Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Isolering av primära humana kolontumörceller från kirurgiska vävnader och Odling dem direkt på mjuka elastiska substrat för Traction Cytometry

doi: 10.3791/52532 Published: June 4, 2015

Abstract

Cancerceller svarar på matris mekanisk styvhet på ett komplext sätt med användning av en samordnad, hierarkisk mekano-kemiskt system som består av adhesionsreceptorer och associerade signaltransduktion membranproteiner, cytoskelettala arkitektur och molekylmotorer 1, 2. Mechanosensitivity av olika cancerceller in vitro är undersökas i första hand med odödliggjorda cellinjer eller murina härledd galvaniska element, inte med primära humana cancerceller. Därför lite är känt om mechanosensitivity av primära humana koloncancerceller in vitro. Här är ett optimerat protokoll som utvecklats som beskriver isolering av primära humana kolonceller från friska och cancer kirurgiska mänskliga vävnadsprover. Isolerade kolon celler är sedan framgångsrikt odlas på mjuka (2 kPa styvhet) och stel (10 kPa styvhet) polyakrylamid hydrogeler och styv polystyren (~ 3,6 GPa styvhet) substrat funktionaliserade med en extracellulär matris (fibronektinI det här fallet). Fluorescerande mikropärlor är inbäddade i mjuka geler nära cellodlingsytan, och dragkraft analysen utförs för att bedöma cellulära sammandragande påkänningar som använder fri öppen tillgång programvara. Dessutom immunofluorescensmikroskopi på olika styvhet substrat ger värdefull information om primär cell morfologi, cytoskelett organisation och vinkulin innehåller fokala kontakter som en funktion av substrat styvhet.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

På senare år har det blivit allt tydligare att mekanisk mikromiljö, förutom bio-kemiska faktorer, spelar en viktig roll vid reglering cell funktionaliteter. Celler kan känna och svara på substratet styvhet som de följs (som i 2D kultur) eller omges av (som i 3D kultur) 3-7. Genom att göra så, kan celler modulera deras differentiering 3, morfologi 4, migration / rörlighet 5, bio-fysiska egenskaper 6, tillväxt 7, och andra processer.

Cancerceller reagerar också till 2D och 3D matrix styvhet med hjälp av en samordnad, hierarkisk mekano-kemisk kombination av vidhäftningsreceptorer och tillhörande signaltransduktion membranproteiner, cytoskelettala arkitektur och molekylära motorer 1, 2. Till exempel bröst epitelceller (MEC) bilda normala acinar parenkymet Vid odling på 150 Pa-substrat som liknar styvhetenfriska bröstvävnad. Intressant, de uppvisar kännetecknen för ett utvecklings tumör, både strukturella och transkription, när odlade på styvare substrat (> 5000 Pa) som efterliknar styvheten hos ett tumörstroma 8. Dessutom visar ett annat experiment att brösttumörgenes åtföljs av kollagentvärbindning och ECM förstyvande 9. Nya experiment visar att human koloncancer (HCT-8) celler visar metastaser som fenotyp (MLP) när de odlas på 2D-substrat med fysiologiskt relevant styvhet (20-47 kPa), men inte på mycket hård (3,6 GPa) substrat 10- 12 .Dessa cellerna först bildar tumörliknande cellkluster och dissocierar sedan från varandra, utgående från periferin. Eftersom denna epitelial till rundade morfologiska (E R övergång) förändring sker, de förökar sig, minska cell-cell och cell-ECM vidhäftning och bli vandrande. HCT-8-celler odlas på mycket hårda polystyren substrat inte uppvisar dessamaligna egenskaper. Sålunda har en hypotes om att HCT-8 celler blir metastatisk på grund av deras exponering för lämplig mikromiljö. Det är värt att notera att dessa experiment utförs med odödliga cancercellinjer eller murina härledd galvaniska element, inte med primära humana cancerceller.

En nyligen genomförd studie föreslår att förstärkt cellulär dragkraft stress kan användas som en potentiell biofysikalisk signatur för metastaserande celler 13 .Det studie innebär att mäta dragkraft för olika humana cancercellinjer på polyakrylamidgeler. Man har funnit att metastatiska cancerceller kan utöva signifikant högre dragkraft spänning jämfört med icke-metastatiska celler i samtliga fall 13. Men dessa resultat direkt motsäger tidigare avgöranden som offentliggörs på murina härledd bröstcancercellinjer 14. Även en ny studie belyser anmärkningsvärda skillnader mellan immortaliserade och primära humana celler i deras cytoskeletal ombyggnad protein profilering och cellöverlevnad proteinuttryck 15. Därför är det viktigt att se över många av de biofysikaliska tester inkluderande dragkraft för primära humana cancerceller. Detta kommer att ta upp frågan om de primära cellerna rekapitulera immortaliserad cancercellinjer dragkraft trend.

Protokollet som beskrivs här är optimerad för isolering av primära humana kolonceller (både friska och cancer), och för att odla dem på mjuka substrat (polyakrylamid hydrogeler) samt på petriskålar. Protokollet är baserat på matsmältningen och därav enzymatisk dissociation av kirurgiska vävnadsprov in i enkelcellsuspension 16. Såvitt vi vet är detta den första demonstrationen att odla isolerade primära kolontumör och normala celler direkt på mjuka hydrogel substrat med inbäddade fluorescerande mikrokulor för dragkraft Cytometry. Transparent gel substrat också tillåta immunfärgning. Denna analys visade skillnader i F-aktin organisation ochfokala sammanväxningar i primära humana kolonceller som substrat stelhet förändringar. Denna cellodlings plattform öppnar upp möjligheten att utforska olika biofysiska egenskaper hos primära humana celler såsom cell styvhet och dragkraft som parametrar för cancer prognostik.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Protokollet som beskrivs nedan följer riktlinjerna i UIUC mänskliga forskningsetisk kommitté.

1. Insamling och Nedbrytning av kirurgiska Tissue Prov

  1. Samla prov tumörvävnaden direkt efter kolon resektion (Figur 1A och 1B). Samla vävnad från en intilliggande frisk webbplats.
  2. Överför vävnaden omedelbart till en 15 ml injektionsflaska innehåller 12 ml HBSS lösning. Förvara injektionsflaskan på is inuti en isolerad skum låda.
  3. Transportera flaskan vävnad som innehåller en vävnadsodling huva för vidare bearbetning inom 45 minuter. Förvara injektionsflaskan på ett isblock inuti huven.
  4. Häll den medföljande vävnaden i en 6 brunnar innehållande 6-7 ml HBSS lösningen med en pipett.
    Obs: Mängden vävnad per brunn är inte kritisk i detta sköljningssteg.
  5. Håll 6 brunnar på ett isblock. Skölj vävnaden i HBSS lösning två gånger.
  6. Skär vävnad rent i avskilda delar med sterila SCIsor. Färs vävnad i mindre sektioner som inte är större än 1-2 mm 3 i storlek med en steril skalpell blad.
  7. Väg en märkt 0,1% trypsin ampull (innehållande 1 ml av 0,1% trypsinlösning) före överföringen vävnaden. Överför ~ 20 mg vävnad i vardera av 0,1% trypsin injektionsflaskor med en pipett.
  8. Försök att minimera överföringen av HBSS i trypsin flaskan för att undvika ytterligare utspädning av trypsin.
  9. Väg trypsin flaskorna efter vävnadsöverföring; dokumentera skillnaden som vävnadsmassan.
  10. Häll ~ 20 mg vävnad och en ml trypsin till varje brunn i en 24 brunnars platta.
  11. Sätt 24 brunnar på skakanordning i kylskåp vid 4 ° C under 16-20 h. Under denna väntetid eller vid ett tidigare tillfälle, förbereda polyakrylamidgel substrat och funktionalisera dem med ECM-proteiner som beskrivs i avsnitt 3.

