Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

דור יעיל של כתבים במכות ספציפיים Lineage hiPSC עצבי באמצעות CRISPR / Cas9 ומערכת Nickase זוגי Cas9

doi: 10.3791/52539 Published: May 28, 2015
*1,2, *1,2, 1,2,5, 1,2,6, 1,2,4,7, 1,2,3
* These authors contributed equally

Abstract

מיקוד גן הוא גישה ביקורתית לאפיון פונקציות גן במחקר הביו-רפואי מודרני. עם זאת, היעילות של גן המיקוד בתאים אנושיים הייתה נמוכה, המונעת את הדור של שורות תאים אנושיות בקצב רצוי. בשנתיים האחרונות היינו עדים להתקדמות מהירה בשיפור היעילות של מניפולציה גנטית על ידי כלי עריכת הגנום כגון מערכת / קאש (הקשורים CRISPR) CRISPR (אשכולות באופן קבוע Interspaced חזרות Palindromic קצרה). כתב יד זה מתאר פרוטוקול להפקת כתבי שושלת ספציפיים בתאי גזע אנושיים pluripotent מושרה (hiPSC) באמצעות מערכת CRISPR / קאש סייעה רקומבינציה ההומולוגית. הליכים לקבלת רכיבים דרושים להכנת קווי כתב שושלת עצביים באמצעות CRISPR / מערכת קאש, תוך התמקדות בבנייה של וקטורי מיקוד וRNAs מדריך היחיד, מתוארים. פרוטוקול זה יכול להתארך עד הקמת פלטפורמה ותיקון מוטציה בhiPSCs.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

CRISPR (אשכולות באופן קבוע Interspaced חזרות Palindromic קצרה) / קאש מערכת (הקשורים CRISPR), יחד עם כלי עריכת הגנום אחרים, יש מהפכה במניפולצית הגנום האנושית בשנים האחרונות 1-7. מרכיבים עיקריים במערכת / Cas9 CRISPR הם RNA מדריך יחיד (sgRNA) וCas9. Cas9 הוא הסוג השני endonuclease DNA מודרך RNA. יש לו שני תחומים nuclease, האמפ וRuvC, אשר אחראים על ביצוע הפסקות גדילי דנ"א כפולים (DSBs) באזור גנומי ספציפי ליד מוטיב סמוך protospacer יש (PAM) 7-10 .An sgRNA פונקציה משולבת של זה של crRNA וtracrRNA, שתי מולקולות RNA הסתגלות חסינות שזוהו בחיידקים (כגון סטרפטוקוקוס pyogenes) וחיידקים קדומים להילחם נגד פלישת DNA של מקורות אקסוגניים 9-11. כאשר תוכנן כראוי ושיתוף הציג לתאי יונקים, sgRNA מכיר את רצף PAM, בסיס-זוגות עם הגדיל המשלים של ה- DNA היעד, ומדריכים וtransactivates Cas9 לדבוקבשני גדילי הדנ"א באופן מיידי במעלה הזרם של 7 PAM. בהמשך לכך, בבימויו הומולוגי רקומבינציה (HDR, בנוכחותו של וקטור מיקוד) או בסוף שאינו הומולוגי שהצטרף (NHEJ) יתרחש לתקן DSBs. Transgenes כגון cDNAs, קלטות כתב, או שברים עמידים לאנטיביוטיקה יכול להיות משולב, וקווים מהונדסים או להתרפק עשו.

למרות שהמערכה / Cas9 CRISPR היא יעילה ביותר ויחסית ספציפית, לא רצויה דווחו פעילויות מחוץ יעד 12-15. כדי למזער את האירועים מחוץ היעד, nickases Cas9 (Cas9n) יש גם מהונדס 9,10,14,16,17. Cas9n (D10A Cas9 או Cas9 H840A) הוא אנזים Cas9 עם מוטציות באחד משני תחומים nuclease, שמעורר רק ניק בגדיל אחד של DNA. כדי להשיג מחשוף בשני הגדילים, שתי sgRNAs נועד להדריך את זוג nickases, אשר חותך בנפרד בלוקוסים סמוכים של שני גדילי דנ"א שונים. האסטרטגיה "nicking הכפול" דורשת מורעיצוב דואר מחמיר יותר מאשר פלטפורמת Cas9 הקונבנציונלית, ומציע גם יעילות גבוהה וסגוליים גבוהות לניסויי עריכת גן.

