Introduction
gondii Toxoplasma (ט gondii) הוא תאיים לחייב, הפתוגן protozoal. זה הוא הגורם הסיבתי של טוקסופלזמוזיס, סכנה בריאותית באנשי מדוכאי חיסון. כמו כן, מערכת המודל לפתוגנים apicomplexan אחרים שלהדביק בני אדם ובכלל זה Cryptosporidium וCyclospora. טוקסופלזמוזיס נרכש הנפוץ ביותר בבליעת מזון או מים מזוהמים בשלב bradyzoite או oocyst של הטפיל. על הבליעה, שלבים אלה להמיר לבמה tachyzoite של הטפיל שמשכפל בתוך תאי מארח ומפיץ מערכתי. תאי T, IFN-γ ו, ובמידה פחותה, תחמוצת חנקן 1-4, חשוב על שליטה בזיהום, אבל הם לא מסוגלים לחסל את המחלה, כאחוז מtachyzoites להמיר לבמה bradyzoite שמוגנות בתוך ציסטות רקמה וכתוצאה מכך זיהום כרוני חיים ארוכים. למעשה, אין תרופות יעילות נגד של ציסטה הכרוניתכאחוז מהמחלה. טוקסופלזמוזיס החמור הוא לרוב עקב ההפעלה מחדש של זיהום מתמשך, עם שלב bradyzoite של הטפיל המרה בחזרה למאפיין השלב tachyzoite מהירות משכפלים של הדבקה ראשונית וחריפה.
הישרדות בשלב מוקדמת של הפנים של התגובה החיסונית המולדת היא חשובה על מנת לאפשר את הטפיל להגיע מספרי טפיל מספיק, כמו גם להגיע לאתרי דיסטלי, כדי לאפשר הקמתה של דלקת כרונית. ט גונדי התפתח אסטרטגיות כדי לנטרל מנגנוני הגנת מארח שצפויה לתרום ליכולתו לשכפל ולהפיץ בשלבי הדבקה ראשוני. ראשית, ט ' גונדי יוצר PV ייחודי במהלך הפלישה טפילה שמופרד במידה רבה מתהליכי endocytic וexocytic של התא המארח בהשוואה לפתוגנים תאיים אחרים 5-9. כמו כן, כמו כל ט פתוגנים תוך-התאי המוצלח גונדי משנה תא המארח שלה כדי ליצור סביבה מתירנית fאו צמיחה. זה כולל ביטוי מארח תכנות מחדש של תאים על ידי שינוי גנטי גורמי שעתוק תא מארח כולל אלו חשובים להסדרת תא הפעלה 10-15. 16-19 ROP16, GRA15 20, GRA16 21 ו -22 GRA24 כולם הוכחו כחשוב בויסות תגובת תעתיק ותא איתות מפלים של תאי מארח נגועים בט גונדי. מחקרים שנעשה לאחרונה שימוש בצלבים גנטיים בין זני טפיל עם פנוטיפים שונים היו יעילים ביותר בזיהוי גני טפיל העומדים בבסיס תכונות גנוטיפ תלוי טפיל כוללים התחמקות של GTPases החסינות קשורה (IRGs) 16,19,23-26. בעכברים, GTPases החסינות קשורה (IRGs) הם קריטיים לשליטה של סוג II ו- III גנוטיפים של הטפיל ואילו גנוטיפים סוג מאוד ארסי אני התפתחו מנגנונים להתחמק IRGs העכברי. עם זאת, ברור גם שהטפיל התפתח מנגנונים להתחמק תקשורת מיקרוביאליתtors בנוסף לIRGs וכי חלק ממנגנונים אלה עשויים להיות נשמר על פני גנוטיפים טפיל 27,28. בנוסף, מעט מאוד ידוע על המתווכים הקריטיים של חסינות אוטונומית תא נגד T. גונדי בטוקסופלזמוזיס האנושי. גני טפיל חשובים להתנגדות למתווכים של חסינות אוטונומית תא יכולים להיות גם חשובים להישרדות במהלך tachyzoite לbradyzoite המרה אשר יכול גם להיות מופעלת על ידי תגובות חיסוני מארח. לדוגמא, תחמוצת חנקן ברמות גבוהות יכולה לדכא את התרבות טפילה במקרופאגים נגועים אבל זה גם יכול לעורר tachyzoite לbradyzoite המרה וכתוצאה מכך ייצור ציסטה 30-32.
ToxoDB הוא מסד נתונים הגנומי פונקציונלי לט גונדי המתפקד כמשאב קריטי עבור השדה במונחים של מתן מידע לרצף הגנום הטפיל וגישה לנתונים בקנה מידה הגנומי שפורסמו ושלא פורסמו כולל הסברים קהילה, exp הגן נתונים ression ופרוטאומיקה 33. בדומה לרבים פתוגנים protozoal, רוב הגנום מורכב של גנים היפותטי ללא מידע זמינים על בסיס הומולוגיה גנטית כדי לספק תובנות לגבי פונקציות הפוטנציאל שלהם. לפיכך, גנטיקה קדימה היא כלי רב עוצמה לזיהוי גני טפיל רומן חשובים להעלמה חיסונית, המרת ציסטה ופונקציות אחרות קריטיות להיווצרות מחלה טפילה, כמו גם עבור המרה בין שלבי התפתחות שונים. כוח נוסף של גנטיקה קדימה הוא שניתן להשתמש בו כגישה יחסית שאינו מוטה לחקור את הטפיל כלגנים החשובים למשימות ספציפיות בפתוגנזה, כוללים העלמת חיסונית והיווצרות ציסטה. השיפורים אחרונים ברצף של הדור הבא לפרופיל מוטאציות הפכו אותה לשיטת בחירה לזיהוי גני הטפיל האחראים ממחקרי גנטיקה קדימה באמצעות mutagenesis הכימי וinsertional 34-37.
ntent "> חשוב לזהות נקודות תורפה בט gondii שניתן לנצל כדי לשפר את האפקטיביות של מנגנוני חיסון אוטונומיים תא נגד הטפיל במיוחד אלה שיכולים להיות גם פעילים נגד שלב ציסטה עמיד. לקראת מטרה זו, במבחנה עכברית זיהום מקרופאג ומודל הפעלה פותח כדי לזהות מוטציות בטפיל שדווקא לפגוע בכושר gondii ט לאחר הפעלה של מקרופאגים הנגועים אך לא במקרופאגים הנאיביים. מסך מקרופאג זה שימש לחקור את ספרייה של מוטציות insertional ט gondii כדי סופו של דבר זיהוי גני ט gondii חשובים להתנגדות לתחמוצת חנקן 27,28. הבידוד של פנל של מוטציות ט gondii עם התנגדות לקויה להפעלה של מקרופאגים הנגועים, במיוחד רגישות ניכרת לתחמוצת חנקן, הוכיח את התועלת של המסך כדי לזהות גני טפיל חשובים להתנגדותלמתווכים של תא חסינות אוטונומית אחרת מאשר מנגנוני ההתנגדות תיארו לIRGs העכברי 28. יש mutagenesis insertional יתרונות על פני mutagenesis הכימי במונחים של יצירת מספר מוגבל של מוטציות אקראיות בכל שיבוט טפיל ו, בתאוריה, זיהוי קל יותר של האתר של מוטציה. עם זאת, זיהוי האתר הגנומי של הכנסת פלסמיד בט מוטציות insertional גונדי, בפועל, היו קשות באופן מפתיע, במקרים רבים 37. החדרת פלסמיד לגן היא גם עלולה לשבש את תפקודו של גן בניגוד לmutagenesis הכימי שבדרך כלל תוצאות שינויי נוקלאוטיד בודדים. עם זאת, mutagenesis הכימי עם או N-nitrosourea N-אתיל-(ENU) או sulfonate ethylmethane (EMS) עשוי להציע יכולת מוגברת לנתח חלק גדול יותר של הגנום הטפיל, בהשוואה לmutagenesis insertional, כפי שהוא יוצר פולימורפיזם של נוקלאוטיד הבודד מרובה ( מוערך בכ 10 -100) למוטציה 34, 38. יתר על כן, התקדמות שחלה באחרונה בפרופיל הגנום כולו הפכה זה אפשרי להשתמש ברצף הדור הבא לזהות את הגנים המועמד הסביר ביותר האחראים לפנוטיפ המזוהה של טפיל מוטציה 34,38. ללא קשר לגישה mutagenesis, אישור על תפקידו של גן הטפיל בהתנגדות להפעלת מקרופאג סופו של דבר דורש מחיקת גן ושלמה למלא העיקרים של קוך המולקולרי.היכולת לנתח את הפונקציה של גן על ידי מניפולציה גנטית של שתי הטפיל ומקרופאג חשובה כמו רבים מהגנים שזוהו באמצעות גנטיקה קדימה בט גונדי, כמו גם פתוגנים אחרים, עדיין מאופיינים כגנים היפותטי עם לא מעט הומולוגיה ברצף לחלבונים אחרים עם פונקציות ידועות. המאמר הנוכחי מתאר גישה כללית שיכול לשמש לזיהוי אם הגן המשובש במוטציה הוא חשוב להתנגדות לידועה אומתווך לא ידוע של חסינות אוטונומית תא. הניתוח הראשוני של גורמים אנטי-מיקרוביאלי מארח מתבצע על ידי הערכת ההישרדות של סוג בר וטפילי מוטציה במקרופאגים מעכברים מסוג בר לעומת אלו עם מחיקות גן ספציפיות בsynthase תחמוצת חנקן מושרה, GP-91 phox (מונואמין NADPH) (iNOS), ו GTPases חסינות הקשורים ספציפי (IRGs). זה יקבע אם הגנים הטפיל זיהו חשובים להתנגדות לתחמוצת חנקן, חמצן פעיל ביניים או GTPases חסינות הקשורים 28 בהתאמה, או אם מנגנון חיסוני ידוע הוא מעורב. הפעלה של מקרופאגים הנגועים עם שני IFN-γ וLPS, שתוארו בפרוטוקול הנוכחי, נובעת בעיקר בבידוד של גני הטפיל חשובים להתנגדות לתחמוצת חנקן 28. השימוש בסוכנים תרופתיים שיגרמו לתחמוצת חנקן בהיעדר הפעלת מקרופאג (תורמי תחמוצת חנקן) אישרו כי הרוב המכריע של הגנים שזוהו היה חשוב למחדשsistance לתחמוצת חנקן ולא תחמוצת חנקן בתיאום עם מתווכים נוספים הקשורות להפעלת מקרופאג 28.
שלב ראשון ושני לתאר מסך גנטיקה קדימה נועד לבודד מוטנטים טפילים עם פגם כושר לאחר ההפעלה של מקרופאגים נגזרות מח עצם נגוע במבחנה. השלב הראשון מתאר ניתוח טיטרציה מינון כדי לקבוע מינון של γ IFN- וLPS אמפירי לשימוש עבור הפעלת מקרופאג שמפחיתה שכפול טפיל אך לא לעכב את השכפול של ט הסוג בר באופן מלא זן הורים gondii המשמש ליצירת הספרייה של מוטציות טפילה. שלב שני מתאר את המסך הגנטי קדימה של השיבוטים המוטציה במקרופאגים ב96-גם צלחות. שלב שלישי מתאר גישה כדי לאשר את הפנוטיפ של כל מוטציה שזוהתה במסך של 96 הצלחות גם ולהעריך האם הפגם בכל מוטציה משפיע הישרדות טפיל, שכפול,או ייצור ציסטה בתגובה להפעלת מקרופאג. שלב רביעי מתאר את השימוש של מקרופאגים נגזרות מח עצם מעכברים עם מחיקות במסלולי מיקרוביאלית ספציפיות כדי לזהות את המתווכים חיסוניים שמוטצית הטפיל היא במיוחד רגישה. השלב חמישי מתאר גישה כדי לקבוע אם מוטציה טפיל גם התפשרה על הפתוגנזה in vivo כפי שהוערך על ידי ייצור ציסטה במוחם של עכברים נגועים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: כל הפרוטוקולים שכרוכים בשימוש בבעלים החיים בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי הטיפול בבעלי חיים של המכללה לרפואה בניו יורק וועדת שימוש.
פרוטוקולים מפורטים לmutagenesis הכימי 38, בידוד של טפילים על ידי הגבלת דילול 38, בידוד של מקרופאגים מח עצם נגזרים עכבריים 39, צמיחה של ט ': הערה גונדי בפיברובלסטים עורלת אדם ייצור תאים וציסטה במקרופאגים וניתוח immunofluorescence בסיסי (HFF) (IFA) 32 בהפניה. לבצע את כל תרבית התאים על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 בתקשורת D10 (של Dulbecco גלוקוז הגבוה השתנה נשר בינוני בתוספת 10% עגל בסרום עוברי, L-גלוטמין 2 מ"מ, 100 U / פניצילין מיליליטר ו- 100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין) . שמור את כל חומרים כימיים סטרילי לאורך בידודי תא ותא תרבות.
1. מנה כותרות של IFN-γ וLPS לקביעת Concentrations להשתמש כדי להפעיל את המקרופאגים Infected למסך קדימה הגנטיקה
- מקרופאגים תרבות עצם עכברי-נגזר מח O / N בשמונה שקופיות זכוכית קאמרית בריכוז של 3 × 10 5 תאים / מיליליטר ב -250 μl של תקשורת D10 לכל תא. השתמש מקרופאגים 01:59-שבועות לאחר בידוד ממח עצם.
הערה: מגלשות הלשכה נרכשות שיש לי צמיחה RS שיפור לשטוף. - השתמש hemocytometer לספור טפילים מסוג בר שנקטפו מן פיברובלסטים עורלת אדם תאים (HFF) גדלו בבקבוק תרבות רקמת T25. Resuspend טפילים בריכוז של 5 x 10 5 טפילים מסוג בר לכל מיליליטר בתקשורת D10. ריכוז זה יגרום ריבוי של זיהום של כ 1: 1 כהמקרופאגים התרבו O / N. השתמש בצינורות קלקר או PET לכל המניפולציות עם טפילים כמו מקלות הטפיל לפוליפרופילן.
- הסר את המדיה D10 בשקופיות הקאמרית ולהחליף עם 250 μl שלהשעיה של טפילים מסוג בר. בעדינות להוסיף את ההשעיה הטפיל לכל תא של השקופית כך שהוא מאפשר לה לזרום במורד הפנים הפנימיים של כל תא. אל תאפשר מקרופאגים להתייבש בכל נקודה במהלך הפרוטוקול.
- שקופיות קאמריות כיסוי נגוע בטפילים עם כיסוי תא השקופית ומקום בחממה ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 למשך 4 שעות כדי לאפשר לטפיל לפלוש ולהקים PV.
- הפוך את דילולים של LPS וIFN-γ ב 1 מיליליטר של תקשורת D10 בצינורות סטרילית לtitrations המינון. למנה titrations לשמור או LPS או קבוע ריכוז IFN- ולהשתנות הגירוי האחר 40.
- לדוגמא, לשמור LPS הקבוע ב 10 LPS ng לכל מיליליטר ולהשתנות הריכוז של γ IFN- (0, 1 יחידה / מיליליטר, 10 יחידות / מיליליטר, 100 יחידות / מיליליטר, 1,000 יחידות / מיליליטר). שמור IFN- γ קבוע ב 100 יחידות / מיליליטר ולהשתנות הריכוז של LPS (0, 0.1 ng / ml, ng / 1 מיליליטר / מיליליטר, 10 ng, 100 ng / ml). מניית LPS בקצרה sonicate למשך 2 דקות בליחימום בsonicator אמבטיה (לא עם sonicator קצה) לפני הדילול.
הערה: Sonication מומלץ לשבש אגרגטים micelle שהוקמו על ידי LPS שייתכן שלא לקשור כראוי לארח תאים.
- לדוגמא, לשמור LPS הקבוע ב 10 LPS ng לכל מיליליטר ולהשתנות הריכוז של γ IFN- (0, 1 יחידה / מיליליטר, 10 יחידות / מיליליטר, 100 יחידות / מיליליטר, 1,000 יחידות / מיליליטר). שמור IFN- γ קבוע ב 100 יחידות / מיליליטר ולהשתנות הריכוז של LPS (0, 0.1 ng / ml, ng / 1 מיליליטר / מיליליטר, 10 ng, 100 ng / ml). מניית LPS בקצרה sonicate למשך 2 דקות בליחימום בsonicator אמבטיה (לא עם sonicator קצה) לפני הדילול.
- 4 שעות לאחר ההתחלה של התרבות המשותפת בין הטפילים ומקרופאגים חסיד בתא השקופיות, לבטל את תקשורת D10 בכל חדר ולהחליף אותו עם 300 μl של דילולים המתאימים של γ IFN- וLPS בתקשורת D10. כולל שליטה בתקשורת D10 רק להעריך שכפול טפיל בהיעדר הפעלת מקרופאג.
- שקופיות קאמריות מחדש כיסוי עם כיסוי תא השקופית והמקום בחממה ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 ל24-30 שעות נוספות.
הערה: זמן דגירה תלוי בזמן ההכפלה של מתח טפיל מהסוג בר שיכול לנוע 6-12 שעות בהתאם לזן הטפיל. נקודת זמן שנבחרה לפני טפילה תמוגה של מקרופאגים הנאיביים אבל מספיק זמן כדי לאפשר לפחות 3-4 douבלינג פעמים. - הפוך פתרון פורמלדהיד 2.5% ב מלוח של Dulbecco פוספט (PBS). מחק את התקשורת בתא השקופיות ולהחליף עם 300 μl של תמיסת פורמלדהיד 2.5%. תקן עבור 20 דקות ב RT.
- שקופית שטיפה (ים) פעמיים עם 300 μl של PBS לכל תא. לכל שטיפה, לבטל את PBS בשקופית ולהוסיף PBS החדש בעדינות את הפנים הפנימיים של כל תא שקופית כדי למנוע שיבוש מקרופאגים דבקים לשקופית. להוסיף 300 μl של PBS לכל תא ותא בכיסוי מקום שקופית כדי למנוע שקופיות מהתייבשות לפני מכתים.
הערה: ניתן להציב שקופיות ב 4 C עד 3 ימים בשלב זה לפני מכתים. - פרוטוקול מכתים לט זיהוי gondii על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence (IFA).
- הפוך 0.2% בPBS פתרון Triton X-100 (חיץ permeabilization). מניחים את הפתרון בצינור במערבולת 37 אמבט המים ° C ובקצרה זה כדי להבטיח את Triton X-100 לפתרון הולך. מחק אתPBS בשקופיות הקאמרית ולהחליף עם 300 μl של חיץ permeabilization. השאר בRT למשך 30 דקות.
- הפוך פתרון של סרום עיזים 10% בPBS (פתרון חסימה). מחק את חיץ permeabilization בשקופית ולהחליף עם 300 μl של חסימת פתרון לכל תא. השאר בRT למשך 30 דקות.
הערה: עגל בסרום עוברי ניתן להחליף לעז בסרום בכל הפרוטוקולים מכתים. - לפרוטוקול מכתים IFA צעד אחד, לעשות דילול 1: 1000 של נוגדן fluorescently- מצומדות לט גונדי בחסימת פתרון. הסר פתרון חסימה מהשקופיות ולהוסיף 150 μl של פתרון נוגדנים לכל תא. החלף כיסוי להחליק על תא שקופית כדי למנוע מתאים מהתייבשות. דגירה עבור שעה 1 ב RT.
הערה: ריכוז נוגדן צריכה להיקבע באופן אמפירי בהתאם למקור. נוגדן נרכש מצומדות ישירות לfluorochrome או מוצמד לfluorochrome על ידי המשתמש.- לצביעת IFA שני שלביםפרוטוקול עם נוגדן unconjugated לט גונדי ונוגדנים משני מצומדות fluorescently, מגלשות כתם עם 150 μl של נוגדן ראשוני unconjugated נגד T. גונדי בחסימת מאגר לשעה 1 בRT. לשטוף 3x עם 300 μl של PBS בתוספת 1% עזים בסרום (חיץ לשטוף).
- להוסיף 150 μl של נוגדנים משני fluorescently- מצומדות ספציפי למינים ממוצא לנוגדן הראשוני. החלף כיסוי להחליק על תא שקופית כדי למנוע מתאים מהתייבשות. דגירה עבור שעה 1 ב RT.
- מגלשות יש לשטוף 3x עם PBS בתוספת 1% עזים בסרום (חיץ כביסה). לכל שטיפה, להסיר את הפתרון בשקופיות הקאמרית על ידי הצפת השוק את התוכן שלה ולהחליף עם 300 μl של חיץ כביסה.
- שקופיות שטיפה 2x עם 300 μl של PBS.
- הסר את התא מהשקופית הקאמרית לפי הוראות יצרן.
- הר שקופיות עם ההרכבה מדיה המכילה DAPI (4'6-diamidino-2-פנילאינדול, dilactate) וx 50 מ"מ coverslip 22 מ"מ.
- בדוק שקופיות באמצעות ניגוד שלב ומיקרוסקופ פלואורסצנטי. לקבוע את המספר הממוצע של טפילים לvacuole על ידי בחינה מינימאלית של 100 לכל תא PVS גם. המנה הנבחרת של γ IFN- וLPS עבור המסך צריכה להיות מספיק כדי לדכא, אבל לא למנוע, שכפול של טפילים מסוג בר (ראה איור 1).
2. בידוד של טפיל מוטאנטים עם הפעלה בעקבות פגם כושר של המקרופאגים מאשרום
הערה: ספרייה של ט 'האקראי מוטציות gondii נדרש עבור מסך הגנטיקה קדימה. mutagenesis אקראי של ט ' ניתן לבצע gondii ידי כימי (ENU / EMS) או mutagenesis insertional 27,28,38. בעקבות mutagenesis, טפילי שיבוט על ידי הגבלת דילול ולגדול שיבוטים בודדים ב96-גם צלחות המכילות תאי HFF חסיד בהיקף של 200 μl של תקשורת D10 32,38.זה קריטי, כי יש לי 96-גם צלחות להקרנה של טפילים במקרופאגים על ידי מיקרוסקופ תחתית אופטית כדי לאפשר הקרנה מיקרוסקופית. בניגוד השלב ומיקרוסקופ פלואורסצנטי להקרנה מוכתם 96-גם צלחות דורשים מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך עם ניגוד שלב 4, 10, 20 או אובייקטיבי 40X המצויד למרחקים עבודה ארוכים. מטרת 4X היא שימושי בהצגה כולה, אבל גם רזולוציה טובה יותר של הטפילים מושגת במטרה 20X.
- ההעברה 50 μl של מוטציות tachyzoite גדלו בתאי HFF ומחוברות בצלחות תרבית רקמה 96-גם לשני לשכפל צלחות 96-היטב המכילות מקרופאגים המופק ממוח עצם העכברי (1-2 שבועות לאחר בידוד) בתקשורת של D10 100 μl.
הערה: בצע את המסך הראשוני ב96-גם צלחות של הטפיל המבוסס על נפח של תרבות טפילה כדי להימנע מהצורך לספור את מספר הטפילים הועברו לכל אחד. לפיכך, הניתוח מיקרוסקופי 2.6 מבוסס על איכותי whethאה טפילים בדרך כלל משוכפלים או לא משוכפל. שלב 3 מתאר את הגישה כדי לאשר את הפנוטיפ של מוטציות בשקופיות קאמריות באמצעות מספר שווה של סוג בר או טפילי מוטציה להדביק מקרופאגים.- להוסיף ישירות טפילים לתקשורת D10 כבר בכל טוב. להדביק שתי בארות עם tachyzoites סוג בר כביקורת חיובית עבור שכפול טפיל.
- מניחים את התאים הנגועים לחממה (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2) במשך 4 שעות כדי לאפשר לטפילי זמן לפלוש לתאים וליצור PV.
- הסר את המדיה מצלחת אחת על ידי שהשליך את תוכן הצלחת. השתמש להעיף יחיד של שורש כף היד לזרוק התקשורת בצלחת לכיור נזרק מכיל cidal חומר ניקוי לטפילים.
- הוספה של "תקשורת הפעלת מקרופאג" 100 μl באמצעות אגן סטרילי לתקשורת ופיפטה רבה. השתמש בריכוז האופטימלי של LPS וIFN-γ נקבע משלב 1 לmacתקשורת הפעלת rophage. בדומה לכך להסיר תקשורת מצלחת השליטה כפולה ולהחליף עם של תקשורת D10 100 μl.
- מניחים את התאים הנגועים לחממה (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2) עבור 24-30 שעות נוספות.
- פרוטוקול מכתים עבור 96-גם צלחות לIFA.
- מחק את התקשורת בצלחת ולהחליף עם של פורמלדהיד 2.5% ב PBS 100 μl. דגירה של 20 דקות ב RT. השתמש באגן סטרילי לפורמלדהיד ופיפטה רבה.
- מחק את פתרון פורמלדהיד בצלחת ולהוסיף 100 μl PBS לשטוף פורמלדהיד מהצלחת.
- מחק את הפתרון בצלחת ולהוסיף למאגר permeabilization 100 μl (PBS עם 0.2% Triton X-100) היטב כל אחד. דגירה למשך 30 דקות ב RT.
- מחק את הפתרון בצלחת ולהוסיף לפתרון חסימה (PBS עם סרום עיזים 10%) 100 μl היטב כל אחד. דגירה למשך 30 דקות ב RT.
- מחק את הפתרון בעמ 'מאוחר. הוסף 50 μl / היטב ט אנטי fluorescently מצומדות- נוגדן gondii בדילול 1: 1,000 ב PBS בתוספת 1% עזים בסרום. דגירה עבור שעה 1 ב RT עם כיסוי הצלחת על ועל כיסא נדנדה.
- לחלופין להשתמש בנוגדן ראשוני unconjugated נגד T. גונדי ואחרי צביעה עם נוגדנים משני fluorescently- מצומדות כפי שתואר ב1.10.3.1.
- מחק את פתרון הנוגדן בצלחת ולהחליף עם 100 μl / טוב של PBS בתוספת 1% עזים בסרום. לבצע שטיפת 3x זה ואחריו 2 שטיפות נוספות עם PBS לבד. השאר 200 μl של PBS היטב כל אחד ולהחליף את המכסה על הצלחת גם 96 כדי למנוע את הבארות מייבוש.
הערה: הצלחת עם הכיסוי על יכול להיות עטוף בparafilm והניחו על 4 מעלות צלזיוס עד 3 ימים לפני ניתוח על ידי מיקרוסקופ.
- לבחון תאים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך באמצעות מטרת 20-40X. מוטציות בחרו שלשכפל בna ו# 239; ve צלחת מקרופאג אבל בעיקר לא מצליח לשכפל מעבר טפיל אחד / vacuole ב" מקרופאגים מופעלים "או שמופיע אמורפי או מושפל ב" מקרופאגים מופעלים".
הערה: מספר טפילים מסוג בר לvacuole יהיה תלוי במינון של IFN-γ וLPS משמש אך באופן אידיאלי היא סביב 4 טפילים לvacuole; מספר המשקף דיכוי צמיחה אך לא עיכוב מלא של שכפול על ידי גירוי ההפעלה.
3. להעריך מוטאנטים כדי לקבוע אם הפגם הוא ברמה של הישרדות טפיל או שכפול בעקבות הפעלה של המקרופאגים מאשרום
- ההעברה נבחרה מוטציות טפילה מ96-גם צלחות (תוכן של כל גם) לT25s המכיל תאי HFF ולאפשר שכפול.
- מקרופאגים מח עצם תרבות נגזרים O / N ב 8 שקופיות זכוכית קאמרית בריכוז של 3 × 10 5 תאים / מיליליטר ב -250 μl של תקשורת D10. הכן שקופית אחת כדי להשוות paשכפול rasite במקרופאגים הנאיביים ושקופיות נוספות כדי להשוות שכפול טפיל לאחר הפעלה של מקרופאגים הנגועים.
- טפילי tachyzoite קציר ולספור בhemocytometer. הוסף 5 × 10 4 T. גונדי טפילים לתא המכיל גם מקרופאגים בתקשורת D10 ותרבות במשך 4 שעות. כולל גם אחד עם טפילים הוריים סוג בר כביקורת. לחסן שקופיות לשכפל זהות עם אותו שיבוט הטפיל שלא יקבל מדיה הפעלה על מנת לעקוב אחר השכפול של טפילים במקרופאגים הנאיביים.
- בטל תקשורת D10 מ1 של השקופיות קאמריות לשכפל ולהחליף עם 250 μl של "תקשורת הפעלה". בטל תקשורת D10 מהשקופית הקאמרית לשכפל אחרת ולהחליף עם 250 μl של תקשורת D10. דגירה שני ושקופיות "מופעלות" "נאיביות" מקרופאג עם כיסוי תא שקופיות על על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 לadditiשעה 24-30 onal.
- לתקן, Permeabilize, ושקופיות בלוק עבור מכתים IFA וניתוח של טפילים כפי שמתואר בשלב 1. לבצע מכתים IFA עם התאים שלמים.
- תאי Co-כתם עם נוגדנים לlysosomal 1 קרום קשור (LAMP1) או Lysotracker ונוגדן לט גונדי להעריך האם הפעלה של מקרופאגים הנגועים מפעילה היתוך של PVS המוטציה עם lysosomes (איור 4).
- השתמש נוגדנים לתאים / אברונים מסוימים בתוך הטפיל / PV עבור מכתים על ידי IFA לזהות שינויים במוטצית הטפיל הניכרים הראשון שלאחר הפעלת מקרופאג 28.
הערה: שינויים כאלה עשויים לספק תובנות לגבי המנגנון שבבסיס ההישרדות / השכפול הלקוי של המוטציה לאחר הפעלת מקרופאג.
- בדוק שקופיות באמצעות מיקרוסקופיה אובייקטיבית וקרינת 100X שמן שלב.
- להעריך שכפול טפיל על ידי קביעתמספר הטפילים לPV 100 vacuoles האקראי. לבצע לפחות 2 סעיפים של 100 vacuoles כל לניתוח סטטיסטי.
- להעריך מורפולוגיה כללית טפילה באמצעות שני ניתוח הקרינה, כמו גם מיקרוסקופ לעומת שלב. צפה בטפילים תחת מטרת 100x שלב. טפילים בריאים טפילים סגורים בחוזקה בתוך vacuole parasitophorous צמוד. טפילים שיש לי vacuoles המרווח אמורפי עם חישוקים צפופים שלב או טפילי אמורפי מציעים מוות טפיל ולא רק פגם בשכפול (איורים 1 ו 3).
4. להעריך אם הרגישות של Mutant טפילים להפעלה של המקרופאגים Infected קשורה מגשרים אנטי-מיקרוביאלי ידוע
- לבודד מקרופאגים נגזרות מח עצם מעכברי C57 / BL6 סוג בר, iNOS - / -, gp91-phox - / - או Irgm1 / Irgm3 - / - עכברי 32.
- מק מח עצם המתאים תרבות נגזרrophages O / N ב 8 שקופיות זכוכית קאמרית בריכוז של 3 × 10 5 תאים / מיליליטר ב -250 μl של תקשורת D10.
- להמשיך עם אתגר טפיל, מכתים IFA, וניתוח כפי שתואר בשלב 3.
- לקבוע אם היכולת של טפילי המוטציה לשרוד ולשכפל לאחר ההפעלה של מקרופאגים הנגועים משוחזרת בהעדר חמצן פעיל או מיני חנקן או חסינות ספציפית הקשורים GTPases 28.
- השתמש סוכנים תרופתיים, כגון תורמי תחמוצת חנקן, כדי להעריך אם מתווכים אנטי-מיקרוביאלי הספציפיים מספיקים בעצמם לפגוע בטפילי מוטציה בתאי HFF או מקרופאגים נאיביים או אם הם פועלים רק בתיאום עם מתווכים אחרים של הפעלת מקרופאגים 28.
5. להעריך אם הפגם בזיהום הכרוני Mutant טפיל הפשרות
- לבודד tachyzoites מסוג בר, מוטציה או טפילי גן נמחק ממוקדים גדל בשיתוף T25sntaining תאי HFF. טפילים יש lysed טרי מתרבויות HFF.
- רוזן טפילים באמצעות hemocytometer. טפילים גלולים בפתרון הנקס המאוזן מלח (HBSS) בריכוז מתאים לכל מיליליטר למנה תת-קטלני של הטפיל מועבר ב200 μl על ידי הזרקת intraperitoneal (IP).
- השתמש במזרק טוברקולין 1 מיליליטר ומחט 25 G להזריק טפילים עם 200 μl נפח intraperitoneally (IP). המינון תלוי בזן הפראי הסוג של הטפיל וגנוטיפ העכבר.
הערה: אני גנוטיפים סוג של הטפיל הם קטלניים לעכברים בשלב החריף של זיהום ללא קשר למינון טפיל ואינם מתאימים ללימודים של זיהום כרוני בהעדר כימותרפיה לט גונדי לדכא את התרבות טפילה. - שלושים ימים לאחר אתגר טפיל, להקריב את העכברים על ידי שאיפה של CO 2 מטנק בלחץ בתא צפוף (כלוב עכבר בגודל סטנדרטי עשוי להכיל לא יותר מ -5 מ 'קרח) ואחריו נקע בצוואר הרחם.
- לבודד את המוח מהעכבר באמצעות נהלים שנקבעו 41-43.
- הנח את העכבר על הצד הקדמי שלה. לרסס את הראש עם 70% אתנול ללחטא את האזור.
- השתמש במספריים חדים לחתוך את גזע המוח. השתמש במספריים לנתח לעשות חתך רדוד רוחבי סביב הימני ולאחר מכן בצד השמאל של הגולגולת החלה מהבסיס של גזע המוח. שימוש במלקחיים כדי לקלף בעדינות את הגולגולת כדי לחשוף את המוח.
- רם בעדינות את המספריים המוח ומקום בין המוח ובסיס הגולגולת לחתוך את עצב ההרחה לשחרר את המוח. הרם את המוח עם מלקחיים סטרילית או מרית ומניחים בצלחת פטרי בקטריולוגית המכילה 10 מיליליטר של PBS סטרילי.
- חותך את המוח במחצית עם אזמל סטרילי דרך המרכז בין הימין ושמאל האונות.
- להוסיף מחצית מהמוח למרגמה קטנה המכילה 1 מיליליטר של PBS. השתמש במכתש ועלי ללהפוך את ההשעיה רקמה עדינה של המוח שיכול לעבור בקצה פיפטה μl רחב נשא 20-200.
הערה: החצי השני של המוח צריכה להיות קבוע בפורמלין 2.5% עבור שעה 1 אם סעיפי רקמות נחוצים לhistopathology. - מקום lysate המוח 100 μl בצינור 1.7 מיליליטר microcentrifuge. הוסף 1 מיליליטר של פורמלדהיד 2.5% ב PBS לתוך הצינור המכיל את lysate המוח כדי לתקן את ההשעיה המוח לצביעה. לדגור על RT למשך 30 דקות.
- צנטריפוגה lysate ב 8000 XG במשך 5 דקות בmicrocentrifuge וזורקים supernatant בזהירות.
- הוסף 1 מיליליטר של permeabilization / חיץ חסימה לlysate (סרום עיזים 10%, 0.2% Triton X-100 ב PBS). לדגור על RT למשך 30 דקות.
- lysate צנטריפוגה ב 8000 XG במשך 5 דקות ולהסיר supernatant.
- הוסף 200 μl של FITC מצומדות- לַבלָב biflorus agglutin (DBA). השתמש 1: של הקטינים בPBS בתוספת 10% עזים בסרום 100 דילול. בעדינות resuspend lysate ידי pipetting. דגירהעבור שעה 1 ב RT.
הערה: DBA הוא יגנד שנקשר לCST1 על קיר ציסטה הטפיל. - lysate צנטריפוגה ב 8000 XG במשך 5 דקות וזורקי supernatant. הוסף 1 מיליליטר של PBS לגלולה. לדגור על RT במשך 5 דקות. חזור על לשטוף 3x PBS. הסר את supernatant הבא לשטוף הסופי באמצעות פיפטה.
- השתמש קצה פיפטה μl רחב נשא 20-200 להכין 5 μl של lysate המוח המוכתם ומניחים על שקופיות מיקרוסקופ. הר השקופיות עם 25 x 25 מ"מ מכסה להחליק ליצור הר רטוב של lysate המוח. לעשות 3 שקופיות לשכפל באמצעות 5 μl של מוח lysate כל אחד.
- לספור את מספר ציסטות לכל aliquot 5 μl על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות מטרת 10X (איור 6).
הערה: ציסטות חלקם גדולים (8 או יותר טפילים כ) וחלקן קטן מאוד (1-2 טפילים לציסטה). לספור את מספר כולל של ציסטות לכל מספר שקופיות אבל מסמך של גדול לעומת מספר של ציסטות קטנות. - הוסף את מספר det ציסטותהשתקף בשלושה aliquots 5 μl שונה ומתרבים על ידי הגורם הכולל דילול x 2 (רק חצי מהמוח נעשה לlysate) כדי להעריך את המספר של ציסטות הכוללת למוח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Toxoplasma gondii משכפל בחופשיות במקרופאגים הנאיביים ויש לו זמן הכפלה בין 6-12 שעות, בהתאם לזן של הטפיל. איור 1 מציג טפילי נציג בנאיבי לעומת מקרופאגים המופק ממוח עצם הופעלו. איור 2 מציג את המורפולוגיה הכללית של טפילים בHFF לארח תאים ב 2, 4, 8, 16 ו -32 טפילים / PV. בפרוטוקול הנוכחי, הטפיל מותר לפלוש למקרופאגים הנאיביים ולהקים vacuole המתהווה parasitophorous (PV) לפני המסירה של גירוי הפעלה חזק, LPS וIFN-, למקרופאגים הנגועים. במודל זה, שכפול של טפילים מסוג בר מואט, אבל שכפול טפיל עדיין ממשיך לכ 24 שעות שבמהלך הזמן מקרופאגים הופכים בהדרגה יותר מיומנים בעיכוב שכפול טפיל. המסך מיועד לפעול כמודל תחרות שונה בין הזמן הדרוש למקרופאג חזקctivation לעומת הזמן שבו טפיל מהסוג בר או מוטציה טפיל יכול להמשיך לשכפל בתוך PV. הצעד הראשון במסך הוא לבחור מנה של LPS וIFN- γ שישמש להפעלה של מקרופאגים הנגועים. המינון נקבע באופן אמפירי על ידי הערכת שכפול טפיל במקרופאגים מופעלים גם עם מינון קבוע של γ IFN- בשילוב עם מגוון רחב של ריכוזי LPS או מינון קבוע של LPS עם מגוון של IFN- ריכוזים (שלב 1). המינון של גירויי ההפעלה צריך להיות מוערך לטפילים מהסוג בר ההוריות המשמשים ליצירת מוטציות טפילה על ידי mutagenesis הכימי או insertional. באופן אידיאלי במינון של γ LPS וIFN- יאפשר שכפול טפיל לממוצע של 2-8 טפילים לשעת 24-30 PV לאחר ההפעלה לעומת 8-16 טפילים לPV במקרופאגים הנאיביים (איורים 1 ו -2).
ברגע שהריכוז המתאים של LPS וIFN- ^7; נקבע, מוטציות מוקרנות בצלחות תרבית רקמה תחתונה אופטי 96-היטב. התחתון האופטיים בצלחות חשובה כי אי סדרים בפלסטיק המשמש לצלחות תרבית רקמה מסורתיות עושה את זה קשה להשיג את הרזולוציה המתאימה למסך טפילים על ידי ניגוד שלב ומיקרוסקופ פלואורסצנטי. בניגוד השלב ומיקרוסקופ פלואורסצנטי של 96-גם הצלחות גם דורש מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך עם ניגוד שלב 4, 10, או 20 40x אובייקטיבי מצוידים למרחקים עבודה ארוכים. מוטציות מוקרנות בצלחות לשכפל מכילות מקרופאגים המופק ממוח עצם עכברי. אחרי אתגר עם מוטציות טפילים, מקרופאגים נגועים בבארות של צלחת אחת מופעלים עם LPS וγ IFN- תוך הצלחת אחרת המכילה מקרופאגים נגועים היא בתרבית רק תקשורת D10. צלחות טופחו על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ל24-30 שעות לאחר תוספת של γ LPS וIFN-. לאחר דגירה, תאים fiהיה קבוע, מוכתם לטפילים ונותח על ידי התאחדות לכדורגל בשתי הקרינה ומיקרוסקופ לעומת השלב. מוטציות נבחרות שיש לי מספרים רגילים טפילים ושכפול במקרופאגים הנאיביים אבל פחות טפילים או vacuoles קטן יותר עם פחות טפילים במקרופאגים נגועים שמופעלים. ברגע שמוטציות נבחרו הם צריכים להיות rescreened בשקופיות קאמריות (שלב 3) בנאיביים והופעלו מקרופאגים בשני ניסויים בלתי תלויים על מנת לאפשר ניתוח של מורפולוגיה טפיל בהגדלות גדולות יותר (אובייקטיבי 100X ונפט) וכדי לוודא שיש להם כפול רגיל במקרופאגים הנאיביים אבל פגם בשכפול / הישרדות לאחר הפעלת מקרופאג.
פנוטיפים של מוטציות עם פגמים בהתנגדות להפעלה של מקרופאגים הנגועים בדרך כלל מתחלקים לשתי קטגוריות רחבות: טפילים המופיעים מורפולוגית שלמה, אך אינם מסוגלים לשכפל מעבר טפיל יחיד לכל PV; וטפילים הנחזות להיות degraded ויכול להיות גם בPVS המרווח אמורפי (איורים 1 ו 3). המורפולוגיה וultrastructure של הטפיל וPV נראים במיטבו בשקופיות באמצעות מטרת 100X ונפט ועל ידי מיקרוסקופ לעומת שלב בשילוב עם ניתוח הקרינה. הכתמה של טפילים לIFA עם נוגדנים לחלבון lysosomal הקרום-1 (LAMP1) קשור שימושית כדי לקבוע אם הפגם במוטציה מזוהה עם חוסר יכולת של PV כדי למנוע התמזגות עם lysosomes. שמוצג באיור 4 הוא טפיל בתוך phagolysosome (LAMP1 חיובי) לעומת טפיל שהוא בPV כי הוא נפרד במידה רבה ממערכת endocytic של התא המארח (LAMP1 שלילי). Phagolysosome ניכר על ידי שפה מוצקה רציפה של LAMP1 מתאמצת מסביב לכל הטפיל. בניגוד לכך, PV לעתים קרובות יש אברונים הליזוזום בסביבה, אבל לא שפה רציפה של מכתים LAMP1 סביב היקפה. השימוש בנוגדנים להוגדרו מבנים / אברונים תוך tהוא טפיל ו / או PV שימושי במעקב מחקרי IFA לזהות אנומליות בכל מוטציה הקשורים הפעלה של מקרופאגים הנגועים. חקירות כאלה עם נוגדנים עשויות לספק תובנות לגבי המנגנונים העומדים בבסיס הפגם שכפול / הישרדות במוטציה. לדוגמא, איור 5 מראה את ט mitochondrion gondii מוכתם נוגדן חד שבטי אנטי-F1 מקטע 5F4 ATPase בטא (מתנה מסוג פיטר ברדלי) 24 שעות לאחר ההפעלה של מקרופאגים נגועים בטפילים מסוג בר או מוטציות טפילים. ט גונדי היה שיתוף מוכתם עם חד שבטי נגד T. נוגדן גונדי. ט סוג בר יש גונדי mitochondrion יחיד המשתרע סביב ההיקף של הטפיל. mitochondrion הבלעדי של הטפיל בטפילים מסוג בר לאחר הפעלה של מקרופאגים הנגועים היה שלם בהשוואה לmitochondrion מקוטע בטפילי מוטציה. פיצול המיטוכונדריה היה ניכר לא רק במושפל / אמורפיטפילים, אלא גם בטפילים שמוצגים מורפולוגיה נורמלית כפי שהוערך על ידי מיקרוסקופ לעומת שלב. הדבר מצביע על כך הפגם במוטצית הטפיל עלול להגביר את הרגישות של mitochondrion הטפיל לארח מתווכי תא הנגרמים על ידי הפעלת מקרופאג.
המודל הנוכחי משתמש בשילוב של γ IFN- וLPS כדי להפעיל מקרופאגים נגועים. γ IFN- מגרה את STAT1 גורם שעתוק. LPS, כמו TNF-α, מגרה את גורם שעתוק NF-κB. IFN- הידוע γ מתווכי מיקרוביאלית + תלויים חשובים בחסינות אוטונומית תא נגד T. גונדי כולל מערך של IFN- GTPases חסינות הקשורים + התלוי γ (IRGs, Gbps) ומיני חנקן וחמצן פעילים, בנוסף לסוכנים אחרים. על מנת לקבוע אם הפגם בכל מוטציה קשורה במיוחד עם ייצור של IFN- הידוע γ מתווכי מיקרוביאלית -inducible, מקרופאגים המופק ממוח עצם מבודדים מiNOS - / -, 91 gp phox - / - עכברים או ספציפיים IRG / GBP גן נמחק וassayed לפעילות נגד טפילי המוטציה. השילוב של γ IFN- וLPS כדי להפעיל מקרופאגים נגועים מעדיף תוצאות במוטציות עם רגישות משופרת לתחמוצת חנקן בהשוואה לסוג בר טפילי 28.
הפעלה של מקרופאגים הנגועים יכולה לגרום להתמיינות שלב של הטפילים מtachyzoites לbradyzoites הכלולים בציסטות רקמה. ציסטות כזה אופייניות לדלקת כרונית. לפיכך, מוטציות טפילים שפגומות לשכפול / הישרדות לאחר הפעלה של מקרופאגים הנגועים יכולות להיות גם פגומות להמרה לציסטות בזיהום in vivo. על מנת להעריך ייצור ציסטה בזיהום כרוני, עכברים מאותגרים intraperitoneally (IP) עם מינון לא קטלני של הזן הטפיל הורים או שיבוט המוטציה. ציסטות בטווח המוח בגודל של פחות מ -10 _6;. מ 'קוטר ליותר מ -50 מיקרומטר, כפי שמוצג באיור 6 ספירת שתי ציסטות קטנות וגדולות על ידי IFA אבל לשמור העבירות נפרדות על מנת לקבוע אם המוטציה הטפיל הינה פגומה לסך ייצור ציסטה או סתם להקמה ותחזוקה של ציסטות גדולות.
איור 1. מקרופאגים המופק ממוח עצם העכברי נאיביים הם מתירנית לשכפול ט גונדי אבל הפעלה עם γ IFN- וLPS באופן משמעותי מעכבים שכפול. vacuole parasitophorous (PV) של ט 'מהסוג בר () גונדי 24 שעות לאחר הפלישה של מקרופאגים נגזרות מח עצם עכברי הנאיביים. (B) PV של ט 'מהסוג בר גונדי טפילים מורכב מארבעה טפילים לvacuole 24 שעות לאחר ההפעלה של מקרופאגים הנגועים.(ג) דוגמא של טפיל מוטציה הצליח לחזור על תוצאות ועדיין בטפיל אחד / PV 24 שעות לאחר ההפעלה של מקרופאגים הנגועים. (ד) דוגמא לטפיל מוטציה שנראית מושפל בתוך שעות PV 24 אמורפי לאחר ההפעלה של מקרופאגים הנגועים . השורה העליונה מציגה תמונות שלב של הטפילים והשורה התחתונה מציגה תמונות ניאון באמצעות אנטי-סרום polyclonal נגד T. גונדי. סרגל קנה המידה מייצג 5 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. שכפול טפיל הוערך על ידי מספר הטפילים לPV. התמונות מראות 2, 4, 8, 16 ו -32 לטפילים PV בתאי HFF. כל תמונה היא תמונת שלב ממוזגת הבתערוכות מכתים נוגדן polyclonal של הטפיל באדום וגרעין HFF בכחול (DAPI). סרגל קנה המידה מייצג 5 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
מוטאנטים איור 3. להציג מגוון של פנוטיפים לאחר הפעלה של מקרופאגים הנגועים. העמודה משמאל היא תמונת שלב של הטפיל במקרופאגים, עמודת המרכז היא תמונת ניאון באמצעות נוגדן לט גונדי, והעמודה הימנית הוא מיזוג של השלב ותמונת ניאון. הטפיל מוצג בירוק וגרעין מקרופאג בכחול. סרגל קנה המידה מייצג 5 מיקרומטר. אנא לחץ כאן לצפייה גדולה יותרגרסה של נתון זה.
צביעת 4. LAMP1 איור מבדילה PVS מטפילים המכיל phagolysomes. טפילי מגואלות polyclonal אנטי ט נוגדן גונדי (אדום) וLAMP1 עם מב 1D4B (הירוק). חץ מסמן PV טפיל שהתמזג עם lysosomes. הטפיל ללא החץ הוא בvacuole parasitophorous (PV) שלא התמזגו עם lysosomes. סרגל קנה המידה מייצג 5 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
5. טפילי סוג Wild איור לשמור mitochondrion שלם תוך mitochondriעל נפגע במוטציות טפילה לאחר הפעלה של מקרופאגים הנגועים. mitochondrion (ירוק) בטפילים מסוג בר (פנל עליון) בהשוואה לשלושה ט מוטציה שונה גונדי טפילים בשלבים שונים של השפלה (שלושה פנלים תחתון) 24 שעות לאחר ההפעלה של מקרופאגים הנגועים. סרגל קנה המידה מייצג 5 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 6. איתור של ציסטות טפיל במוח באמצעות לַבלָב FITC מצומדות- biflorus לקטינים. קיר ציסטה שכותרתו עם הקטינים מוצג בירוק. סרגל קנה המידה מייצג 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן לצפייה בVersio גדולn של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול המתואר מספק גישה הלא-משוחדת המשתמשת בהפעלה של מקרופאגים העכבריים עצם נגזר מח וגנטיקה קדימה לבודד ט מוטציות גונדי עם מום ביכולתם לשרוד הפעלה של מקרופאגים הנגועים. הפנוטיפ של הפעלת מקרופאג הבאה מוטציות בדרך כלל משתייך לאחת משתי קטגוריות רחבות: 1) הטפילים מופיעים בשלמותה, אבל לא מצליחים לשכפל מעבר טפיל 1 לPV; 2) הטפילים מופיעים מושפלים ועשויים להיות בPVS המרווח, אמורפי. העובדה שיש לי מוטציות פנוטיפ כמו טפילים מסוג בר במקרופאגים הנאיביים בהיעדר ההפעלה מוכיחה הפרוטוקול יכול דווקא לשמש לזיהוי מוטציות הבמיוחד לקויים ביכולתם להתנגד הפעלת מקרופאג. השימוש במקרופאגים נגזרות מח העצם עיקרי מומלץ לעומת שורת תאי 264.7 מקרופאג RAW למסך בגלל המורפולוגיה של הטפילים ומספר הטפיל לvacuole הם דמיינו בקלות רבה יותר במקרופאגים נגזרות מח עצם.
המסך המתואר בשילוב עם גנטיקה קדימה מספק כלי רב-תכליתי לנתח גני טפיל ומסלולי סופו של דבר גנטיים חשובים להתנגדות למתווכים ספציפיים של חסינות אוטונומית תא. מחקרי גנטיקה קדימה כאלה הם חשובים לזיהוי גנים טפילים שיכול להיות אחרי כמו מחרוזת להתחיל לפרום מסלולי טפיל חשובים להתנגדות מתווכי מיקרוביאלית ספציפיות הן במבחנה בפתוגנזה. קושי קודם עם גישות גנטיות קדימה היה זיהוי של גן מפתח שיבש בכל מוטציה. שלמת ספריית Cosmid בט גונדי כבר די יעיל לשלמה פונקציונלית של מוטציות חלוקת תא. עם זאת, העובדה שהשכפול של טפילים מסוג בר גם דוכא על ידי IFN-γ וLPS רק כדי מאשר מוטציות מידה פחותה, הופכת קשה יותר tha שלמה תפקודיתn למוטציות חלוקת תא. פרופיל מוטאציות הגנום כולו לשני מוטציות כימיות וinsertional בט גונדי התפתח לאחרונה כיצרני, ואפילו חסכוני, השדרה לזהות את הגנים אחראים לפנוטיפים של מוטציות במסכי גנטיקה קדימה 34,36,37,44. כתוצאה מכך, פרופיל מוטאציות הגנום כולו באמצעות רצף הדור הבא שיפר את השימושים האפשריים של mutagenesis הכימי של ט ' גונדי במחקרים גנטיים קדימה לזיהוי גנים חשובים לפונקציות ספציפיות. כגון גישת גנטיקה קדימה כמתואר בפרוטוקול הנוכחי הן חשובות כמו רוב הגנום של ט ' גונדי נשאר היפותטיים ברוב של גנים חזו שאין הומולוגיה לגנים אחרים או תחומים פונקציונליים שיכול לסייע בזיהוי של גני טפיל המועמד חשובים להעלמה חיסונית.
ניתוח IFA של 96 צלחות גם לא נחשב בדרך כלל הקרנת תפוקה גבוהה נפגשההוד. מניסיוננו זה סביר עבור אדם אחד להכתים ומסך 10 96-גם צלחות ביום או כ 960 מוטציות. בעיתון על ידי Skariah et al., כ -8,000 מוטציות נותחו ו -14 מוטציות עצמאיות היו מבודדות שפגעו באופן משמעותי להישרדות / שכפול במקרופאגים הנאיביים הופעלו אך לא 28. ההישרדות לקויה של מוטציות הייתה ברובה התוצאה של רגישות מוגברת לתחמוצת חנקן. ההגבלה בשיטה הכללית היא בעיקר ברמה של קבלת שיבוטים אחד של הטפיל ולא הקרנה על ידי מיקרוסקופ כמסך הראשוני ב 96 צלחות גם הוא איכותי ומהיר באופן סביר. אישור של הפנוטיפ של מוטציות שזוהו במסך של הצלחת גם 96 ואחריו בשלב 3 על ידי ניתוח כמותי ואיכותי באמצעות מקרופאגים בשקופיות קאמריות ועל ידי הוספת מספר שווה של סוג בר או טפילי מוטציה. השימוש בשיטות אנליטיות הקרנה אחרותכגון fluorometry ברמת האוכלוסייה של טפילים, ולא ברמת פרט הטפיל כפי שהוערך על ידי מיקרוסקופ, הם בעייתיים בפרוטוקול הנוכחי כרב של הטפילים מושפלים להכתים עם נוגדן polyclonal נגד T. גונדי וכחסון כמו טפילים מסוג בר עם ההבדל במוטציה להיות יותר איכותית מאשר כמותיים ברמה של עוצמת fluoresence. כמו כן, במינון של IFN-γ וLPS נדרש לבודד מוטנטים עם מום בהתנגדות להפעלה של תוצאות מקרופאגים נגועים בשכפול מודחק של טפילים מסוג בר אם כי בנקודות זמן מאוחר יותר. לכן, מדידה של מספר טפיל הכולל עבור מסך הגנטיקה קדימה כוללים השימוש בטפילים זורחים היא בעייתית. עם זאת, זה אפשרי הפרוטוקול מכתים יכול להתבטל בשלב ההקרנה אם השיבוטים טפילי ההורים משמשים לmutagenesis כימי או insertional הביעו ניאון או לוציפר מכונן או מושרהסמן ASE. הפרוטוקול המתואר באמצעות הקרנת IFA ומיקרוסקופיה של מקרופאגים ב 96 צלחות גם מאפשר בידוד של מוטציות פגומות להישרדות / שכפול במקרופאגים מופעלים אבל זה גם ברור מתגעגע כמה מוטציות פוטנציאליות בשל הרזולוציה המיקרוסקופית המוגבלת השגה באמצעות פורמט הצלחת 96-גם בהחלטה זו vacuoles הנפוח אמורפי שלהכתים לאנטיגן טפיל עלול להיחשב בטעות לטפילים משכפלים בריאים בתוך PV רגיל. חילוף של 96 צלחות גם מכסה זכוכית, במקום 96 צלחות גם עם משטח אופטי, עשוי להשיג רזולוציה גבוהה יותר במהלך המסך של מקרופאגים הנגועים ב 96 צלחות גם.
רובם המכריע של מוטציות שזוהו באמצעות IFN-γ וLPS בפרוטוקול המתואר כדי להפעיל מקרופאגים בעקבות פלישה טפילה יש פגם ביכולתם להגן על עצמם מתחמוצת חנקן 28. בהקשר זה, למרות שהמסך נועד להיות לא-משוחד,עשוי להעשיר לבידוד של מוטציות טפילה עם רגישות מוגברת למתווכי מיקרוביאלית ספציפיים בהתאם לתנאי ההפעלה, הסוג והמין של מקרופאגים והעיתוי של פלישה טפילה ביחס להפעלת מקרופאג שנבחרו למסך. כך תא החיסון המולדים שנבחר למסך וגירויי ההפעלה מיושמים הם פרמטרים קריטיים המשפיעים על הסוג של מתווכי מיקרוביאלית שלמוטציות טפילים התוצאה עשויות להיות רגיש. גנוטיפ של הטפיל הוא גם פרמטר קריטי כסוג אני גנוטיפים של הטפיל הוא עמיד יחסית לGTPases חסינות קשורה (IRGs) נגרם בתגובה לIFN-γ תוך השני ושלישי גנוטיפים סוג רגישים יותר 26,45,46. בפרוטוקול המתואר, מקרופאגים מופעלים לאחר פלישה טפילה. למרות גנוטיפ Type II, מתח Prugnaud, המשמש במסך המתואר הוא רגיש לפעולה של GTPases חסינות קשור,llowing הטפיל לפלוש מקרופאגים מאפשר שכפול של טפילים מסוג בר ראשון לפני גיוס מלא של IRGs. כמו כן, לא ברור שIRGs יעיל נגד הטפיל אם הם נגרמים במקרופאגים לאחר פלישה טפילה וייזום של שכפול.
הפרוטוקול המתואר משתמש מקרופאגים לזיהוי גני טפיל חשובים להתנגדות לIFN-γ תלוי מתווכים של חסינות אוטונומית תא, במיוחד תחמוצת חנקן. הבידוד של בריכה של מוטציות טפילים שחולקות רגישות ניכרת לתחמוצת חנקן, כמו גם הפנוטיפ משותף של פיצול המיטוכונדריה תחמוצת חנקן תלוי מספק מערך ייחודי של כלים לזיהוי גני טפיל ומסלולים חשובים להתנגדות לתחמוצת חנקן ועל הבנה הפעולה של תחמוצת חנקן באופן רחב יותר נגד T. גונדי ופרוטוקול אחר pathogens.The אוקריוטים תאר עם שינויים קלים יכולים לשמש לStudie גנטיקה קדימהים לזיהוי גני טפיל חשובים להתנגדות למתווכים שונים של חסינות אוטונומית תא. שינויים אפשריים כוללים שינוי הסוג של תא מארח הנגועים, גירויי ההפעלה, או העיתוי ביחס להפעלה טפילה פלישה. לדוגמא, לפני ההפעלה של מקרופאגים העכבריים עם IFN-γ לפני תוספת של טפילים הייתה לגרום להפעלה של GTPases חסינות בנושא. מודל כזה יכול לשמש לזיהוי גני טפיל בסוג אני גנוטיפים של ט ' גונדי שעשוי לתרום להתנגדות בתיווכו של ROP18 וROP5 לGTPases קשור חסינות 24,25. מתווכים של חסינות אוטונומית תא נגד T. גונדי בתאים חיסוניים מולדים אדם אינם מוגדר, כמו גם במכרסמים. לפיכך, השימוש במונוציטים בדם היקפי אדם למסך מוטציות כימיות של ט ' גונדי עשוי לזהות שני גני הטפיל חשובים להישרדות במהלך הדבקת בני אדם בתאי מערכת חיסון מולדים, כמו גם מנגנונים חשובים בבני האדם for התנגדות מיקרוביאלית לט גונדי. גני טפיל חשובים להתנגדות למתווכי מיקרוביאלית ספציפיים יכול להיות מזוהה על ידי בידוד מוטנטים לא מסוגלים לשרוד חשיפה של תאי מארח נגועים לסוכנים תרופתיים כגון מיני חמצן או חנקן תגובתי. בדומה לכך הפרוטוקול יכול להיות שונה כדי לבודד מוטציות טפילים עם רגישות מוגברת לinflammasome הפעלה 47-49 או גירוי של הקולטנים ATP purinergic מקרופאג 50.
יחדיו, הפרוטוקולים מתארים גישה באמצעות קדימה גנטיקה ותאי חיסון מולדים לבודד מוטנטים טפילים חשובים לט התנגדות gondii לIFN-γ תלוי חסינות אוטונומית תא. חשוב לציין, הגישה שהציגה הוא תכליתי וניתן לשנות בקלות לבודד את הגנים טפיל חשובים להתחמקות מתווכי מיקרוביאלית ספציפיים, הישרדות טפיל בסוגים מסוימים של תאי מארח או התנגדות ללחץ encounte תנאיםאדום במהלך טוקסופלזמוזיס. יתר על כן, גני טפיל חשובים להתנגדות הפעלת תא מארחת במקרים רבים עשויים גם לשחק תפקיד באופן ישיר או באופן עקיף בייצור ציסטה in vivo במהלך הדבקה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Hyclone | SH3008101 | https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog Id=29101&productId=3255471&dis type=0&highlightProductsItemsFlag =Y&fromSearch=1&searchType= PROD&hasPromo=0 |
| Hyclone FBS | Thermo | SH3091003 | https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog Id=29104&productId=11737973&dis type=0&highlightProductsItemsFlag =Y&fromSearch=1&searchType= PROD&hasPromo=0 |
| Hyclone DPBS | Thermo | SH3002802 | https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog Id=29104&productId=2434305&dis type=0&highlightProductsItemsFlag =Y&fromSearch=1&searchType =PROD&hasPromo=0 |
| Hyclone L-glutamine | Thermo | SH3003401 | https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog Id=29104&productId=3311957&dis type=0&highlightProductsItemsFlag =Y&fromSearch=1&searchType =PROD&hasPromo=0 |
| Hyclone Pen strep | Thermo | SV30010 | https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/fsproductdetail?storeId=10652&productId=1309668 6&catalogId=29104&matchedCat No=SV30010&fromSearch=1& searchKey=SV30010&highlightPro ductsItemsFlag=Y&endecaSearch Query=%23store%3DRE_SC%23nav%3D0%23rpp%3D25%23offSet%3D0%23keyWord%3DSV30010%2B%23searchType%3DPROD%23SWKeyList%3D%5B%5D&xrefPartType=From&savings= 0.0&xrefEvent=1407777949003_0 &searchType=PROD&hasPromo=0 |
| Hyclone Hanks BSS | Thermo | SH3003002 | https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog Id=29104&productId=3064595&dis type=0&highlightProductsItemsFlag =Y&fromSearch=1&searchType= PROD&hasPromo=0 |
| LPS | LIST biologicals | 201 | http://www.listlabs.com/products-tech.php?cat_id=4&product_id=81&keywords =LPS_from_%3Cem%3EEscherichia_coli%3C/em%3E_O111:B4 |
| IFN-γ | Pepro Tech Inc | 50-813-664 | https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?itemdetail='item'&storeId=10652& productId=2988494&catalogId=29 104&matchedCatNo=50813664& fromSearch=1&searchKey=murine+ifn+pepro+tech&highlightProductsItemsFlag =Y&endecaSearchQuery=%23store%3DRE_SC%23nav%3D0%23rpp%3D25%23offSet%3D0%23keyWord%3Dmurine%2Bifn%2Bpepro%2Btech%23searchType%3DPROD%23SWKeyList%3D%5B%5D&xrefPartType=From&savings =0.0&xrefEvent=1407778210608_ 12&searchType=PROD&hasPromo =0 |
| Chamber slides | Thermo | 177402 | https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog Id=29104&productId=2164545&dis type=0&highlightProductsItemsFlag =Y&fromSearch=1&searchType= PROD&hasPromo=0 |
| 96-well optical plates | Thermo | 165306 | https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog Id=29104&productId=3010670&dis type=0&highlightProductsItemsFlag =Y&fromSearch=1&searchType= PROD&hasPromo=0 |
| 96-well tissue culture plates | Fisher | 353072 | https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog Id=29104&productId=3158736&dis type=0&highlightProductsItemsFlag =Y&fromSearch=1&searchType= PROD&hasPromo=0 |
| Tissue culture flast T25 | Fisher | 156367 | https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/fsproductdetail?storeId=10652&productId=127039 67&catalogId=29104&matchedCat No=12565351&fromSearch=1& searchKey=156367&highlightProdu ctsItemsFlag=Y&endecaSearchQu ery=%23store%3DRE_SC%23nav%3D0%23rpp%3D25%23offSet%3D0%23keyWord%3D156367%23searchType%3DPROD%23SWKeyList%3D%5B%5D&xrefPartType=From&savings =0.0&xrefEvent=1407778974800_ 0&searchType=PROD&hasPromo =0 |
| Ted Pella EM grade formaldehyde | Ted Pella | 18505 | http://www.tedpella.com/chemical_html/chem3.htm#anchor267712 |
| Triton X-100 | Fisher | BP151 | https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog Id=29104&productId=3425922&dis type=0&highlightProductsItemsFlag =Y&fromSearch=1&searchType= PROD&hasPromo=1 |
| Alexa 488 - protein conjugation kit | Life Technologies | A20181 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/A10235 |
| goat serum | MP Biomedicals | ICN19135680 | https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog Id=29104&productId=2133236&dis type=0&highlightProductsItemsFlag =Y&fromSearch=1&crossRefData =ICN19135680=2&searchType =PROD&hasPromo=0 |
| Vectashield mounting media | Vector Labs | H1200 | https://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=428 |
| FITC-conjugated dolichos | Vector Labs | FL-1031 | https://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=188 |
| Antibody to LAMP1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | http://dshb.biology.uiowa.edu/LAMP-1 | |
| LysoTracker | Life Technologies | L-7526 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/L7526?ICID=search-product |
| C57BL6 mice | Jackson Laboratories | 664 | http://jaxmice.jax.org/strain/000664.html |
| gp91 phox knock out mice | Jackson Labaoratories | 2365 | http://jaxmice.jax.org/strain/002365.html |
| iNOS knock out mice | Jackson Laboratories | 2609 | http://jaxmice.jax.org/strain/002609.html |
| sodium nitroprusside | ACROS Organics | AC21164-0250 | https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog Id=29104&productId=2627727&dis type=0&highlightProductsItemsFlag =Y&fromSearch=1&searchType= PROD&hasPromo=1 |
| DETA NONOate | ACROS Organics | AC32865-0250 | https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog Id=29104&productId=2252389&dis type=0&highlightProductsItemsFlag =Y&fromSearch=1&searchType= PROD&hasPromo=1 |
| Monoclonal mouse anti-Toxoplasma gondii Ab | Fitzgerald Industries International | 10T19A | http://1degreebio.org/reagents/product/1069274/?qid=652947 |
References
- Scharton-Kersten, T. M., Yap, G., Magram, J., Sher, A. Inducible nitric oxide is essential for host control of persistent but not acute infection with the intracellular pathogen Toxoplasma gondii. J Exp Med. 185 (7), 1261-1273 (1997).
- Schluter, D., et al. Inhibition of inducible nitric oxide synthase exacerbates chronic cerebral toxoplasmosis in Toxoplasma gondii-susceptible C57BL/6 mice but does not reactivate the latent disease in T. gondii-resistant BALB/c mice. J Immunol. 162 (6), 3512-3518 (1999).
- Khan, I. A., Matsuura, T., Fonseka, S., Kasper, L. H. Production of nitric oxide (NO) is not essential for protection against acute Toxoplasma gondii infection in IRF-1-/- mice. J Immunol. 156 (2), 636-643 (1996).
- Khan, I. A., Schwartzman, J. D., Matsuura, T., Kasper, L. H. A dichotomous role for nitric oxide during acute Toxoplasma gondii infection in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (25), 13955-13960 (1997).
- Mordue, D. G., Desai, N., Dustin, M., Sibley, L. D. Invasion by Toxoplasma gondii establishes a moving junction that selectively excludes host cell plasma membrane proteins on the basis of their membrane anchoring. J Exp Med. 190 (12), 1783-1792 (1999).
- Mordue, D. G., Sibley, L. D. Intracellular fate of vacuoles containing Toxoplasma gondii is determined at the time of formation and depends on the mechanism of entry. J Immunol. 159 (9), 4452-4459 (1997).
- Coppens, I., et al. Toxoplasma gondii sequesters lysosomes from mammalian hosts in the vacuolar space. Cell. 125 (2), 261-274 (2006).
- Joiner, K. A., Fuhrman, S. A., Miettinen, H. M., Kasper, L. H., Mellman, I. Toxoplasma gondii: fusion competence of parasitophorous vacuoles in Fc receptor-transfected fibroblasts. Science. 249 (4969), 641-646 (1990).
- Dobrowolski, J. M., Sibley, L. D. Toxoplasma invasion of mammalian cells is powered by the actin cytoskeleton of the parasite. Cell. 84 (6), 933-939 (1996).
- Kim, S. K., Fouts, A. E., Boothroyd, J. C. Toxoplasma gondii dysregulates IFN-gamma-inducible gene expression in human fibroblasts: insights from a genome-wide transcriptional profiling. J Immunol. 178 (8), 5154-5165 (2007).
- Lang, C., et al. Impaired chromatin remodelling at STAT1-regulated promoters leads to global unresponsiveness of Toxoplasma gondii-Infected macrophages to IFN-gamma. PLoS Pathog. 8, e1002483 (2012).
- Kim, L., Butcher, B. A., Denkers, E. Y. Toxoplasma gondii interferes with lipopolysaccharide-induced mitogen-activated protein kinase activation by mechanisms distinct from endotoxin tolerance. J Immunol. 172 (5), 3003-3010 (2004).
- Leng, J., Butcher, B. A., Egan, C. E., Abdallah, D. S., Denkers, E. Y. Toxoplasma gondii prevents chromatin remodeling initiated by TLR-triggered macrophage activation. J Immunol. 182 (1), 489-497 (2009).
- Leng, J., Denkers, E. Y. Toxoplasma gondii inhibits covalent modification of histone H3 at the IL-10 promoter in infected macrophages. PLoS One. 4, e7589 (2009).
- Seabra, S. H., de Souza, W., DaMatta, R. A. Toxoplasma gondii partially inhibits nitric oxide production of activated murine macrophages. Exp Parasitol. 100 (1), 62-70 (2002).
- Butcher, B. A., et al. Toxoplasma gondii rhoptry kinase ROP16 activates STAT3 and STAT6 resulting in cytokine inhibition and arginase-1-dependent growth control. PLoS Pathog. , e1002236 (2011).
- Ong, Y. C., Reese, M. L., Boothroyd, J. C. Toxoplasma rhoptry protein 16 (ROP16) subverts host function by direct tyrosine phosphorylation of STAT6. J Biol Chem. 285 (37), 28731-28740 (2010).
- Saeij, J. P., et al. Toxoplasma co-opts host gene expression by injection of a polymorphic kinase homologue. Nature. 445 (7125), 324-327 (2007).
- Jensen, K. D., et al. Toxoplasma polymorphic effectors determine macrophage polarization and intestinal inflammation. Cell Host Microbe. 9 (6), 472-483 (2011).
- Rosowski, E. E., et al. Strain-specific activation of the NF-kappaB pathway by GRA15, a novel Toxoplasma gondii dense granule protein. J Exp Med. 208 (1), 195-212 (2011).
- Bougdour, A., et al. Host cell subversion by Toxoplasma GRA16, an exported dense granule protein that targets the host cell nucleus and alters gene expression. Cell Host Microbe. 13 (4), 489-500 (2013).
- Braun, L., et al. A Toxoplasma dense granule protein, GRA24, modulates the early immune response to infection by promoting a direct and sustained host p38 MAPK activation. J Exp Med. 210 (10), 2071-2086 (2013).
- El Hajj, H., et al. ROP18 is a rhoptry kinase controlling the intracellular proliferation of Toxoplasma gondii. PLoS Pathog. 3, e14 (2007).
- Etheridge, R. D., et al. The Toxoplasma Pseudokinase ROP5 Forms Complexes with ROP18 and ROP17 Kinases that Synergize to Control Acute Virulence in Mice. Cell Host Microbe. 15 (5), 537-550 (2014).
- Niedelman, W., et al. The rhoptry proteins ROP18 and ROP5 mediate Toxoplasma gondii evasion of the murine, but not the human, interferon-gamma response. PLoS Pathog. 8, e1002784 (2012).
- Zhao, Y., et al. Virulent Toxoplasma gondii evade immunity-related GTPase-mediated parasite vacuole disruption within primed macrophages. J Immunol. 182 (6), 3775-3781 (2009).
- Mordue, D. G., Scott-Weathers, C. F., Tobin, C. M., Knoll, L. J. A patatin-like protein protects Toxoplasma gondii from degradation in activated macrophages. Mol Microbiol. 63 (2), 482-496 (2007).
- Skariah, S., Bednarczyk, R. B., McIntyre, M. K., Taylor, G. A., Mordue, D. G. Discovery of a novel Toxoplasma gondii conoid-associated protein important for parasite resistance to reactive nitrogen intermediates. J Immunol. 188 (7), 3404-3415 (2012).
- Zhao, Z., et al. Autophagosome-independent essential function for the autophagy protein Atg5 in cellular immunity to intracellular pathogens. Cell Host Microbe. 4, 458-469 (2008).
- Bohne, W., Heesemann, J., Gross, U. Reduced replication of Toxoplasma gondii is necessary for induction of bradyzoite-specific antigens: a possible role for nitric oxide in triggering stage conversion. Infect Immun. 62 (5), 1761-1767 (1994).
- Bohne, W., Heesemann, J., Gross, U. Induction of bradyzoite-specific Toxoplasma gondii antigens in gamma interferon-treated mouse macrophages. Infect Immun. 61 (3), 1141-1145 (1993).
- Tobin, C., Pollard, A., Knoll, L. Toxoplasma gondii cyst wall formation in activated bone marrow-derived macrophages and bradyzoite conditions. J Vis Exp. (42), 2091 (2010).
- Gajria, B., et al. ToxoDB: an integrated Toxoplasma gondii database resource. Nucleic Acids Res. 36, D553-D556 (2008).
- Farrell, A., et al. Whole genome profiling of spontaneous and chemically induced mutations in Toxoplasma gondii. BMC Genomics. 15, 354 (2014).
- Farrell, A., et al. A DOC2 protein identified by mutational profiling is essential for apicomplexan parasite exocytosis. Science. 335 (6065), 218-221 (2012).
- Brown, K. M., et al. Forward genetic screening identifies a small molecule that blocks Toxoplasma gondii growth by inhibiting both host- and parasite-encoded kinases. PLoS Pathog. 10, e1004180 (2014).
- Jammallo, L., et al. An insertional trap for conditional gene expression in Toxoplasma gondii: identification of TAF250 as an essential gene. Mol Biochem Parasitol. 175 (2), 133-143 (2011).
- Coleman, B. I., Gubbels, M. J. A genetic screen to isolate Toxoplasma gondii host-cell egress mutants. J Vis Exp. (60), 3807 (2012).
- Trouplin, V., et al.
- Sibley, L. D., Adams, L. B., Fukutomi, Y., Krahenbuhl, J. L. Tumor necrosis factor-alpha triggers antitoxoplasmal activity of IFN-gamma primed macrophages. J Immunol. 147 (7), 2340-2345 (1991).
- Navone, S. E., et al. Isolation and expansion of human and mouse brain microvascular endothelial cells. Nat Protoc. 8 (9), 1680-1693 (2013).
- Pino, P. A., Cardona, A. E. Isolation of brain and spinal cord mononuclear cells using percoll gradients. J Vis Exp. Feb. (48), 2348 (2011).
- Walker, T. L., Kempermann, G. One mouse, two cultures: isolation and culture of adult neural stem cells from the two neurogenic zones of individual mice. J Vis Exp. (84), e51225 (2014).
- Eidell, K. P., Burke, T., Gubbels, M. J. Development of a screen to dissect Toxoplasma gondii egress. Mol Biochem Parasitol. 171 (2), 97-103 (2010).
- Fentress, S. J., et al. Phosphorylation of immunity-related GTPases by a Toxoplasma gondii-secreted kinase promotes macrophage survival and virulence. Cell Host Microbe. 8 (6), 484-495 (2010).
- Fleckenstein, M. C., et al. A Toxoplasma gondii Pseudokinase Inhibits Host IRG Resistance Proteins. PLoS Biol. 10, e1001358 (2012).
- Cirelli, K. M., et al. Inflammasome sensor NLRP1 controls rat macrophage susceptibility to Toxoplasma gondii. PLoS Pathog. 10, e1003927 (2014).
- Ewald, S. E., Chavarria-Smith, J., Boothroyd, J. C. NLRP1 is an inflammasome sensor for Toxoplasma gondii. Infect Immun. 82 (1), 460-468 (2014).
- Gorfu, G., et al. Dual role for inflammasome sensors NLRP1 and NLRP3 in murine resistance to Toxoplasma gondii. MBio. 5 (1), (2014).
- Lees, M. P., et al. P2X7 receptor-mediated killing of an intracellular parasite, Toxoplasma gondii, by human and murine macrophages. J Immunol. 184 (12), 7040-7046 (2010).
