Ganglia (DRG) zijn structuren die de sensorische neuronen van het perifere zenuwstelsel. Wanneer gedissocieerd kunnen zij samen gekweekt met SC-achtige adipose afgeleide stamcellen (ASC), die een waardevol model voor in vitro zenuwregeneratie en myelinisatie bestuderen nabootsen van de in vivo omgeving bij de verwonding.
Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the study of nerve regeneration and myelination. The glial cells of the peripheral nervous system, Schwann cells (SC), are key facilitators of these processes; it is therefore crucial that the interactions of these cellular components are studied together. Direct contact between DRG neurons and glial cells provides additional stimuli sensed by specific membrane receptors, further improving the neuronal response. SC release growth factors and proteins in the culture medium, which enhance neuron survival and stimulate neurite sprouting and extension. However, SC require long proliferation time to be used for tissue engineering applications and the sacrifice of an healthy nerve for their sourcing. Adipose-derived stem cells (ASC) differentiated into SC phenotype are a valid alternative to SC for the set-up of a co-culture model with DRG neurons to study nerve regeneration. The present work presents a detailed and reproducible step-by-step protocol to harvest both DRG neurons and ASC from adult rats; to differentiate ASC towards a SC phenotype; and combines the two cell types in a direct co-culture system to investigate the interplay between neurons and SC in the peripheral nervous system. This tool has great potential in the optimization of tissue-engineered constructs for peripheral nerve repair.
Perifere zenuw verwondingen zijn gemeen met ongeveer 9.000 gevallen in het Verenigd Koninkrijk die zich elk jaar in een overwegend jonge en werkende bevolking 1. Ondanks microchirurgische zenuwreparatie technieken, normale herstel van de functie is onbereikbaar met als gevolg verminderde de hand gevoel, verminderde motoriek en frequente pijn en koude intolerantie 2. Dergelijke verwondingen hebben een diepgaande en blijvende impact op de patiënt en hun vermogen om dagelijkse activiteiten uit te voeren, met minder dan 60% weer aan het werk 3.
Na letsel, het fenotype en de morfologie van neuronen en Schwann-cellen (SC) veranderen om een geschikte omgeving voor de axon kiemen te scheppen. In het geval van doorsnijding, wordt de zenuw verdeeld in proximale en distale stompen; de proximale stomp zijnde het punt van waaruit de regeneratieve proces plaatsvindt, terwijl de distale stomp ondergaat Wallerian degeneratie waarna de SC detachvan de gewonde axonen, de-differentiëren en te vermenigvuldigen. Dit is fundamenteel aan het wegnemen van myeline puin en het voorbereiden van de distale stomp voor zenuw re-generatie 4,5. Axon kiemen wordt ondersteund door de productie van neurotrofe factoren en chemokines vrijgegeven door SC de distale stomp, en geleid door de basale lamina achtergelaten na Wallerian degeneratie 6,7. SC uitlijnen langs de regenererende axon die de banden van Büngner, de hulp van de axon groei naar het doelorgaan, het verminderen van vertakking buiten de endoneurial buis. Volgende reïnnervatie, SC vormen de nieuwe myelineschede wikkelen de geregenereerde axonen, maar sensorische en motorische functie is slechts gedeeltelijk hersteld 8.
Dorsale wortel ganglia (DRG) zijn structuren in het foramen intervertebrale van de wervelkolom, die de sensorische neuronale cellen innerveren de perifere organen. Wanneer gedissocieerd, kunnen ze worden gebruikt als een geschikte in vitro model voor de studie van de zenuw regeneratie 9-11, met inbegrip van onderzoek van myeline vorming. In het bijzonder volwassen DRG neuronen na te bootsen de in vivo eigenschappen van deze cellen en zorgen voor een formidabele hulpmiddel om nieuwe strategieën voor perifere zenuw reparatie in tissue engineering studeren.
Co-culturen vormen een dynamisch systeem simuleert in vitro de interactie van twee (of meer) celtypen in een bepaalde in vivo omgeving. Eén van de voordelen van deze cel co-kweek modellen is de flexibiliteit en hoge controle die het extracellulaire milieu kan worden uitgeoefend. DRG neuronen vaak toegepast samen kweeksystemen met SC de werkelijke interacties die optreden tussen de twee celtypen in het perifere zenuwstelsel nabootsen 10,12 – 14. Er werd aangetoond dat SC extracellulaire matrix (ECM) proteïnen en groeifactoren die opmerkelijk kan verbeterenvermogen van DRG neuronen om te overleven en ontkiemen neurites 15,16. Echter, SC vereisen langere tijd te prolifereren en ondanks de vooruitgang in celkweek techniek, is het nog steeds moeilijk om een geschikt aantal cellen voor tissue engineering toepassingen genereren. Daarnaast wordt het offer van een gezonde zenuw noodzakelijk om autologe SC oogsten. Daarom is het verschil sourcing SC is belangrijk voor tissue engineering en in vitro testen van zenuwregeneratie. In deze weergave kan ASC worden beschouwd als een waardevol alternatief voor de ontwikkeling van een tissue engineering construct wordt gebruikt voor perifere zenuwen reparatie 17,18. Eerder werk toonde het vermogen van deze cellen om te differentiëren tot SC-achtige ASC, expressie karakteristieke glial-markers, zoals S-100, p75 en glia fibrillair zuur eiwit (GFAP) 19, alsmede de myeline eiwit nul (P0) 20 . De afscheiding van gliale groeifactoren, zoals BDNF (BDNF), zenuwgroeifactor (NGF) en gliale cel afgeleide neurotrofe factor (GDNF) werd ook waargenomen 21,22. Daarom kan SC-achtige ASC worden gebruikt als promotor van perifere zenuwregeneratie, zoals aangetoond zowel in vitro als in vivo studies 23-26. Bovendien kan ASC worden geoogst via minimaal invasieve procedures in groter aantal dan andere types stamcellen; de frequentie van stamcellen in vetweefsel 100 tot 1000 maal hoger dan in het beenmerg 27, en ze een hogere proliferatie in vergelijking met SC en beenmerg mesenchymale stamcellen.
Dit werk heeft als doel een gedetailleerd protocol te hoge efficiënte oogsten van gedistantieerd DRG neuronen en ASC respectievelijk uit te voeren, de laatste wordt gedifferentieerd in SC-achtige cellen. De co-cultuur van deze twee celtypes zullen daarom een praktisch systeem dat kan worden gebruikt voor toekomstige studies op het vermogen van DRG neurons om neurites en de mechanismen van myeline vorming op verschillende steiger voor zenuwweefsel techniek ontkiemen.
DRG neuronen worden vaak gebruikt bij neuronale cellen primaire kweek voor de regeneratie van neuronen te bestuderen na axotomie in vivo. Hier een nauwkeurig protocol voor DRG oogst van volwassen ratten wordt gepresenteerd, gericht op het verminderen van de bevolking van satelliet-cellen in de omgeving zonder dat de neuronale overleving in gevaar te brengen. Als ASC gedifferentieerd in een SC-achtige fenotype een alternatief voor SC celtherapie is een SC-achtige ASC / DRG co-kweeksysteem ook beschreven.
Het is algemeen bekend dat laminine (of laminine afgeleide peptidesequenties) hebben een gunstig effect op neuron overleving en neuriet vorming 31-33. Bij het uitvoeren van DRG neuron culturen het daarom wordt geadviseerd om eerder jas elk substraat met laminin om eventuele verlies van functionaliteit van de neuronale cellen te voorkomen. Het begrip laminine coatings geldt ook biomateriaal substraten voor het ontwerp vantissue engineering constructies, zoals poly – caprolacton (PCL) vaak gebruikt voor de fabricage van de zenuw leidingen 30. Ook eerdere werk aangetoond dat fibrine matrices zijn geschikte materialen voor neuronale culturen in drie dimensie 11.
Naast eiwitten coating, co-cultuur modellen waardevolle voorwaarden DRG-neuron overleving en een geschikte omgeving om de interacties die optreden tussen neuronen en SC in het perifere zenuwstelsel na letsel bestuderen. Cellen kunnen ook in vivo worden getransplanteerd met behulp van neurale inrichtingen om de rekrutering tijdstip van autologe cellen verkorten de verwonding. Dit is bijzonder belangrijk in ernstig letsel, wat kan leiden tot celsenescentie / dood en spieratrofie. Hoewel SC zijn de belangrijkste gliacellen betrokken bij het proces van regeneratie van perifere zenuwen en myelinisatie, hun beperkte beschikbaarheid en hun langzame proliferatiesnelheid maakt ze ongeschiktvoor tissue engineering toepassingen 34. ASC zijn een goed alternatief als gevolg van hun overvloed en het vermogen om te differentiëren in de SC fenotype, met expressie van specifieke gliale markers en het tonen van functionele overeenkomsten met inheemse SC 19. ASC kunnen ook eiwitten en groeifactoren 5 die gunstig zijn voor de vorming en verlenging van neurieten door DRG neuronen in een co-cultuur systeem kan produceren. Er kunnen echter twee verschillende co-kweeksystemen worden ingesteld als functie van de experimentele behoeften. De in dit document voorgestelde methode is een herziene versie van een gevestigde protocol in ons laboratorium 11 en het gaat om een direct contact tussen de twee celtypen (directe co-cultuur), waarin de tweede celtype (DRG neuronen) worden gezaaid bovenop de andere (SC-achtige ASC). Deze benadering is gebaseerd op eerdere bevindingen dat het belang van de aanwezigheid van gliale cel op het substraat aangetoond wanneer zaaien neuronale culturen 35 <sup> – 37. Dit effect wordt waarschijnlijk veroorzaakt door cel-cel interacties door DRG integrinen en ECM moleculen afgezet uit ascorbaat en andere signalen op de steel celoppervlak. Ook werd waargenomen dat een reductie van melkeiwitten in het medium verlaagde de proliferatie van contaminerende satelliet cellen die kunnen voortvloeien uit de dissociatie van DRG neuronen, onverminderd ASC functies. Echter, satelliet cellen, waaronder een kleine populatie van SC, moeilijk om volledig te elimineren uit kweken van DRG neuronen en weinig overblijvende cellen zullen aanwezig zijn in de co-cultuur systeem. Het is daarom belangrijk om op te merken dat deze kleine subpopulaties ook kunnen deelnemen aan myelinisatie processen tijdens in vitro studies, herinnerend aan de autologe cellen die aanwezig zijn in vivo na een blessure zijn. De tweede benadering (hier niet weergegeven) omvat het gebruik van celkweek inserts, het voorkomen van een direct contact tussen de twee celtypen (indirecte co-kweek). However is niet representatief voor de in vivo omstandigheden bij zenuwregeneratie (verminderd vermogen van neuronale cellen voor lange neurieten ontstaan), maar wordt gebruikt om het effect van vrij diffundeerbare factoren in het medium met een bepaalde celpopulatie onderzocht op de andere 38 .
The authors have nothing to disclose.
This work is supported by the National Institute for Health Research, Academy of Medical Sciences and the British Society for Surgery of the Hand. We also gratefully acknowledge the continuing supply of GGF-2 from Acorda Therapeutics, USA. The authors would finally like to acknowledge Prof. Giorgio Terenghi for his valuable support and guidance in our group over the past years that led to the development and optimization of this protocol.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
100 µm cell strainer | BD Biosciences | 352360 | 70 μm strainers (ref. 352350) can be used as alternative |
15 mL plastic tubes | Sarstedt | 62.554.002 | |
50 mL plastic tubes | Sarstedt | 62.547.004 | |
75 cm2 flasks | Corning | BC301 | |
Retinoic Acid >98% HPLC | Sigma | R2625 | |
ARA-C supplement | Sigma | C6645 | |
Recombinant Human FGF-basic (154 aa) | Peprotech | 100-18B | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A9205 | |
Collagenase type I | Gibco | 17100-017 | Note: this collagenase is only used for fat tissue digestion |
Collagenase type IV | Worthington Biochemical | LS004188 | Note: this collagenase is only used to dissociate DRG explants |
Foetal Bovine Serum (FBS) | Biosera | FB-1001 | |
Forskolin | Sigma | F3917 | |
Glass pipettes | Fisher Scientific | FB50253 | Sharp material to be disposed accordingly |
Glial Growth Factor-2 (GGF-2) | Acorda Therapeutics | GGF-2 was kindly donated by Acorda Therapeutics. For a commercially available alternative, we recommend NRG1-β1 (R & D Systems, Abingdon) for stem cell differentiation to be used at the final concentration of 200ng/ml | |
Nutrient Mix F12 HAM | Sigma | N6658 | Warm at 37 °C in a water bath unless specified |
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Sigma | H9394 | Warm at 37 °C in a water bath unless specified |
N-2 supplement (100x) | Invitrogen | 17502 | |
Nerve Growth Factor 2.5s Protein, Mouse Submaxillary Glands (NGF) | Millipore | NC011 | |
Penicillin-Streptomycin (PS) | Sigma | P0781 | |
Petri dishes | Corning | 430165 | |
Recombinant Human PDGF-AA | Peprotech | 100-13A | |
Trypsin | Invitrogen | 25200-056 | Warm at 37 °C in a water bath. This is used for cell detachment from tissue culture flasks |
Trypsin (2x bovine pancreatic) | Worthington Biochemical | LS003703 | This is used for DRG dissociation |
Minimum Essential Medium Eagle (MEM) | Sigma | M8042 | Warm at 37 °C in a water bath unless specified |
2-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | Prepare the solution in the biological cabinet |