כתב יד זה מתאר פרוטוקול להפקת כתב שושלת ספציפי בתאי גזע אנושיים pluripotent מושרה (hiPSC) באמצעות מערכת CRISPR / קאש סייעה רקומבינציה ההומולוגית. צעדים להשגת הרכיבים הדרושים להכנת קווי כתב שושלת עצבית באמצעות CRISPR / עריכת הגנום מערכת תיווך קאש מתוארות, עם דגש על הבנייה של וקטורי מיקוד וsgRNAs. פרוטוקול זה כבר חזר בהצלחה בשורות hiPSC מרובות כוללים אלה נגזרים מאנשים בריאים ומחולים במחלות של מערכת העצבים המרכזית. גנים ממוקדים במעבדה שלנו כוללים OLIG2, HB9 (MNX1), NEUROG2, SOX1, ALDH1L1 וSOD1. מיקוד יעילות מCRISPR מערכת / קאש בתיווך רקומבינציה ההומולוגית בhiPSCs נע בין 20-40%, אשר עולה בקנה אחד עם דיווחים קודמים 1,18,19. בהשוואה לtypicaיעילות l של 1-2% בניסויי גן המיקוד קונבנציונליים, יעילות המיקוד משופרת באופן משמעותי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pStart-K Addgene 20346
pWS-TK6  Addgene 20350
pKD3  Addgene 45604
pKD46 The Coli Genetic Stock Center, CGSC 7634
PGK-neo-bpA sequence  Addgene 13442
Human BAC clones of target genes  https://bacpac.chori.org
JDS246 (Cas9-003), Mammalian codon-optimized streptococcus pyogenes Cas9-3X Flag Addgene 43861
MLM3636, Human-gRNA-ExpressionVector with U6 promoter  Addgene 43860
pX335-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9n(D10A) Addgene 42335
sgRNA design, ZiFit http://zifit.partners.org/ZiFiT/
Off target prediction tool CasOT http://eendb.zfgenetics.org/casot/download.php
Perl http://www.perl.org/get.html
NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
BLAT https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start
sgRNA Primer synthesis Sigma
One shot Top10 Electrocomp E. Coli Competent cells Life Technologies C4040-50
AccuPrime Pfx SupperMix Life Technologies 12344-040
Restriction enzymes NEB and Life Technologies
Zymoclean Gel DNA Recovery Kit Zymo Researech D4007
DNA quick extraction buffer  Epicentre QE0905T
Herculase II Fusion DNA Polymerases Agilent Technologies 600675
Digestion buffer 2 New England Biolab
6X DNA Loading Dye Thermo Scientific R0611
TeSR-E8 Kit for hESC/hiPSC Maintenance Stem Cell Technologies 05940
UltraPure Agarose  Life Technologies 16500-100
50xTAE Life Technologies B49
Essential 8 medium  Life Technologies A1517001
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline without Calcium and Magnesium  Life Technologies A12856-01
D-MEM/F12 with Glutamax  Life Technologies 10565018
D-MEM with Glutamax  Life Technologies 10566040
Fetal Bovine Serum-ES cell qualified  Life Technologies 10439
Knockout serum replacement  Life Technologies 10828010
2-mercaptoethanol 1000X  Life Technologies 21985023
Non Essential Amino Acid  Life Technologies 11140050
Stempro Accutase  Life Technologies A1110501
Dispase  Life Technologies 17105-041
0.25% Trypsin- EDTA solution  Life Technologies 25200-056
Geltrex  Life Technologies    12760-013
ROCK inhibitor Y-27632 Millipore    SCM075
SMC4 reagent  BD 354357
Neomycin resistant MEF  Millipore PMEF-NL
Hygromycin resistant MEF  Millipore PMEF-HL
G418 (Geneticin) LifeTechnologies 11811
Hygromycin B  Life Technologies 10687010
FIAU (Fialuridine, 1-2-Deoxy-2-fluoro-ß-D-arabinofuranosyl-5-iodouracil  Moravek Biochemicals and Radiochemicals    M251
Electroporator: Gene Pulser Xcell  Bio-Rad
0.4 cm electroporation cuvette  Bio-Rad 165-2088
DIG-High prime DNA labeling and detection starter kit II  Roche 11585614910
Hybridization denature solution  VWR 82021-478
PCR DIG probe synthesis kit  Roche 11636090910
DIG wash set  Roche 11585762001
Anti-Digoxigenin (DIG-AP) Roche 11093274910
CSPD chemiluminescence system  Roche 11755633001
DIG wash and block buffer set  Roche 11585762001
50X TAE buffer  Life Technologies 24710030
Blotting buffer (25 mM Tris pH 7.4,  0.15 M NaCl,  0.1% Tween20)
Hoefer Ultraviolet Crosslinker  Fisher Scientific 03-500-308
Spermidine  Fisher AC13274-0010
Tris HCl 2M (pH 7.5) VWR    200064-506
Denville Scientific blue bio film 8x10  Fisher nc9550782
DNA molecular weight marker II ( DIG-labeled ) Roche 11218590910
Amersham Blotting membrane Hybond-N+  Roche 95038-400
Pyrex glass drying tray  Fisher 15-242A
Kimberly-Clark C-fold paper towels  Fisher 06-666-32B
Whatman 3MM paper (26X41) Fisher    05-713-336
Hybridization bag  Roche 11666649001
Hybridization tubes  Fisher 13-247-300
Hybridization oven rotisserie Shake 'n' Stack  Fisher HBMSOV14110