2. Enzymatisk Dissociation av vävnadsprovet i encellssuspension och odling isolerade celler på ECM funktionaliserad Elastic Substrates och Styva Polystyren Rätter

  1. Efter 16-20 h av inkubering i trypsin brunn vid 4 ° C på skak, överföra vävnad från 4 ° C trypsin till 4 ° C komplett tillväxtmedier ampull (innehållande 2-3 ml fullständigt tillväxtmedium) med hjälp av en pipett. Se minimal överföring av trypsin i tillväxtmedier.
    Anm: Komplett tillväxtmedia formulering är som följer: RPMI 1640 basmedium kompletterat med hästserum till en slutlig koncentration av 10% och penicillin-streptomycin till en% av totala lösningen.
  2. Placera vävnaden innehållande medie flaskan i ett varmvattenbad vid 37 ° C under 12-15 minuter.
  3. Överför vävnaden till en 15 ml flaska innehållande HBSS lösningen med en pipett, skaka försiktigt.
  4. Upprepa 2.3.
  5. Ta bort vävnad från HBSS lösning och transfer till 0,1% kollagenas lösning (i HBSS) flaska innehållande 1 ml lösning. Inkubera under 45 minuter vid 37 ° C och 5% CO2 miljö i en fuktad cellodlingsinkubator. Under vänteperiod, varm growth media i en 15 ml flaska vid 37 ° C i vattenbad.
  6. Dra ut alla vävnadsfragment till pipett minimera kollagenas överföring. Mata ut bara de vävnadsfragment till förvärmda odlingsmedier flaskor.
  7. Placera en 40 | im väl insatsfilter i varje brunn i en 6-brunnsplatta. Fukta filtret med 1 ml cellkulturmedium.
  8. Finfördela vävnad i media med en 10 ml glaspipett flera gånger tills vävnaden är helt dissocierad.
  9. Bibehåll pipettspetsen så nära som möjligt till basen på flaskan.
  10. Deponera lösningen på filtret för att avlägsna skräp och icke dissocierade delar.
  11. Centrifugera filtrerade cellsuspension i medium vid 150 xg under 5 min vid RT.
  12. Avlägsna supernatanten efteråt och resuspendera cellpelleten med 2 ml färsk odlingsmedia.
  13. Räkna cellerna med användning av en hemocytometer (vid behov). Seed isolerade primära celler på extracellulära matrix (ECM) funktionaliserade geler och polystyren rätter på önskad koncentration.

3. Upprättande och funktionalisering av olika styvhet Polyakrylamid (PA) Gel och polystyren substrat

Obs: För visuell demonstration i avsnitt 3, tittarna / läsarna hänvisas till en färsk Journal of Visualized Experiments (JUPITER) artikel 17.

  1. Antagande publicerade protokoll 18, 19, aktiverar 12 mm 2 glas täckglas kemiskt för att säkerställa kovalent bindning av hydrogelen.
    1. Först glider behandla glaskupa med 3- Aminopropyltrymethoxysilane (ATS) under 7 min vid RT.
    2. Avlägsna ATS fullständigt med avjoniserat vatten skölja och behandla täckglas med 0,5% glutaraldehyd (utspädd i PBS från 70% Glutaraldehyd stamlösning) lösning under 30 min.
  2. Skaffa 2 kPa gellösningar genom att blanda 5% vikt / volym lösning akrylamid och 0,05% N, N '-methylenebisacrylamide (bis) lösning i 10 mM HEPES-buffrad saltlösning 20. Använd 8% vikt / volym akrylamid och 0,13% N, N '-methylenebisacrylamide (bis) lösning i 10 mM HEPES-buffrad saltlösning för 10 kPa-gel 20.
    1. I båda fallen använder en: 200 ammoniumpersulfat (10% vikt / volym) och 1: 2000-N, N, N ', N' tetrametyletylendiamin (TEMED) som initiator och katalysator för polymerisationen processen, respektive.
    2. Dessutom, tillsätt 100 l fluorescerande pärlor till 2 kPa gellösningen som förvaltnings markörer 21, 22.
  3. Sätt in en droppe av 20 ul pre-polymer PA gellösningen på 12 mm 2 aktiverat glas täckglas. Placera en 12 mm 2 vanligt glas täckglas på drop. Se till att nedgången sprider sig mellan täckglas på grund av kapillärkraften. Vänd smörgås för 2 kPa geler för att säkerställa att de flesta av pärlorna kommer nära cellodlingsytan.
  4. Cure PA gel för 45 min vid RT.
  5. Skala bort locket glida med hjälp av en enda kant rakkniv.
    Obs: Under peeling, fortsätter lossnar från en kantav smörgås. Gelén förblir vidhäftande till den aktiverade glasskiva.
  6. Förvara geler i PBS-lösning före användning.
  7. Funktionalisera PA geler och glas med ECM-molekyler, humant fibronektin vid en koncentration av 50 | ig / ml efter publicerade metoder 23.
    1. I korthet, inkubera substrat med 2 ml ren hydrazinhydrat O / N.
    2. Ta hydrazinhydrat och skölj substraten noggrant med avjoniserat vatten.
    3. Tvätta substrat med 5% ättiksyra under 30 minuter.
    4. Avlägsna ättiksyra och skölj substraten noggrant med avjoniserat vatten.
    5. Håll substraten nedsänkta i avjoniserat vatten under 30 minuter.
    6. Inkubera substrat med oxiderad fibronektin för 35 minuter vid en koncentration av 50 pg / ml.
    7. Skölj substraten med PBS på skak vid låga varvtal under 10 min.
    8. Inkubera alla underlag vid 37 ° C i 2-3 ml odlingsmedier för 30 minuter innan plätering cellerna.
      Obs: Plate celler i en glest populated sätt (1000-3000 celler / cm 2). Varje gel-täckta glas glidning måste finnas i ett 35 mm petriskål. Låt cellerna att vidhäfta fullständigt innan någon mikroskopi (åtminstone O / N).

4. Dragkraft Mikroskopi och immunofluorescensmikroskopi Analyser

  1. Traction Force Microscopy analys
    1. Varm 0,25% trypsin-EDTA / 10% SDS-lösning vid 37 ° C i vattenbad under 10 minuter innan dragexperiment starta.
    2. Ta en gel från cellodlings inkubator vid en tid och plats på den fluorescerande inverterat mikroskop skede (32X förstoring).
    3. Hitta en enda cell i synfältet. Ta skålen locket Petri.
    4. Ta en faskontrastbild av cellen (t.ex. Figur 3).
    5. Växla bildläge till fluorescens och välja lämpligt filter. Inte flytta mikroskop scenen eller prov under denna tid.
    6. Ta en bild av fluorescerande kulor displaced av cellulär dragkraft (Figur 4C).
    7. Tillsätt 1 ml trypsin / SDS-lösning till petriskål för att lösgöra cellen från gelén. Inte flytta mikroskop scenen eller prov under denna tid. Ta också en styrbild av cellen för att säkerställa fullständigt avlägsnande från gel.
    8. Ta ett referens (nollkraft) bild av pärlorna efter elementet avlägsnas.
    9. Upprepa steg 4.1.2-4.1.8 för alla andra geler.
    10. Gör en bildstapel med ImageJ från de två bilderna som förvärvats i steg 4.1.6 och 4.1.8 i varje enskilt fall. För att generera bildstapel, använd följande sekvens av kommandon i ImageJ efter att ha öppnat bilderna: Bild → Stacks → bilder att stapla.
    11. För att erhålla förskjutningsfältet och dragkraft, använda ImageJ plugins efter publicerade metoder 21, 22 Skaffa koder och detaljerade tutorials för dessa plugins som använder följande länk:. https://sites.google.com/site/qingzongtseng/imagejplugins.
      1. Passa bilderna i stapeln med hjälp av "Mall Matching" plugin. Använd följande sekvens av kommandon i ImageJ efter att ha öppnat bildstapel som genereras i steg 4.1.10: Plugins → Mall Matching → Justera skivor i Stack → OK. Spara bilden stacken följaktligen. Använd denna nya bildstapel i följande steg.
      2. Skaffa förskjutningsfältet med PIV (Particle Image Velocimetry) plugin (Figur 4D). Använd följande sekvens av kommandon efter att ha öppnat bildstapel sparade i steg 4.1.11.1: Plugins → PIV → Iterativ PIV (Basic) → OK → Acceptera detta PIV och utgång → Ok. Spara PIV produktionen i samma katalog som i den ursprungliga bilden stacken. Använd denna som input i nästa steg.
      3. Slutligen använder FTTC (Fouriertransformen dragkraft cytometri) plugin för att få drag karta (Figur 4E). Använd följande sekvens av kommandon: Plugins → FTTC → InsERT materialegenskaper, dvs Youngs modul och Poissons tal av PA gel → OK → Välj PIV utdatafilen sparade i steg 4.1.11.2 → OK. Spara FTTC resulterar i samma katalog som i bildstapel och PIV utgång.
  2. Immunofluorescensmikroskopi Analyser
    1. Ta de substrat som skall immunostained till laminärt huven och avlägsna odlingsmedia.
    2. Skölj substraten med PBS och fixera cellerna med 4% paraformaldehyd i PBS under 20 min vid RT.
    3. Tvätta substraten med PBS under 3 gånger (5 min varje gång). Följaktligen inkubera substraten med 500 | j, l signalförstärkare för 30 minuter och skölj med PBS.
    4. Inkubera cellerna med monoklonal anti-vinkulin antikropp vid en 1: 250 spädning i PBS under 45 min vid RT. Tvätta substraten med PBS under 3 gånger (5 min varje gång).
    5. Inkubera proverna med sekundär antikropp Alexa Fluor 488 get-anti-mus-IgG vid en 1: 200 utspädningi PBS vid RT under 30 minuter. Tvätta substraten med PBS under 3 gånger (5 min varje gång).
    6. För att visualisera den F-aktin struktur, inkubera celler med TRITC falloidin konjugat vid en koncentration 50 | ig / ml under 45 min vid RT. Tvätta substraten med PBS under 3 gånger (5 min varje gång).
    7. Bild proverna med hjälp av konfokal scanning lasermikroskop (Figur 5A - 5D).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Protokollet som beskrivs ovan används framgångsrikt för multipla vävnadsprover (n = 12) från fyra olika patienter enligt riktlinjer från Institutional Review Board. Figur 1A visar en representativ kolorektal tumör direkt efter operationen från vilket sektioner för cellkulturer vävnads erhålles. En typisk vävnadssektion i HBSS-lösning efter överföring till den laminära huven för vidare behandling visas i figur 1B. En schematisk bild av spjälkning och enzymatisk dissociation av kirurgiska vävnadsprov in i enkelcellsuspension är visad i figur 2.

Efter en lyckad vävnadsdissociering är isolerade primära humana celler seedade på PA geler och polystyren rätter. Faskontrast-mikrofotografier (fig 3a och 3b) illustrerar representativ morfologi av primär human koloncancer och normala celler som en funktion av substrat styvhet. Det är uppenbart attprimära kolonceller (både friska och cancer) sprida mer på polystyren rätter jämfört med PA geler (figur 3A och 3B).

Traktions analyser utförs om ECM (fibronektin) belagda mjuka 2 kPa geler efter bekräftelse av invasiv adenocarcinom från patologisk H & E-färgning (fig 4A). PA geler likformigt belagda med fibronektin, som visas i figur 4B. För att underlätta jämförelse bör alla drag experiment för tumör och friska kolonceller utföras samtidigt. Fig 4C visar en ögonblicksbild av de nanoskala fluorescerande pärlor inbäddade inuti gelén. Från fördrivna och referens pärla bilder, förskjutningsfält som erhålls med hjälp av ImageJ PIV plugin 21, 22. Ett representativt pärla förskjutning fält som genereras av invasiva kolontumörceller på 2 kPa gel visas i figur 4D. Figur 4E visar drag stress erhållits med ImageJ FTTC plugin motsvarande förskjutningsfältet i figur 4D 21, 22.

Figur 5 visar F-aktin och vinkulin innehållande fokala kontakter av primära humana kolonceller på mjuka 2 kPa geler och styva polystyren substrat. Ingen aktin fibern var närvarande i de mindre spridda celler på mjuka geler (figur 5A1 - 5A2). Punktat vinkulin innehåller fokala kontakter finns på mjuka geler (figur 5B1 - 5B2). Omvänt, primära celler visar väl spridda morfologi, väldefinierade aktin spännings fibrer och diskreta avlånga fokala kontakter på styva polystyren substrat (figur 5C - 5D).

Figur 1
Figur 1. (A) Tumör efter kolon resektion. (B) Vävnadssnitt från tumören för cellisolering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2
Figur 2. Schematisk av matsmältning och enzymatisk dissociation av kirurgiskt vävnadsprov till en enda cell suspension. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. Framgångsrika primära humana koloncellkultur (både cancer och normala) på olika styvhet geler och polystyren maträtt. Faskontrast bilder visar tyPical morfologi (A) Tumörceller och (B) Normala celler på olika styvhet substrat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4
Figur 4. (A) H & E-färgning bekräftar invasiv adenocarcinom. (B) Fibronektin färgning avslöjar att geler är likformigt belagda med ECM-molekyler. (C) Nanoscale pärlor inbäddade inuti gel såsom förvaltnings markörer. (D) representant förskjutning som alstras av tumörcell på mjuk PA under användning PIV plugin i ImageJ som beskrivs i 4.1.11.2. (E) Traction stressen utövas av tumörcell på mjuk gel motsvarande förskjutningsfältet i (D) som erhållits via FTTC plugg ii ImageJ som beskrivs i 4.1.11.3. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5
Figur 5. Immunofluorescerande färgning av F-aktin och vinkulin på mjuk gel och hårda polystyren substrat. Ingen aktin fibern var närvarande i mindre spridning (A1) tumörcell eller (A2) normal cell på mjuka 2 kPa geler. Punktat vinkulin innehåller fokala kontakter finns på mjuka geler (B1 - B2). Omvänt, primära celler visar väl spridda morfologi, väldefinierade aktin spänningsfibrer (C1 - C2) och diskreta långsträckta fokala sammanväxningar (D1 - D2) på styva polystyren substrat.2 / 52532fig5large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Cellular dragkraft stress har nyligen dykt upp som en potentiell biofysikalisk indikator av metastaserad staten 13. Det finns dock inga experimentella dragkraft data med primärtumörceller i litteraturen hittills. Dessutom är direkt odling isolerade primära kolon celler på olika styvhet polyakrylamidgeler inte rapporterats ännu. Därför etablerar vi en optimerad primära kolon cellodlingsbetingelser på geler och polystyren (Figur 2). Fluorescerande mikropärlor inkapsling nära cellodlingsytan under mjuk gelpreparat möjliggör mätning av förskjutningsfältet och dragkraft som genereras av primära humana celler (Figur 4C, 4D och 4E). Dessutom kan immunofluorescens analyser ger viktig information om cytoskelettet organisation och fokala sammanväxningar som substrat stelhet förändringar (Figur 5A - 5D). Observera att olika cancer och normal odödliggjord celllinjer också visar förstärkt spridning, aktin stressen bunt bildning och mogna avlånga fokala kontakter med ökad substrat styvhet 4, 24-25.

Protokollet kan lätt antas / modifierad för isolering av primära celler från kirurgiska vävnader av olika mänskliga organ eller andra djur. Inkubationstiden av vävnad i dissociation agenter - trypsin och kollagenas - måste optimeras empiriskt för varje tillämpning. Dessutom är filterstorlek för att ta bort skräp och icke dissocierade vävnads delar också en viktig parameter för att välja baserat på förväntad maximal cellstorlek i viloläge (40 nm i detta protokoll).

En begränsning av metoden är att några mjuka geler kan sakna konsekvent lokalisering av fluorescerande pärlor i närheten av cellodlingsytan (avsnitt 3.3) som kan inverka menligt följande dragkraft cytometry mätningar (avsnitt 4.1). Detta kan lätt kringgås genom att undersökagelytan för pärla densitet och distribution via fluorescensmikroskopi innan cellodling. Följaktligen kan geler med relativt icke-homogen pärla distributionskasseras. Ett annat tillvägagångssätt är att använda en nyligen föreslagen metod som tillåter exakt lokalisering av pärlorna nära cellodlingsytan 17.

Försiktighet bör vidtas för att börja bearbeta de kirurgiska prover så snart de tas emot, företrädesvis inom 45 minuter. Det mest kritiska steget i protokollet är den optimala exponeringstiden för vävnaden i trypsin och kollagenaslösning för att uppnå isoleringsutbytet, men behåller tillräcklig cellviabilitet. Innan odling av cellerna på mjuka hydrogel, behöver pärla densitet och distribution som ska bekräftas med hjälp av fluorescerande mikroskopi. Dessutom måste en nollkraft bild som ska förvärvas efter att ha bekräftat att cellen är helt fristående från gelytan.

Sammanfattningsvis är ett protokoll beskrivs som återtat skiljas enskilda celler avstängning från kirurgisk cancer / normal vävnadsprov. Denna isolering av enskilda primära tumörceller från kirurgiska prover följt av deras kultur på mjuka och hårda underlag tillåter olika nedströms biofysiska mätningar, till exempel cell styvhet med hjälp av AFM, intracellulär reologi använder mikroinjicerade partiklar, cellmigration / rörlighet, och vesikler dynamiken analys. Dessa mätningar kan användas för cancer prognos. Protokollet har med framgång använts för utvinning och kultur murina hjärtmuskelceller och 26. Den metod som presenteras här kan användas för att isolera primära humana celler från kirurgiska vävnader i olika organ och till kultur dem direkt på olika styvhet substrat för mechanobiology studier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
HBSS Life technologies 14175-095
PBS Lonza 17-516F
Trypsin Worthington LS003736
Collagenese Worthington LS004176
3- Aminopropyltrymethoxysilane (ATS)  Sigma-Aldrich 281778
Glutaraldehyde Polysciences, Inc. 01201-5
Acrylamide Sigma-Aldrich A4058
N-methylenebisacrylamide (bis) Sigma-Aldrich M1533
HEPES buffer solution Sigma-Aldrich 83264
Ammonium persulfate Bio-Rad 161-0700
Human fibronectin BD biosciences 354008
Hydrazine hydrate Sigma-Aldrich 18412 Hazardous
Acetic acid Sigma-Aldrich A6283
Paraformaldehyde  Electron Microscopy Sciences RT15710
Signal enhancer Life technologies I36933
Monoclonal anti vinculin antibody  Sigma-Aldrich V9131
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG Life technologies A11001
TRITC phalloidin conjugates  Sigma-Aldrich P1951
0.1 µm fluroscent beads Life technologies F8801
0.25% Trypsin-EDTA Life technologies 25200-056
Materials
12 mm2 glass cover slips Corning 2865-12

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ingber, D. E. Can cancer be reversed by engineering the tumor microenvironment. Semin. Cancer Biol. 18, 356-364 (2008).
  2. Kumar, S., Weaver, V. M. Mechanics, malignancy, metastasis: the force journey of a tumor cell. Cancer Metastasis Rev. 28, 113-127 (2009).
  3. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
  4. Yeung, T., et al. Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion. Cell Motil. Cytoskeleton. 60, 24-34 (2005).
  5. Pelham, R. J., Wang, Y. L. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, (25), 3661-3665 (1997).
  6. Solon, J., Levental, I., Sengupta, K., Georges, P. C., Janmey, P. A. Fibroblast adaptation and stiffness matching to soft elastic substrates. Biophys. J. 93, 4453-4461 (2007).
  7. Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. Substrate flexibility regulates growth and apoptosis of normal but not transformed cells. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 279, 1345-1350 (2000).
  8. Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).
  9. Levental, K. R., et al. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell. 139, 891-906 (2009).
  10. Tang, X., et al. Mechanical force affects expression of an in vitro metastasis-like phenotype in HCT-8 cells. Biophys. J. 99, 2460-2469 (2010).
  11. Ali, M. Y., Saif, M. T. A. Substrate Stiffness Mediated Metastasis Like Phenotype of Colon Cancer Cells is Independent of Cell to Gel Adhesion. Cell. Mol. Bioeng. (2014).
  12. Ali, M. Y., Chuang, C. Y., Saif, M. T. A. Reprogramming cellular phenotype by soft collagen gels. Soft Matter. (2014).
  13. Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential. PLoS ONE. 7, (2), e32572 (2012).
  14. Indra, I., Undyala, V., Kandow, C., Thirumurthi, U., Dembo, M., Beningo, K. A. An in vitro correlation of mechanical forces and metastatic capacity. Phys. Biol. 8, (1), (2011).
  15. Alge, C. S., Hauck, S. M., Priglinger, S. G., Kampik, A., Ueffing, M. Differential protein profiling of primary versus immortalized human RPE cells identifies expression patterns associated with cytoskeletal remodeling and cell survival. J. Proteome Res. 5, (4), 862-878 (2006).
  16. Oikonomou, E., Kothonidis, K., Zografos, G., Nasioulas, G., Andera, L., Pintzas, A. Newly established tumourigenic primary human colon cancer cell lines are sensitive to TRAIL-induced apoptosis in vitro and in vivo. Br. J. Cancer. 97, (1), 73-84 (2007).
  17. Knoll, S. G., Ali, M. Y., Saif, M. T. A. A novel method for localizing reporter fluorescent beads near the cell culture surface for traction force microscopy. J. Vis. Exp. (91), (2014).
  18. Wang, Y. L., Pelham, R. Preparation of a flexible, porous polyacrylamide substrate for mechanical studies of cultured cells. Methods in Enzymology. 298, 489-496 (1998).
  19. Tang, X., Ali, M. Y., Saif, M. T. A. A novel technique for micro-patterning proteins and cells on polyacrylamide gels. Soft Matter. 8, 3197-3206 (2012).
  20. Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties. Current Protocols in Cell Biology. 10-16 (2010).
  21. Tseng, Q., et al. Spatial organization of the extracellular matrix regulates cell–cell junction positioning. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, (5), 1506-1511 (2012).
  22. Chopra, A., et al. Augmentation of integrin-mediated mechanotransduction by hyaluronic acid. Biomaterials. 35, (1), 71-82 (2014).
  23. Damljanovic, V., Lagerholm, B. C., Jacobson, K. Bulk and micropatterned conjugation of extracellular matrix proteins to characterized polyacrylamide substrates for cell mechanotransduction assays. Biotechniques. 39, (6), 847-851 (2005).
  24. Tilghman, R. W., et al. Matrix rigidity regulates cancer cell growth and cellular phenotype. PLoS ONE. 5, (9), e12905 (2010).
  25. Ulrich, T. A., de Juan Pardo, E. M., Kumar, S. The mechanical rigidity of the extracellular matrix regulates the structure, motility, and proliferation of glioma cells. Cancer Res. 69, 4167-4174 (2009).
  26. Williams, B. J., Anand, S. V., Rajagopalan, J., Saif, M. T. A. A self-propelled biohybrid swimmer at low Reynolds number. Nat. Commun. 5, (2014).
Isolering av primära humana kolontumörceller från kirurgiska vävnader och Odling dem direkt på mjuka elastiska substrat för Traction Cytometry
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ali, M. Y., Anand, S. V., Tangella, K., Ramkumar, D., Saif, T. A. Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry. J. Vis. Exp. (100), e52532, doi:10.3791/52532 (2015).More

Ali, M. Y., Anand, S. V., Tangella, K., Ramkumar, D., Saif, T. A. Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry. J. Vis. Exp. (100), e52532, doi:10.3791/52532 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter