Rygg rotganglier (DRG) är strukturer som innehåller de sensoriska neuronerna i det perifera nervsystemet. När dissocieras, kan de vara samodlades med SC-liknande adipos-härledda stamceller (ASC), vilket ger en värdefull modell för att studera in vitro nervregeneration och myelination, imitera in vivo miljön på skadeplatsen.
Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the study of nerve regeneration and myelination. The glial cells of the peripheral nervous system, Schwann cells (SC), are key facilitators of these processes; it is therefore crucial that the interactions of these cellular components are studied together. Direct contact between DRG neurons and glial cells provides additional stimuli sensed by specific membrane receptors, further improving the neuronal response. SC release growth factors and proteins in the culture medium, which enhance neuron survival and stimulate neurite sprouting and extension. However, SC require long proliferation time to be used for tissue engineering applications and the sacrifice of an healthy nerve for their sourcing. Adipose-derived stem cells (ASC) differentiated into SC phenotype are a valid alternative to SC for the set-up of a co-culture model with DRG neurons to study nerve regeneration. The present work presents a detailed and reproducible step-by-step protocol to harvest both DRG neurons and ASC from adult rats; to differentiate ASC towards a SC phenotype; and combines the two cell types in a direct co-culture system to investigate the interplay between neurons and SC in the peripheral nervous system. This tool has great potential in the optimization of tissue-engineered constructs for peripheral nerve repair.
Perifera nervskador är vanliga med cirka 9.000 fall i Storbritannien inträffar varje år i en övervägande ung och arbetar befolkningen 1. Trots mikronervreparationsteknik, är normalt återställande av funktion ouppnåeligt med åtföljande nedsatt handen känsla, minskad motorik och frekvent smärta och kallt intolerans 2. Sådana skador har en djup och varaktig inverkan på patienten och deras förmåga att utföra dagliga aktiviteter, med mindre än 60% återvänder till arbetet 3.
Efter skadan, fenotypen och morfologin av nervceller och Schwann celler (SC) förändring i syfte att skapa en lämplig miljö för att möjliggöra axonet groning. Vid transektion, är nerven uppdelad i proximala och distala stubbar; den proximala stumpen är den punkt från vilken den regenerativa processen äger rum, medan den distala stumpen undergår Wallerian degenerering varpå SC detachfrån de skadade axoner, de-differentiera och föröka sig. Detta är grundläggande för att avlägsna myelin skräp och förbereda den distala stumpen för nervåter generationens 4,5. Axon groning stöds av produktionen av neurotropa faktorer och kemokiner släpptes av SC på den distala stumpen, och styrs av den basala lamina kälken efter Wallerian degeneration 6,7. SC anpassa sidan av regenere axonet bildar band av Büngner, vilket stöd axonet tillväxt mot målorganet, minskar förgrening utanför endoneurial röret. Efter reinnervation, SC bilda den nya myelinskidan inslag de regenere axoner, men sensorisk och motorisk funktion är endast delvis återställd 8.
Dorsala rotganglier (DRG) är strukturer belägna i mellankotskivan fora av ryggraden, som innehåller de sensoriska neuronceller innervating perifera organ. När dissocierat, kan de användas som en lämplig in vitro-model för studier av nervregeneration 9-11, inklusive undersökningar av myelinbildning. I synnerhet vuxen DRG-neuroner härma egenskaperna hos dessa celler in vivo och ger en formidabel verktyg för att studera nya strategier för perifer nervreparation i vävnadsteknik.
Samkulturer representera ett dynamiskt system som simulerar in vitro samspelet av två (eller flera) celltyper i en viss in vivo miljö. En av fördelarna med dessa cell samodling modeller är flexibilitet och hög kontroll som kan utövas på den extracellulära miljön. DRG nervceller har använts frekvent i samarbete odlingssystem med SC för att efterlikna den verkliga samspel som sker mellan de två celltyperna i det perifera nervsystemet 10,12 – 14. Det visades att SC utsöndrar extracellulär matris (ECM) proteiner och tillväxtfaktorer som anmärkningsvärt kan förbättraförmåga DRG nervceller att överleva och gro neuriter 15,16. Emellertid SC kräver långa tidsperioder för att proliferera och trots framsteg inom cellodlingsteknik är det fortfarande svårt att generera ett lämpligt antal celler för vävnadstekniska tillämpningar. Dessutom är offrandet av en frisk nerv nödvändig att skörda autolog SC. Därför är det viktigt för både vävnadsteknik och in vitro test av nervregeneration skillnaden i inköps SC. I denna vy kan ASC anses vara ett värdefullt alternativ för utvecklingen av en vävnadsutvecklad konstruktion som ska användas för perifer nervreparation 17,18. Tidigare arbete har visat förmågan hos dessa celler att differentiera till SC-liknande ASC, som uttrycker karakteristiska gliala-markörer, såsom S-100, p75 och gliafibrillärt surt protein (GFAP) 19, liksom den myelinprotein noll (P0) 20 . Utsöndringen av gliala tillväxtfaktorer, såsom hjärn-härledd neurotrofisk faktor (BDNF), nervtillväxtfaktorn (NGF) och gliacell neurotrofisk faktor (GDNF) observerades också 21,22. Därför kan SC-liknande ASC användas som främjare av perifer nervregenere, vilket framgår av både in vitro och in vivo studier 23-26. Dessutom kan ASC skördas genom minimalinvasiva ingrepp i större antal jämfört med andra typer stamcells; frekvensen av stamceller i fettväv är 100- till 1000-faldigt högre än i benmärg 27, och de har en högre proliferationshastighet jämfört med SC och benmärg mesenkymala stamceller.
Detta arbete syftar till att ge ett detaljerat protokoll för att utföra högeffektiva skördar av dissocierade DRG nervceller och ASC respektive den senare differentieras till SC-liknande celler. Den samodling av dessa två celltyper kommer därför att ge ett mycket praktiskt system som kan användas för framtida studier på förmågan hos DRG neurons att gro neuriter och mekanismerna för myelinbildning på olika byggnadsställning för nervvävnadsteknik.
DRG nervceller används ofta bland neuronala celler för primär kultur att studera regeneration av nervceller efter axotomi in vivo. Här en korrekt protokoll för DRG skörd från vuxna råttor presenteras, syftar till att minska populationen av satellitceller i den omgivande miljön utan att kompromissa med neuronal överlevnad. Som ASC differentieras till en SC-liknande fenotyp är ett giltigt alternativ till SC för cellterapi, är en SC-liknande ASC / DRG samodlingssystemet också beskrivs i detalj.
Det är allmänt känt att laminin (eller laminin-härledda peptidsekvenser) har en gynnsam effekt på neuron överlevnad och neuritbildning 31-33. När du utför DRG neuron kulturer är det därför klokt att tidigare belägga varje substrat med laminin för att undvika förlust av funktionaliteten hos de neuronala celler. Begreppet laminin beläggningar gäller även biomaterial substrat för utformning avvävnadstekniska konstruktioner, såsom poly – kaprolakton (PCL) används ofta för tillverkning av nervledningar 30. Också visat tidigare arbete att fibrinmatriser är lämpliga material för neuronala kulturer i tre dimensioner 11.
Förutom proteinbeläggning, co-kultur modeller ger värdefulla förutsättningar för DRG neuron överlevnad och en lämplig miljö för att studera det samspel som sker mellan nervceller och SC i det perifera nervsystemet efter skada. Celler kan också transplanteras in vivo genom att använda neurala enheter i syfte att förkorta rekryteringstiden för autologa celler vid skadeplatsen. Detta är särskilt viktigt i allvarliga skador, vilket kan leda till cellåldrande / död och muskelatrofi. Även SC är de viktigaste gliaceller involverade i processen för perifer nervregenerering och myelination, deras begränsade tillgången och deras långsamma spridning hastighet gör dem olämpligaför vävnadstekniska tillämpningar 34. ASC är ett giltigt alternativ på grund av sitt överflöd och förmåga att differentiera till SC fenotyp, som uttrycker specifika gliaceller markörer och visar funktionella likheter med infödda SC 19. ASC har även möjlighet att tillverka proteiner och tillväxtfaktorer 5 som kan vara till nytta för bildandet och utvidgning av neuriter från DRG nervceller i en samodlingssystemet. Däremot kan två olika co-odlingssystem sättas upp som funktion av de experimentella behov. Den föreslagna i denna uppsats metod är en reviderad version av en väletablerad protokoll i vårt laboratorium 11 och det innebär en direkt kontakt mellan de två celltyper (direkt samodling), i vilket den andra celltyp (DRG nervceller) ympas på toppen av de andra (SC-liknande ASC). Detta synsätt bygger på tidigare fynd som visade vikten av närvaron av en gliaceller skikt på substratet när sådd neuronala kulturer 35 <sup> – 37. Denna effekt beror sannolikt på cell-cell interaktioner genom DRG integriner och ECM-molekyler som deponerats från ASC och andra ledtrådar på stamcellsytan. Det observerades också att en reduktion av protein i serum i mediet reducerade proliferationen av förorenande satellitceller som kan härleda från dissociationen av DRG-neuroner, utan att påverka ASC funktioner. Emellertid satellitceller, inklusive en liten population av SC, är svåra att helt eliminera från kulturer av DRG-neuroner och få återstående celler kommer också att vara närvarande i samodlingssystemet. Därför är det viktigt att notera att dessa små delpopulationer också kan delta till myelinisering processer under in vitro-studier, som påminner om autologa celler som finns in vivo efter skada. Det andra tillvägagångssättet (presenteras inte här) innefattar användning av cellodlingsinlägg, undvika en direkt kontakt mellan de två olika celltyper (indirekt samodling). However, det är inte representativt för förhållandena in vivo under nervregeneration (minskad förmåga av neuronala celler att utveckla långa neuriter), men den används för att undersöka effekten av frigjorda diffunderbara faktorer i mediet av en viss cellpopulation på den andra 38 .
The authors have nothing to disclose.
This work is supported by the National Institute for Health Research, Academy of Medical Sciences and the British Society for Surgery of the Hand. We also gratefully acknowledge the continuing supply of GGF-2 from Acorda Therapeutics, USA. The authors would finally like to acknowledge Prof. Giorgio Terenghi for his valuable support and guidance in our group over the past years that led to the development and optimization of this protocol.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
100 µm cell strainer | BD Biosciences | 352360 | 70 μm strainers (ref. 352350) can be used as alternative |
15 mL plastic tubes | Sarstedt | 62.554.002 | |
50 mL plastic tubes | Sarstedt | 62.547.004 | |
75 cm2 flasks | Corning | BC301 | |
Retinoic Acid >98% HPLC | Sigma | R2625 | |
ARA-C supplement | Sigma | C6645 | |
Recombinant Human FGF-basic (154 aa) | Peprotech | 100-18B | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A9205 | |
Collagenase type I | Gibco | 17100-017 | Note: this collagenase is only used for fat tissue digestion |
Collagenase type IV | Worthington Biochemical | LS004188 | Note: this collagenase is only used to dissociate DRG explants |
Foetal Bovine Serum (FBS) | Biosera | FB-1001 | |
Forskolin | Sigma | F3917 | |
Glass pipettes | Fisher Scientific | FB50253 | Sharp material to be disposed accordingly |
Glial Growth Factor-2 (GGF-2) | Acorda Therapeutics | GGF-2 was kindly donated by Acorda Therapeutics. For a commercially available alternative, we recommend NRG1-β1 (R & D Systems, Abingdon) for stem cell differentiation to be used at the final concentration of 200ng/ml | |
Nutrient Mix F12 HAM | Sigma | N6658 | Warm at 37 °C in a water bath unless specified |
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Sigma | H9394 | Warm at 37 °C in a water bath unless specified |
N-2 supplement (100x) | Invitrogen | 17502 | |
Nerve Growth Factor 2.5s Protein, Mouse Submaxillary Glands (NGF) | Millipore | NC011 | |
Penicillin-Streptomycin (PS) | Sigma | P0781 | |
Petri dishes | Corning | 430165 | |
Recombinant Human PDGF-AA | Peprotech | 100-13A | |
Trypsin | Invitrogen | 25200-056 | Warm at 37 °C in a water bath. This is used for cell detachment from tissue culture flasks |
Trypsin (2x bovine pancreatic) | Worthington Biochemical | LS003703 | This is used for DRG dissociation |
Minimum Essential Medium Eagle (MEM) | Sigma | M8042 | Warm at 37 °C in a water bath unless specified |
2-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | Prepare the solution in the biological cabinet |