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153, 910-918 (2013).
  2. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823-826 (2013).
  3. Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nature. 31, 227-229 (2013).
  4. Friedland, A. E., et al. Heritable genome editing in C. elegans via a CRISPR-Cas9 system. Nat Methods. (2013).
  5. DiCarlo, J. E., et al. Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. Nucleic Acids Res. 41, 4336-4343 (2013).
  6. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339, 819-823 (2013).
  7. Anders, C., Niewoehner, O., Duerst, A., Jinek, M. Structural basis of PAM-dependent target DNA recognition by the Cas9 endonuclease. Nature. 513, 569-573 (2014).
  8. Deltcheva, E., et al. CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III. Nature. 471, 602-607 (2011).
  9. Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P., Siksnys, V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, E2579-E2586 (2012).
  10. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, 816-821 (2012).
  11. Jinek, M., et al. RNA-programmed genome editing in human cells. eLife. 2, e00471 (2013).
  12. Fu, Y., et al. High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nature Biotechnology. 31, 822-826 (2013).
  13. Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature Biotechnology. 31, 827-832 (2013).
  14. Mali, P., et al. CAS9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering. Nature Biotechnology. 31, 833-838 (2013).
  15. Pattanayak, V., et al. High-throughput profiling of off-target DNA cleavage reveals RNA-programmed Cas9 nuclease specificity. Nature Biotechnology. 31, 839-843 (2013).
  16. Shen, B., et al. Efficient genome modification by CRISPR-Cas9 nickase with minimal off-target effects. Nature Methods. 11, 399-402 (2014).
  17. Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154, 1380-1389 (2013).
  18. Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Nature Protocols. 9, 1956-1968 (2014).
  19. Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154, 1370-1379 (2013).
  20. Szymczak, A. L., et al. Correction of multi-gene deficiency in vivo using a single 'self-cleaving' 2A peptide-based retroviral vector. Nature Biotechnology. 22, 589-594 (2004).
  21. Carey, B. W., et al. Reprogramming of murine and human somatic cells using a single polycistronic vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 157-162 (2009).
  22. Yagi, T., et al. A novel negative selection for homologous recombinants using diphtheria toxin A fragment gene. Analytical Biochemistry. 214, 77-86 (1993).
  23. Wu, S., Ying, G., Wu, Q., Capecchi, M. R. A protocol for constructing gene targeting vectors: generating knockout mice for the cadherin family and beyond. Nature Protocols. 3, 1056-1076 (2008).
  24. Xue, H., et al. A targeted neuroglial reporter line generated by homologous recombination in human embryonic stem cells. Stem Cells. 27, 1836-1846 (2009).
  25. Liu, Y., Jiang, P., Deng, W. OLIG gene targeting in human pluripotent stem cells for motor neuron and oligodendrocyte differentiation. Nature Protocols. 6, 640-655 (2011).
דור יעיל של כתבים במכות ספציפיים Lineage hiPSC עצבי באמצעות CRISPR / Cas9 ומערכת Nickase זוגי Cas9
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, S., Xue, H., Long, B., Sun, L., Truong, T., Liu, Y. Efficient Generation of hiPSC Neural Lineage Specific Knockin Reporters Using the CRISPR/Cas9 and Cas9 Double Nickase System. J. Vis. Exp. (99), e52539, doi:10.3791/52539 (2015).More

Li, S., Xue, H., Long, B., Sun, L., Truong, T., Liu, Y. Efficient Generation of hiPSC Neural Lineage Specific Knockin Reporters Using the CRISPR/Cas9 and Cas9 Double Nickase System. J. Vis. Exp. (99), e52539, doi:10.3791/52539 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter