמלי רקמה. בידוד זה של תאי גידול ראשוניים אחת מדגימות כירורגית ואחריו את התרבות שלהם על מצעים רכים וקשים מאפשר מדידות biophysical במורד הזרם שונות, למשל, נוקשות תא באמצעות AFM, rheology תאיים באמצעות חלקיקי microinjected, הגירה / תנועתיות תא, וניתוח דינמיקת שלפוחית. מדידות אלה עשויות לשמש לפרוגנוזה הסרטן. הפרוטוקול שמש בהצלחה לחילוץ והתרבות של שריר לב בעכברים, כמו גם 26. השיטה שהוצגה כאן יכולה לשמש לבודד תאים אנושיים עיקריים מרקמות ניתוחיות של איברים שונים ולתרבותם ישירות על מצע קשיחות שונה ללימודי mechanobiology.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
HBSS Life technologies 14175-095
PBS Lonza 17-516F
Trypsin Worthington LS003736
Collagenese Worthington LS004176
3- Aminopropyltrymethoxysilane (ATS)  Sigma-Aldrich 281778
Glutaraldehyde Polysciences, Inc. 01201-5
Acrylamide Sigma-Aldrich A4058
N-methylenebisacrylamide (bis) Sigma-Aldrich M1533
HEPES buffer solution Sigma-Aldrich 83264
Ammonium persulfate Bio-Rad 161-0700
Human fibronectin BD biosciences 354008
Hydrazine hydrate Sigma-Aldrich 18412 Hazardous
Acetic acid Sigma-Aldrich A6283
Paraformaldehyde  Electron Microscopy Sciences RT15710
Signal enhancer Life technologies I36933
Monoclonal anti vinculin antibody  Sigma-Aldrich V9131
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG Life technologies A11001
TRITC phalloidin conjugates  Sigma-Aldrich P1951
0.1 µm fluroscent beads Life technologies F8801
0.25% Trypsin-EDTA Life technologies 25200-056
Materials
12 mm2 glass cover slips Corning 2865-12

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ingber, D. E. Can cancer be reversed by engineering the tumor microenvironment. Semin. Cancer Biol. 18, 356-364 (2008).
  2. Kumar, S., Weaver, V. M. Mechanics, malignancy, metastasis: the force journey of a tumor cell. Cancer Metastasis Rev. 28, 113-127 (2009).
  3. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
  4. Yeung, T., et al. Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion. Cell Motil. Cytoskeleton. 60, 24-34 (2005).
  5. Pelham, R. J., Wang, Y. L. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, (25), 3661-3665 (1997).
  6. Solon, J., Levental, I., Sengupta, K., Georges, P. C., Janmey, P. A. Fibroblast adaptation and stiffness matching to soft elastic substrates. Biophys. J. 93, 4453-4461 (2007).
  7. Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. Substrate flexibility regulates growth and apoptosis of normal but not transformed cells. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 279, 1345-1350 (2000).
  8. Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).
  9. Levental, K. R., et al. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell. 139, 891-906 (2009).
  10. Tang, X., et al. Mechanical force affects expression of an in vitro metastasis-like phenotype in HCT-8 cells. Biophys. J. 99, 2460-2469 (2010).
  11. Ali, M. Y., Saif, M. T. A. Substrate Stiffness Mediated Metastasis Like Phenotype of Colon Cancer Cells is Independent of Cell to Gel Adhesion. Cell. Mol. Bioeng. (2014).
  12. Ali, M. Y., Chuang, C. Y., Saif, M. T. A. Reprogramming cellular phenotype by soft collagen gels. Soft Matter. (2014).
  13. Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential. PLoS ONE. 7, (2), e32572 (2012).
  14. Indra, I., Undyala, V., Kandow, C., Thirumurthi, U., Dembo, M., Beningo, K. A. An in vitro correlation of mechanical forces and metastatic capacity. Phys. Biol. 8, (1), (2011).
  15. Alge, C. S., Hauck, S. M., Priglinger, S. G., Kampik, A., Ueffing, M. Differential protein profiling of primary versus immortalized human RPE cells identifies expression patterns associated with cytoskeletal remodeling and cell survival. J. Proteome Res. 5, (4), 862-878 (2006).
  16. Oikonomou, E., Kothonidis, K., Zografos, G., Nasioulas, G., Andera, L., Pintzas, A. Newly established tumourigenic primary human colon cancer cell lines are sensitive to TRAIL-induced apoptosis in vitro and in vivo. Br. J. Cancer. 97, (1), 73-84 (2007).
  17. Knoll, S. G., Ali, M. Y., Saif, M. T. A. A novel method for localizing reporter fluorescent beads near the cell culture surface for traction force microscopy. J. Vis. Exp. (91), (2014).
  18. Wang, Y. L., Pelham, R. Preparation of a flexible, porous polyacrylamide substrate for mechanical studies of cultured cells. Methods in Enzymology. 298, 489-496 (1998).
  19. Tang, X., Ali, M. Y., Saif, M. T. A. A novel technique for micro-patterning proteins and cells on polyacrylamide gels. Soft Matter. 8, 3197-3206 (2012).
  20. Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties. Current Protocols in Cell Biology. 10-16 (2010).
  21. Tseng, Q., et al. Spatial organization of the extracellular matrix regulates cell–cell junction positioning. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, (5), 1506-1511 (2012).
  22. Chopra, A., et al. Augmentation of integrin-mediated mechanotransduction by hyaluronic acid. Biomaterials. 35, (1), 71-82 (2014).
  23. Damljanovic, V., Lagerholm, B. C., Jacobson, K. Bulk and micropatterned conjugation of extracellular matrix proteins to characterized polyacrylamide substrates for cell mechanotransduction assays. Biotechniques. 39, (6), 847-851 (2005).
  24. Tilghman, R. W., et al. Matrix rigidity regulates cancer cell growth and cellular phenotype. PLoS ONE. 5, (9), e12905 (2010).
  25. Ulrich, T. A., de Juan Pardo, E. M., Kumar, S. The mechanical rigidity of the extracellular matrix regulates the structure, motility, and proliferation of glioma cells. Cancer Res. 69, 4167-4174 (2009).
  26. Williams, B. J., Anand, S. V., Rajagopalan, J., Saif, M. T. A. A self-propelled biohybrid swimmer at low Reynolds number. Nat. Commun. 5, (2014).
בידוד של תאי גידול במעי גס אנושיים ראשוניים מרקמות כירורגי וCulturing אותם ישירות על מצעים אלסטיים רכים לגרירה Cytometry
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ali, M. Y., Anand, S. V., Tangella, K., Ramkumar, D., Saif, T. A. Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry. J. Vis. Exp. (100), e52532, doi:10.3791/52532 (2015).More

Ali, M. Y., Anand, S. V., Tangella, K., Ramkumar, D., Saif, T. A. Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry. J. Vis. Exp. (100), e52532, doi:10.3791/52532 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter