Introduction
Токсоплазма (T.gondii,) является облигатным внутриклеточным, протозойная патоген. Это возбудитель токсоплазмоза, опасность для здоровья у ослабленных лиц. Это также модель системы для других apicomplexan патогенов, поражающих человека, включая Cryptosporidium и циклоспора. Токсоплазмоз чаще приобрела при проглатывании пищи или воды, зараженной bradyzoite или ооцист стадии паразита. При приеме внутрь, эти этапы преобразования на сцену tachyzoite паразита, который воспроизводит в клетках-хозяевах и распространяет системно. Т-клетки, IFN-γ и, в меньшей степени, окиси азота 1-4, имеют важное значение для контроля инфекции, но не способны устранить заболевание, как доля тахизоитов преобразовать в стадии bradyzoite, которые защищены в тканевых кист в результате чего долгоживущих хронической инфекции. В самом деле, нет терапия эффективна против хронической кисты сщество заболевания. Тяжелая токсоплазмоз чаще всего из-за реактивации хронической инфекции, от стадии bradyzoite паразита преобразования обратно в быстро тиражирование tachyzoite стадии, характерной для начального и острой инфекции.
В начале выживаемости в условиях врожденного иммунного ответа важно, чтобы паразит чтобы достичь достаточного количества паразитов, а также достичь дистальных участков, чтобы позволить создание хронической инфекции. Т. гондий превратилась стратегии по противодействию защитными механизмами, которые, вероятно способствуют ее способности к репликации и распространения в начале инфекции. Во-первых, Т. гондий образует уникальную PV в течение паразита вторжения, которое в значительной степени отделены от эндоцитических и exocytic процессов в клетке-хозяине по сравнению с другими внутриклеточными патогенными микроорганизмами 5-9. Кроме того, как всех успешных внутриклеточных патогенов Т. гондий изменяет свою клетку-хозяина, чтобы создать питательную среду Fили рост. Это включает в себя экспрессию генов клетки-хозяина перепрограммирования изменения факторов клетка-хозяин транскрипции в том числе важная для урегулирования активации клеток 10-15. ROP16 16-19, GRA15 20, 21 и GRA16 GRA24 22 все было показано, что важную роль в регуляции транскрипции реакцию и сигнализации клеток каскады клеток-хозяев, инфицированных T. гондий. Последние исследования с использованием генетических скрещиваний штаммов паразитов с различными фенотипами были весьма продуктивными в выявлении паразитов гены, которые лежат в основе паразитов генотипов в зависимости от качества, включая уклонение от иммунитета, связанных с ГТФ (IRGs) 16,19,23-26. У мышей, связанных с помехоустойчивостью GTPases (IRGs) имеют решающее значение для контроля типа II и III генотипов паразита в то время как очень вирулентных типа I генотипы развивались механизмы, чтобы избежать мышиных IRGs. Тем не менее, это также ясно, что паразит развили механизмы, чтобы избежать антимикробной СМИТЗ в дополнение к IRGs и что некоторые из этих механизмов может быть сохранена через паразитов генотипов 27,28. Кроме того, очень мало известно о критических медиаторов клеточного иммунитета против автономного Т. гондий во время человеческой токсоплазмоза. Parasite гены, важные для устойчивости к медиаторам клеточного автономного иммунитета также может быть важным для выживания во время tachyzoite в bradyzoite преобразования, которые также могут быть вызваны иммунной реакции. Например, оксид азота при высоких уровнях может подавить паразитов репликации в инфицированных макрофагах, но он также может стимулировать tachyzoite чтобы bradyzoite преобразование полученного в производстве кисты 30-32.
ToxoDB является функциональная геномной базы данных для Т. гондий, который функционирует как критический ресурс для области с точки зрения предоставления информации последовательности для генома паразита, и доступ к опубликованной и неопубликованной геномной объемами данных, включая общинные аннотации, ген ехр ression и протеомики данных 33. Как и во многих протозойных патогенов, большинство генома состоит из гипотетических генов с-либо информация на основе генной гомологии дать представление о своих потенциальных функций. Таким образом, передние генетика мощный инструмент для идентификации новых генов паразита, важные для иммунной уклонения, преобразования кисты и других функций, важных для паразита патогенезе, а также для преобразования между различными стадиями развития. Дополнительная прочность вперед генетики является то, что он может быть использован как относительно не необъективной подхода опрашивать паразита, как в генах, которые важны для выполнения конкретных задач в патогенезе, в том числе иммунной уклонения и образованию кист. Последние достижения в области следующего поколения секвенирования для мутационного профилирования сделали это метод выбора для определения ответственного паразитов гены от передних ДНК-исследований с использованием как химического, так и инсерционного мутагенеза 34-37.
ntent "> Важно определить уязвимости в T.gondii, которые могут быть использованы для повышения эффективности клеточных автономных иммунных механизмов против паразита особенно те, которые могут быть активны в отношении устойчивых стадии кисты. С этой целью, в пробирке мышиные инфекции макрофагов и модель активации была разработана для идентификации мутаций в паразита, который специально ухудшает T.gondii, фитнес После активации инфицированных макрофагов, но не у наивных макрофагов. Этот экран макрофагов была использована, чтобы допросить библиотеку T.gondii, инсерционных мутантов, чтобы в конечном счете определить T.gondii, гены, важные для сопротивления оксида азота 27,28. обособлению панели T.gondii, мутантов с нарушениями резистентности к активации инфицированных макрофагов, в частности, к заметному чувствительности к окиси азота, доказали полезность экране, чтобы определить паразит гены, важные для сопротивлениячтобы медиаторов клеточного иммунитета автономной кроме механизмов сопротивления, описанных для мышиных IRGs 28. Инсерционного мутагенеза имеет преимущества по сравнению с химического мутагенеза в плане генерации ограниченное количество случайных мутаций в каждом клоне паразита и, в теории, простоты идентификации сайта мутации. Тем не менее, определение геномной сайт вставки плазмиды в Т. гондий инсерционные мутанты, на практике, было удивительно трудно во многих случаях 37. Введение плазмиды в ген также может нарушить функцию гена в отличие от химического мутагенеза, которые, как правило, приводит в единичных нуклеотидных замен. Тем не менее, химический мутагенез или с N-этил-N-нитрозомочевины (ЕНУ) или этилметансульфонатом (EMS) могут предложить повышенную способность к анализу большую часть генома паразита, по сравнению с инсерционного мутагенеза, так как он создает несколько полиморфизмов одного нуклеотида ( оценивается в 10 -100) в мутанта 34, 38. Кроме того, последние достижения в целый геном профилирования стало возможным использовать следующего поколения секвенирования для выявления наиболее вероятных генов-кандидатов, ответственных за выявленного фенотипа мутантного паразита 34,38. Независимо от подхода мутагенеза, подтверждение роли гена паразита в устойчивости к активации макрофагов в конечном счете, требует делеции гена и дополнения для выполнения постулаты Коха молекулярный.Способность анализировать функции гена посредством генетической манипуляции как паразита и макрофагов важно, так как многие из генов, идентифицированных с помощью форвардных генетики в T. гондий, а также другие патогены, по-прежнему характеризуется как гипотетических генов, практически не гомологии с другими белками с известными функций. В настоящем документе описаны общий подход, который может использоваться, чтобы определить, является ли значение для устойчивости к известной или нарушена гена в мутантанеизвестно медиатором клеточной автономной иммунитета. Первоначальный анализ принимающих антимикробных факторов осуществляется путем оценки выживаемости дикого типа и мутантных паразитов в макрофагах из мышей дикого типа по сравнению с теми, с конкретных генных делеций в индуцируемой синтазы оксида азота (Inos), GP-91 phox (NADPH-оксидаза) и Специфический иммунитет, связанных с GTPases (IRGs). Это позволит определить, если выявленные паразитов гены важны для устойчивости к окиси азота, реактивных промежуточных кислорода или иммунитет, связанных с ГТФ 28 соответственно, или если неизвестно иммунный механизм участвует. Активация макрофагов инфицированных как с IFN-γ и ЛПС, описанных в данном протоколе, приводит, прежде всего, в изоляции генов, важных для резистентности паразита к окиси азота 28. Использование фармакологических агентов, которые индуцируют оксида азота в отсутствие активации макрофагов (доноры оксида азота) подтвердил, что большинство генов, идентифицированных имеют важное значение для повторногопомощь в разработке оксида азота, а не окиси азота в концерте с дополнительными посредников, связанных с активацию макрофагов 28.
Шаг один и два описания вперед экран генетики разработанный, чтобы изолировать паразита мутантов с фитнес-дефекта следующей активации мозга, полученных макрофагов инфицированных костных в пробирке. Шаг один описывает анализ титрования дозы эмпирически определить дозу IFN-γ и ЛПС использовать для активации макрофагов, что снижает паразитную репликацию, но не полностью ингибировать репликацию дикого типа T. гондий родительский штамм, который используется для создания библиотеки паразитов мутантов. Шаг два описывает генетическую вперед экран мутантных клонов в макрофагах в 96-луночных планшетах. Шаг третий описывает подход, чтобы подтвердить фенотип каждого мутанта, указанного в экране луночных планшетах 96 и оценить, влияет ли дефект в каждом мутанта выживание паразита, репликацию,или производства киста в ответ на активацию макрофагов. Шаг четыре описывает использование мозга, полученных от макрофагов костей мышей с делеций в конкретных антимикробных путей для выявления иммунные медиаторы, к которому паразит мутант специально чувствительны. Шаг пятый очерчивает подход для определения, если паразит мутант также угрозу для патогенеза в естественных условиях, как оценивается производства кисты в мозге зараженных мышей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Все протоколы, которые связаны с использованием животных были проведены в соответствии с руководящими принципами и правилами, установленными уходу и использованию животных комитета Нью-йоркского медицинского колледжа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Детальный протоколы для химического мутагенеза 38, изоляции от паразитов, ограничивая разбавления 38, выделение мышиных полученных костного мозга макрофагов 39, рост Т. гондий в фибробластов крайней плоти человека (HFF) клеток и киста производство в макрофагах и базовый анализ иммунофлюоресценции (IFA) 32 ссылки. Провести все культуры клеток при 37 ° С в 5% СО 2 в D10 носителя (Игла в модификации высокого уровня глюкозы Дульбекко, дополненной 10% фетальной телячьей сыворотки, 2 мМ L-глутамина, 100 ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина) , Держите все реагенты стерильные всей клеток выделений и в клеточной культуре.
1. Доза титрования ИФН-γ и ЛПС, чтобы определить Концations использовать для активации Зараженные макрофаги для экрана вперед генетики
- Культура мышиный из костного мозга макрофаги O / N в восьми камера стеклах при концентрации 3 × 10 5 клеток / мл в 250 мкл D10 средствах массовой информации в камере. Используйте макрофаги 1:59-недель после выделения из костного мозга.
ПРИМЕЧАНИЕ: Камерные слайды приобрели, которые имеют рост, усиливающие RS мыть. - Использование гемоцитометра для подсчета диких паразитов типа собранные фибробластов крайней плоти человека (HFF) клеток, выращенных в культуре колбу Т25 ткани. Ресуспендируют паразитов в концентрации 5 × 10 5 диких паразитов типа на мл в средах D10. Эта концентрация приведет к множественности инфекции приблизительно 1: 1, как макрофаги будут получили широкое распространение O / N. Используйте полистирола или ПЭТ трубы для всех манипуляций с паразитами как паразит прилипает к полипропилена.
- Снимите D10 СМИ в камере слайдов и заменить 250 мклподвеска диких паразитов типа. Аккуратно добавить паразита подвески для каждой камеры слайда, позволяя ей течь вниз внутреннюю поверхность каждой камеры. Не позволяйте макрофаги высохнуть в любой точке во время протокола.
- Крышка отсека скользит заражены паразитами с крышкой камеры слайд и место в термостате при 37 ° С в 5% СО 2 в течение 4 ч, чтобы дать время для паразита для вторжения и установить PV.
- Сделать разведения ЛПС и IFN-γ в 1 мл D10 СМИ в стерильные пробирки для титрования дозы. Для дозы титрования держать либо ЛПС или IFN-постоянная концентрация и изменять другие стимулы 40.
- Например, поддерживать постоянное LPS в концентрации 10 нг LPS на мл и варьировать концентрацию IFN-γ (0, 1 единица / мл, 10 ед / мл, 100 ед / мл, 1000 единиц / мл). Хранить IFN-γ на постоянном уровне 100 единиц / мл и варьировать концентрацию LPS (0, 0,1 нг / мл, 1 нг / мл, 10 нг / мл, 100 нг / мл). Кратко обработать ультразвуком ЛПС акции в течение 2 мин безотопление в ванной ультразвуком (не с наконечником для обработки ультразвуком) до разбавления.
Примечание: Обработка ультразвуком рекомендуется, чтобы разрушить агрегаты, образованные мицелл ЛПС, которые не могут связываться должным к клеткам-хозяевам.
- Например, поддерживать постоянное LPS в концентрации 10 нг LPS на мл и варьировать концентрацию IFN-γ (0, 1 единица / мл, 10 ед / мл, 100 ед / мл, 1000 единиц / мл). Хранить IFN-γ на постоянном уровне 100 единиц / мл и варьировать концентрацию LPS (0, 0,1 нг / мл, 1 нг / мл, 10 нг / мл, 100 нг / мл). Кратко обработать ультразвуком ЛПС акции в течение 2 мин безотопление в ванной ультразвуком (не с наконечником для обработки ультразвуком) до разбавления.
- 4 ч после начала совместного культивирования между паразитами и прикрепленных макрофагов в камере слайда, отказаться от D10 средств массовой информации в каждой камере и заменить его 300 мкл соответствующих разведений IFN-γ и ЛПС в D10 СМИ. Включить контроль только с D10 сред для оценки паразита репликации в отсутствие активации макрофагов.
- Re-крышку отсека слайды с крышкой камеры слайд и место в инкубаторе при 37 ° С в 5% СО 2 в течение 24 до 30 дополнительных часов.
Примечание: Время инкубации зависит от времени удвоения дикого типа паразита штамма, который может находиться в диапазоне от 6-12 ч в зависимости от штамма паразита. Момент времени выбирается до паразитировать лизис наивных макрофагов, но достаточно долго для того, чтобы по крайней мере 3-4 доураз Bling. - Сделать 2,5% раствора формальдегида в фосфатном буферном солевом растворе Дульбекко (PBS). Откажитесь от средств массовой информации в камере стекло и заменить 300 мкл 2,5% раствора формальдегида. Исправить в течение 20 мин при комнатной температуре.
- Промыть слайдов (ы) в два раза с 300 мкл PBS в камере. Для каждого полоскания, отбросить PBS на слайде и добавить новый PBS осторожно вниз по внутренней поверхности каждого слайда камеры, чтобы избежать прерывания макрофаги, прилипших к слайда. Добавить 300 мкл PBS за камерой и место покрова на камеры слайд, чтобы предотвратить слайды от высыхания до окрашивания.
Примечание: Слайды могут быть помещены при 4 ° С в течение 3 дней в этой точке до окрашивания. - Протокол окрашивания для Т. гондий обнаружение иммунофлюоресценции микроскопии (IFA).
- Сделать 0,2% раствора Triton X-100 в PBS (буферный пермеабилизации). Поместите раствор в трубке в 37 ° C на водяной бане и кратко вихря его, чтобы убедиться Triton X-100 переходит в раствор. ОтменитьPBS в камере слайдов и заменить 300 мкл буфера пермеабилизации. Оставить при комнатной температуре в течение 30 мин.
- Сделать раствор 10% козьей сывороткой в PBS (блокирующий раствор). Откажитесь буфер пермеабилизирующего в стекло и заменить 300 мкл блокирующего раствора на камеру. Оставить при комнатной температуре в течение 30 мин.
Примечание: эмбриональная сыворотка теленка может быть заменен на козьей сывороткой во всех протоколов окрашивания. - Для протокола окрашивания IFA в один шаг, чтобы в разведении 1: 1000 в флуоресцентно-конъюгированных антител к T. гондий в блокировании решения. Удалите блокирующий раствор, из слайда и добавить 150 мкл раствора антитела на камеру. Замените крышку слайд на камеры слайд, чтобы предотвратить клетки от высыхания. Инкубировать в течение 1 ч при комнатной температуре.
Примечание: Антитела концентрация должна быть определены эмпирически в зависимости от источника. Антитело приобрести непосредственно конъюгирован с флуорохромом или конъюгированный с флуорохромом пользователем.- Для двухступенчатой IFA окрашиванияПротокол с неконъюгированного антитела к T. гондий и флуоресцентно конъюгированными вторичными антителами, пятен слайды с 150 мкл первичного неконъюгированного антитела против T. гондий в блокирующем буфере в течение 1 часа при комнатной температуре. Промыть 3 раза с 300 мкл PBS + 1% козьей сыворотки (промывочный буфер).
- Добавить 150 мкл флуоресцентно-конъюгированным вторичным антителом, специфичным для данного вида происхождения для первичного антитела. Замените крышку слайд на камеры слайд, чтобы предотвратить клетки от высыхания. Инкубировать в течение 1 ч при комнатной температуре.
- Промыть слайды 3x с PBS + 1% козьей сыворотки (стиральная буфера). Для каждого полоскания, удаления раствора в камере слайдов, сваливая его содержимое и заменить 300 мкл промывочного буфера.
- Промыть слайдов 2x 300 мкл PBS.
- Снимите камеру из камеры слайд в соответствии с указаниями изготовителя.
- Гора слайды с монтажной средах, содержащих DAPI (4'6-диамидино-2-фенилиндол, dilactate) и 22 мм х 50 мм покровным.
- Проверьте слайды с помощью фазового контраста и флуоресцентной микроскопии. Определить среднее число паразитов в вакуоли, исследуя, как минимум, 100 клипов в камере также. Выбранный доза IFN-γ и ЛПС на экране должно быть достаточно, чтобы подавить, но не предотвратить, репликацию дикого типа паразитов (рисунок 1).
2. Выделение Parasite мутантов с Фитнес дефектов После активации инфицированных макрофагов
ПРИМЕЧАНИЕ: библиотека случайной Т. гондий мутанты требуется для экрана вперед генетики. Случайный мутагенез Т. гондий может быть выполнена с помощью химических (RUS / EMS) или инсерционного мутагенеза 27,28,38. После мутагенеза, клон паразитов путем лимитирующего разведения и расти индивидуальных клонов в 96-луночных планшетах, содержащих прилипшие клетки HFF в объеме 200 мкл сред D10 32,38.Очень важно, что 96-луночные планшеты для скрининга паразитов в макрофагах микроскопии имеют оптические основания, позволяющие микроскопический скрининг. Фазового контраста и флуоресцентной микроскопии для скрининга окрашивали 96-луночных требует перевернутую флуоресцентного микроскопа с фазовым контрастом 4, 10, 20 или 40 раз цель, оборудованной для долгих рабочих расстояниях. 4X цель полезно для видя весь, но лучше разрешение паразитов достигается с целью 20X.
- Передача 50 мкл tachyzoite мутантов, выращенных в вырожденных HFF клеток в культуре 96-луночных тканевых в два реплицировать 96-луночные планшеты, содержащие мозга, полученных макрофаги мышиный кости (1-2 недели после выделения) в 100 мкл D10 сред.
Примечание: Выполнение начальный экран в 96-луночных планшетах паразита на основе объема паразита культуры, чтобы избежать того, чтобы подсчитать количество паразитов, передаваемых в каждую лунку. Таким образом, анализ микроскопии в 2,6 основан качественно на whethэ паразиты, как правило, воспроизведение или не реплицируются. Шаг 3 описывает подход, чтобы подтвердить фенотип мутантов в камере слайдов с помощью равное количество дикого типа или мутантов паразитов инфицировать макрофаги.- Непосредственно добавить паразитов к D10 СМИ уже в каждую лунку. Infect две скважины с диким тахизоитов типа в качестве положительного контроля для паразита репликации.
- Поместите инфицированных клеток в инкубатор (37 ° C и 5% CO 2) в течение 4 ч, чтобы позволить паразитам времени проникают в клетки и создавать их PV.
- Удалить носитель из одной пластины сброса содержимого пластины. Используйте один флип запястья, чтобы сбросить СМИ в пластине в колоду бассейна, содержащего моющих средств фунгицидного для паразитов.
- Добавить 100 мкл "активации макрофагов массовой информации", используя стерильный таз для СМИ и многоканальной пипетки. Используйте оптимальной концентрации ЛПС и IFN-γ определяется, начиная с шага 1 для Macrophage активации массовой информации. Аналогичным образом снимите бумагу из дублированного управления плиты и заменить 100 мкл D10 СМИ.
- Поместите инфицированных клеток в инкубатор (37 ° С и 5% CO 2) в течение дополнительного 24-30 ч.
- Протокол окрашивания для 96-луночных планшетах для ИФА.
- Откажитесь от средств массовой информации в своей тарелке и заменить 100 мкл 2,5% формальдегида в PBS. Инкубировать в течение 20 мин при комнатной температуре. Использование стерильный резервуар для формальдегида и многоканальной пипетки.
- Откажитесь от раствора формальдегида в плите и добавить 100 мкл PBS для промывания формальдегида из плиты.
- Отменить решение в пластине и добавить 100 мкл пермеабилизации буфере (PBS с 0,2% Triton X-100) в каждую лунку. Инкубировать в течение 30 мин при комнатной температуре.
- Отменить решение в пластине и добавить 100 мкл блокирующего раствора (PBS с 10% козьей сывороткой) в каждую лунку. Инкубировать в течение 30 мин при комнатной температуре.
- Отменить решение в рпоздно. Добавить 50 мкл / лунку флуоресцентно-сопряженного анти Т. гондий антитела разводили 1: 1000 в PBS + 1% козьей сыворотки. Инкубировать в течение 1 ч при комнатной температуре с крышкой на пластине и на качалке.
- Также можно использовать неконъюгированный первичного антитела против T. гондий последующим окрашиванием с флуоресцентно-конъюгированным вторичным антителом, как описано в 1.10.3.1.
- Отменить решение антител в пластине и заменить 100 мкл / лунку PBS + 1% козьей сыворотки. Выполните эту полоскания 3 раза с последующим 2 дополнительных полосканий в одиночку PBS. Оставьте 200 мкл PBS в каждую лунку и заменить крышку на 96-луночного планшета, чтобы предотвратить скважин от высыхания.
ПРИМЕЧАНИЕ: плита с крышкой на можно завернуть в парафильмом и помещены в 4 ° С в течение 3 дней перед анализом с помощью микроскопа.
- Проверьте клетки под перевернутой флуоресцентного микроскопа, используя цели 20-40X. Выберите мутанты, которые копируют НС и# 239; ве макрофагов пластины, но преимущественно не повторить за одним паразитом / вакуоли в "активированными макрофагами", или что появляются аморфные или деградировали в "активированными макрофагами".
ПРИМЕЧАНИЕ: количество диких паразитов типа в вакуоли будет зависеть от дозы ИФН-γ и ЛПС использовать, но в идеале составляет около 4 паразиты в вакуоли; число, которое отражает подавление роста, но не полное подавление репликации с помощью стимулов активации.
3. Оценка мутантов определить, если дефект находится на уровне паразита выживания или репликации После активации инфицированных макрофагов
- Передача выбран паразитов мутантов с 96-луночные планшеты (содержание всей скважины), чтобы T25s, содержащих HfF клетки и позволяет репликации.
- Культура костного мозга, полученные макрофаги O / N в 8 камера стеклах при концентрации 3 × 10 5 клеток / мл в 250 мкл D10 СМИ. Подготовка одного слайда, чтобы сравнить годовыхrasite репликации в наивных макрофагов и дополнительный слайд сравнить паразитов репликацию После активации инфицированных макрофагов.
- Урожай tachyzoite паразиты и рассчитывать в гемоцитометре. Добавить 5 × 10 4 Т. гондий паразитов в камеру лунку, содержащую макрофаги в D10 средств массовой информации и культуры в течение 4 часов. Включите одну скважину с дикого типа родительских паразитов в качестве контроля. Привить идентичный REPLICATE слайд с той же паразита клона, которые не будут получать активации массовой информации в целях мониторинга репликации паразитов у наивных макрофагов.
- Отменить D10 СМИ от 1 из повторных камеры слайдов и заменить 250 мкл "активации массовой информации". Отменить D10 носитель из другого повторной камеры стекло и заменить 250 мкл D10 СМИ. Выдержите как "активный" и "наивной" макрофагов слайд с камерой слайд крышкой на уровне 37 ° С и 5% СО 2 для дополнительнальных 24-30 ч.
- Исправить, проницаемыми и блокировать горки для окрашивания IFA и анализа паразитов, как описано в шаге 1. Выполнение окрашивание IFA с камерами интактных.
- Co-пятно клеток с антителами к лизосомальных мембран, связанные 1 (ЛАМПА1) или Lysotracker и антитела к T. гондий оценить активации инфицированных макрофагов запуска ли слияние мутантных клипов с лизосом (рисунок 4).
- Используйте антитела к конкретным купе / органелл в паразита / PV для окрашивания ИФА для выявления изменений в паразита мутанта, которые очевидны в начале следующих активацию макрофагов 28.
ПРИМЕЧАНИЕ: Такие изменения могут дать представление о механизме, который лежит в основе недостающую выживания / репликацию мутантов следующий активации макрофагов.
- Проверьте слайды, используя 100X масляной фазы объективную и флуоресцентной микроскопии.
- Оценка паразитов репликацию определенияКоличество паразитов в PV в 100 случайных вакуоли. Выполните по крайней мере 2 пунктам обвинения 100 вакуолей каждый для статистического анализа.
- Оценка общего паразита морфологию, используя как флюоресцентного анализа, а также фазово-контрастной микроскопии. Посмотреть паразиты при фазовых 100x цели. Здоровые паразиты паразиты плотно заключен в обтяжку паразитофорной вакуоли. Паразиты, которые имеют аморфные просторные вакуоли с фазовыми плотных дисками, аморфных паразитов предложить паразитов смерти, а не просто дефект в репликации (рисунки 1 и 3).
4. Оценка ли Восприимчивость Mutant паразитов активации инфицированных макрофагов, связанных с известными антимикробными посредников
- Изолировать мозга, полученных макрофаги костей от дикого типа C57 / BL6 мышей, Inos - / -, gp91-phox - / - или Irgm1 / Irgm3 - / - мышей 32.
- Получены Культура соответствующий костного мозга Macмакрофаги O / N в камере 8 предметные стекла в концентрации 3 × 10 5 клеток / мл в 250 мкл D10 сред.
- Продолжайте паразита вызов, окрашивание IFA и анализа, как описано в шаге 3.
- Определить, если способность мутантных паразитов, чтобы выжить и воспроизвести После активации макрофагов инфицированных восстанавливается в отсутствие активного кислорода или азота или видов специфического иммунитета, связанного GTPases 28.
- Использование фармакологических агентов, таких как доноров оксида азота, чтобы оценить, достаточно ли сами по себе, чтобы нарушить мутантов паразитов в HFF клеток или макрофагов наивных или если они действуют только во взаимодействии с другими медиаторами активации макрофагов 28 конкретные антимикробные посредники.
5. Оцените ли дефект в результате хронической инфекции Mutant Parasite компромиссов
- Изолировать тахизоиты из дикого типа, мутанта или целевых генов удалены паразитов, выращенного в T25s соntaining HfF клетки. Паразиты должны быть свеже лизируют от HFF культур.
- Граф паразитов с помощью гемоцитометра. Ресуспендируйте паразитов в сбалансированным солевым раствором Хенкса (HBSS) в концентрации на мл, подходящих для суб-летальной дозы возбудителя поставляется в 200 мкл внутрибрюшинной (IP) инъекции.
- Используйте 1 мл туберкулиновые шприцы и 25 г иглы для введения паразитов с объемом 200 мкл внутрибрюшинно (IP). Доза зависит от штамма дикого типа паразита и генотипа мыши.
ПРИМЕЧАНИЕ: Тип I генотипы паразита смертельным для мышей во время острой стадии инфекции, независимо от паразита дозы и не подходят для изучения хронической инфекции в отсутствие химиотерапии Т. гондий для подавления паразитов репликации. - Через тридцать дней после паразита вызов, пожертвовать мышей от вдыхания СО 2 из герметичного бака в непереполненного камеры (стандарт клетка размер мыши может содержать не более 5 мльда) с последующим смещением шейных позвонков.
- Изолировать мозга от мыши с помощью установленных процедур 41-43.
- Положите мышь на его лицевой стороне. Спрей голову 70% этанола для стерилизации области.
- Используйте острые ножницы, чтобы разрезать ствол головного мозга. Используйте рассекает ножницы, чтобы сделать неглубокий порез боков вокруг вправо, а затем с левой стороны черепа, начиная от основания ствола головного мозга. Используйте пинцет, чтобы аккуратно отогните череп подвергать мозг.
- Аккуратно поднимите мозга и место ножницы между мозгом и основания черепа, чтобы сократить обонятельный нерв, чтобы освободить мозг. Выньте мозг стерильным пинцетом или шпателем и место в бактериологической чашку Петри, содержащую 10 мл стерильного PBS.
- Вырезать мозга в половине стерильным скальпелем по центру между правым и левым полушариями.
- Добавьте половину мозга маленькой использовании раствора, содержащего 1 мл PBS. Используйте ступку и пестик ксделать прекрасный суспензии ткани головного мозга, которое может пройти через широкий отверстие 20-200 мкл кончика пипетки.
Примечание: Другую половину мозга должны быть зафиксированы в 2.5% формальдегида в течение 1 ч при срезы ткани необходимы для гистопатологического. - Поместите 100 мкл лизата мозга в 1,7 мл микроцентрифужных трубки. Добавить 1 мл 2,5% формальдегида в PBS в пробирку, содержащую лизат мозга, чтобы зафиксировать подвеску мозга для окрашивания. Инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин.
- Центрифуга лизата на 8000 мкг в течение 5 мин в микроцентрифуге и тщательно отбросить супернатант.
- Добавить 1 мл / пермеабилизации блокирующего буфера в лизате (10% козьей сывороткой, 0,2% Тритон Х-100 в ЗФР). Инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин.
- Центрифуга лизата на 8000 мкг в течение 5 мин и удалить супернатант.
- Добавить 200 мкл FITC-конъюгированного Dolichos biflorus agglutin (DBA). Используйте 1: 100 разбавление лектина в PBS плюс 10% козьей сыворотки. Аккуратно ресуспендирования лизата с помощью пипетки. Высиживатьв течение 1 ч при комнатной температуре.
Примечание: администратор базы представляет собой лиганд, который связывается с CST1 на паразита стенки кисты. - Центрифуга лизата на 8000 мкг в течение 5 мин и отбросить супернатант. Добавить 1 мл PBS к осадку. Инкубируют при комнатной температуре в течение 5 мин. Повторите PBS стирки 3 раза. Удалить супернатант следующей последней промывки с использованием пипетки.
- Используйте широкий отверстие 20-200 мкл пипетки составить 5 мкл окрашенных лизата мозга и места на предметное стекло микроскопа. Установите слайд с 25 х 25 скольжения мм крышку, чтобы создать влажную гору лизата мозга. Сделайте 3 дублирующие слайды, используя 5 мкл мозга лизата каждого.
- Подсчитайте количество цист на каждой 5 мкл аликвоты с помощью флуоресцентной микроскопии с использованием цели 10X (Рисунок 6).
ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые кисты больших (8 или больше паразитов примерно) в то время как некоторые из них очень мал (1-2 паразиты в кисты). Граф общее количество цист на каждой слайд, но номер документа большого по сравнению с числом малых кист. - Добавьте количество цист йеected в трех различных 5 мкл аликвоты и умножить на общую коэффициент разбавления х 2 (только половина мозга была сделана в лизата), чтобы оценить общее количество цист на мозг.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Токсоплазма повторяет свободно наивных макрофагов и имеет время удвоения между 6-12 ч в зависимости от штамма паразита. Рисунок 1 показывает представительства паразитов в наивным по сравнению с активированными мозга, полученных макрофагов костей. Рисунок 2 показывает общий морфологии паразитов в кино и телевидения клеткам-хозяевам, в 2, 4, 8, 16 и 32 паразитов / PV. В текущем протоколе, паразит ивазированной наивные макрофаги и создать зарождающуюся паразитофорной вакуоль (PV) до поставки сильнодействующих стимулов активации, ЛПС и ИФН, к зараженному макрофагов. В этой модели, репликация диких паразитов типа замедляется, но паразит репликации все еще продолжается в течение примерно 24 часов, во время которого макрофаги постепенно становятся более искусными в подавлении паразитов репликации. Экран предназначен для работы в качестве модифицированной модели конкуренции между временем, необходимым для мощного макрофагов аctivation против времени, в течение которого дикого типа паразит или паразит мутант может продолжать применять их в рамках своей PV. Первым шагом на экране, чтобы выбрать дозу LPS и IFN-γ, которые будут использоваться для активации инфицированных макрофагах. Доза определены эмпирически путем оценки паразита репликации в макрофагах, активированных либо постоянной дозы IFN-γ в комбинации с диапазоном концентраций LPS или постоянной дозы LPS с диапазоном концентраций IFN-(шаг 1). Доза стимулов активации необходимо оценивать для родительских диких паразитов типа используемых для создания паразитов мутантов путем химического или инсерционного мутагенеза. В идеальном случае доза ЛПС и IFN-γ позволит паразитов репликации в среднем 2-8 паразитов в PV 24-30 ч после активации по сравнению с 8-16 паразитов в PV в наивных макрофагов (фиг.1 и 2).
После соответствующей концентрации ЛПС и ИФН ^7; определяется, мутанты подвергают скринингу в 96-луночных оптического нижних пластин культуры ткани. Оптический нижней пластин в важно, потому что нарушения в пластик, который используется для традиционных тканевой культуры пластин делает его трудно достичь соответствующее разрешение на экран паразитов от фазового контраста и флуоресцентной микроскопии. Фазового контраста и флуоресцентной микроскопии из 96-луночных планшетах и требует перевернутый флуоресцентного микроскопа с фазовым контрастом 4, 10, 20 или 40-кратным цели, оборудованной для долгих рабочих расстояниях. Мутанты на экране в повторных чашки, содержащие мозга, полученных макрофаги мышиный костей. После заражения паразитов мутантов, инфицированные макрофаги в лунки один пластины активировали LPS и IFN-γ, а другой пластины, содержащие зараженные макрофаги культивируют в средах только D10. Планшеты инкубировали при 37 ° С и 5% СО 2 в течение 24-30 ч после добавления LPS и IFN-γ. После инкубации клетки Fiфиксированная, витражи для паразитов и анализировали с помощью ИФА с использованием как флуоресценция и фазово-контрастной микроскопии. Мутанты, что выбран нормальное число паразитов и репликации в наивных макрофаги, но меньше паразитов или мелких вакуолей с меньшим количеством паразитов в инфицированных макрофагах, которые активируются. После того, как мутанты выбираются они должны быть снова просеивают в камерных слайдов (шаг 3) в наивным и активированные макрофаги в двух независимых экспериментов для проведения анализа паразита морфологии на больших увеличениях (100X цели и масла) и подтвердить, что они имеют нормальной репликации в наивных макрофагов но дефект в репликации / выживания после активации макрофагов.
Фенотипы мутантов с дефектами устойчивостью к активации инфицированных макрофагов, как правило, делятся на две большие категории: паразитов, которые появляются морфологически нетронутой, но не в состоянии повторить за пределы одного паразита в ФВ; и паразиты, которые могут оказаться degradЭд и может быть также в аморфных просторных ЛВ (рис 1 и 3). Морфология и ультраструктура паразитов и PV является оптимальным для просмотра на слайдах с помощью объективных и масло 100X и фазово-контрастной микроскопии в сочетании с флуоресцентного анализа. Окрашивание паразитов для ИФА с антителами к лизосом, связанного мембранного белка-1 (LAMP1) является полезным для определения, является ли дефект в мутанта связан с неспособностью PV, чтобы предотвратить слияние с лизосомы. Показано на рисунке 4 паразит в фаголизосомы (LAMP1 положительной) по сравнению с паразитом, который в PV, что в значительной степени отделена от эндоцитоза системы клетки-хозяина (LAMP1 отрицательное). Фаголизосомы очевидно непрерывной твердой обода LAMP1 напрягает по всему паразита. В отличие от этого, П. В. часто лизосомы органеллы в непосредственной близости, но нет непрерывного край LAMP1 окрашивания вокруг своей окружности. Использование антител к определенных структур / органелл внутри Тон паразита и / или PV полезны в дальнейшие исследования ИФА для выявления аномалий в каждом мутанта, связанного с активацией инфицированных макрофагов. Такие допросы с антителами может дать представление о механизмах, лежащих в основе дефекта репликации / выживания в мутанта. Например, на рисунке 5 показано Т. гондий митохондрия окрашивали моноклональных антител 5F4 анти-F1 АТФ-азы бета-субъединицы (своего рода подарок от Питера Брэдли) 24 ч после активации макрофагов, инфицированных диких паразитов типа или паразитов мутантов. Т. гондий был одним из окрашивали моноклональных антител Т. гондий антитела. Дикого типа Т. гондий имеет один митохондрии, которая проходит по окружности паразита. Единственным митохондрия паразита в диких паразитов типа после активации зараженных макрофагов была цела сравнению с фрагментированной митохондрий в мутантных паразитов. Фрагментация митохондрий проявляется не только в деградированных / аморфныйпаразиты, но и в том, что паразиты показанных нормальную морфологию, как оценивали с помощью фазово-контрастной микроскопии. Это говорит о том, что дефект в паразита мутанта может увеличить восприимчивость паразита митохондрии в клетке-хозяине медиаторов, вызванные активацией макрофагов.
Нынешняя модель использует комбинацию IFN-γ и ЛПС, чтобы активировать зараженные макрофаги. IFN-γ стимулирует фактор транскрипции STAT1. LPS, как TNF-α, стимулирует фактор транскрипции NF-kB. Известный IFN-γ-зависимых антимикробных посредников важных в ячейке автономного иммунитета против Т. гондий включать множество IFN-γ-зависимых, связанных с помехоустойчивостью GTPases (IRGs, Гбит) и химически активного азота и кислорода видов в дополнение к другим агентам. Для того чтобы определить, если дефект в каждом мутанте специально связаны с производством известного IFN-γ -inducible антимикробных медиаторов, мозга, полученных макрофаги костного изолированы отиОАС - / -, ГП 91 phox - / - или конкретные IRG / GBP генов удалены мышей и анализировали на активность против мутантов паразитов. Сочетание ИФН-γ и ЛПС, чтобы активировать зараженные макрофаги преимущественно приводит мутантов с повышенной чувствительностью к окиси азота по сравнению с диким типом паразитов 28.
Активация макрофагов инфицированных может индуцировать дифференцировку стадии паразитов от тахизоитов на bradyzoites, которые содержатся в тканевых цист. Такие кисты характерны хронической инфекции. Таким образом, паразит мутанты, которые имеют дефекты в репликации / выживания после активации инфицированных макрофагов также может быть неисправен для преобразования в кисты во время инфекции в естественных условиях. Для того чтобы оценить производства кисты при хронической инфекции мышей вызов внутрибрюшинно (IP) с не летальной дозой исходного штамма паразита или мутантного клона. Кисты в диапазоне головного мозга в размере от менее чем 10 _6; м. В диаметре до более чем 50 мкм, как показано на рисунке 6 Подсчитайте количество как крупных, так и малых кист ИФА, но держать на счету отделить для того, чтобы определить, если паразит мутант ущерб на общую производства кисты или просто для создания и обслуживание крупных кист.
Рисунок 1. Наивные мозга, полученных макрофаги мышиный кости снисходительны для репликации Т. гондий но активация ИФН-γ и LPS существенно подавляет репликацию. () паразитофорной вакуоль (PV) дикого типа Т. гондий 24 ч после вторжения наивных мозга, полученных макрофагов мышиный костей. (B) PV дикого типа Т. гондий паразиты, состоящий из четырех паразитов в вакуоль 24 часов после активации инфицированных макрофагов.(С) Пример мутантного паразита не в состоянии воспроизведения и еще в одном паразита / PV 24 ч после активации инфицированных макрофагах. (D) Пример мутантного паразита, что появляется деградирует в аморфном П. 24 ч после активации макрофагов инфицированных , Верхний ряд показывает фазовые изображения паразитов и нижний ряд показывает флуоресцентные изображения с использованием поликлональных анти-сыворотка против Т. гондий. Масштабная линейка представляет 5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 2. Паразит репликации оценивали по количеству паразитов в PV. Фотографии показывают 2, 4, 8, 16 и 32 паразитов за PV в HFF клеток. Каждая картина является объединенная фазовое изображение йна выставках поликлональных окрашивание антител паразита в красном и ядра HFF в синем (DAPI). Масштабная линейка представляет 5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 3. Мутанты проявлять ряд фенотипов после активации инфицированных макрофагов. Столбец слева изображение фазы паразита в макрофагах, центральная колонка является флуоресцентное изображение с использованием антитела к T. гондий, и столбец, слияние фазы и флуоресцентного изображения. Паразит показано на зеленый и макрофагов ядра в синий цвет. Масштабная линейка представляет 5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большеверсия этой фигуры.
Рисунок окрашивание 4. LAMP1 отличает PVs от phagolysomes-содержащие паразитов. Паразиты окрашивали поликлональных анти-Т. гондий антитела (красный) и LAMP1 с МАБ 1D4B (зеленый). Стрелка показывает паразит PV, который сливается с лизосомы. Паразит без стрелки находится в паразитофорной вакуоли (PV), которые не сливается с лизосомы. Масштабная линейка представляет 5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 5. Дикие паразиты типа сохранить нетронутыми митохондрии в то время как mitochondriна деградирует в паразитов мутантов после активации инфицированных макрофагов. митохондрии (зеленый) в диких паразитов типа (верхняя панель) по сравнению с тремя различными мутанта Т. гондий паразитов на разных стадиях разложения (три нижних панелей) через 24 часа после активации инфицированных макрофагов. Масштабная линейка представляет 5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 6. Обнаружение паразитов кист в головном мозге с помощью FITC-сопряженных Dolichos biflorus лектина. Киста стены помечены лектина отображается зеленым цветом. Масштабная линейка представляет 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенное Versioн этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Описанный протокол обеспечивает не предвзятый подход, который использует активацию мышиных костного мозга, полученных макрофагов костей и вперед генетики изолировать Т. Gondii мутанты с дефектом в их способности выжить активации инфицированных макрофагов. Фенотип мутантов после активации макрофагов, как правило, попадает в одну из двух основных категорий: 1) Паразиты появляются нетронутой, но не могут передаваться за пределы 1 паразита в ФВ; 2) паразиты казаться худшим и может быть в просторных, аморфных ЛВ. Тот факт, что мутанты имеют фенотип дикого типа паразитов типа в наивных макрофагов в отсутствии активации доказывает, в частности, протокол может быть использован для идентификации мутантов, которые специально нарушениями в их способности противостоять активацию макрофагов. Использование мозга, полученных макрофагов первичной кости рекомендуется по сравнению с RAW 264.7 макрофагов линии клеток на экране, потому что морфология паразитов и числа паразитов в Vācuоле легче визуализированы в мозга, полученных макрофагов кости.
Описано экран в сочетании с передними генетики обеспечивает универсальный инструмент рассекать паразитов гены и в конечном итоге генетических путей, важные для устойчивости к конкретным медиаторов клеточного автономного иммунитета. Такие прогнозные генетика исследования важны для выявления паразитов гены, которые могут быть затем как струна, чтобы начать распутывать паразитов пути важные для противодействия конкретным антимикробные посредников, как в пробирке и в течение патогенеза. Предыдущая трудности с передними генетических подходов было выявление ключевых гена нарушается в каждом мутанта. Космидной библиотека комплементация в T. гондий был весьма эффективным для функциональной дополнительности деления клеток мутантов. Однако тот факт, что репликация диких паразитов типа также подавляется IFN-γ и LPS только в меньшей степени, чем мутантов, делает функциональной дополнительности более сложную ТНАп для деления клеток мутантов. Всего профилирование мутационный геном для химической и инсерционных мутантов в Т. гондий недавно появилась как продуктивным, и даже экономически эффективным, авеню, чтобы определить гены, ответственные за фенотипов мутантов в прямом генетики экранов 34,36,37,44. Следовательно, весь геном мутаций профилирования используют следующего поколения секвенирования расширила возможности использования химического мутагенеза Т. гондий в прямом генетических исследований, чтобы идентифицировать гены, важные для конкретных функций. Такое вперед генетика подход, как описано в текущем протоколе важны, так как большая часть генома T. гондий остается гипотетическая с большинством прогнозных генов, не имеющих гомологию с другими генами или функциональных доменов, которые могли помочь в идентификации генов-кандидатов паразитов, важных для иммунной уклонения.
ИФА анализ 96-луночных планшетах обычно не считаются скрининга с высокой пропускной способностью метХод. По нашему опыту это разумно для одного человека, чтобы окрасить и экран 10 96-луночных планшетах в день или около 960 мутантов. В работе Skariah и др., Примерно 8000 мутанты были проанализированы и 14 независимых мутанты были изолированы, которые были значительно худшие для выживания / репликации в активированных, но не наивных макрофагов 28. Нарушение выживание мутантов преимущественно результатом повышенной восприимчивости к окиси азота. Ограничение в общем способе, прежде всего, на уровне получения одиночных клонов паразита, а не скрининга с помощью микроскопии в начальный экран в 96-луночных планшетах качественно и достаточно быстро. Подтверждение фенотипа мутантов, определенных в экране 96-луночного планшета следует в шага 3, количественного и качественного анализа с использованием макрофагов в камере слайдов и добавления равного количества дикого типа или мутанта паразитов. Использование других аналитических методов скринингатаких как флуорометрии на общий уровень численности паразитов, а не индивидуальном уровне паразита По оценке микроскопии, являются проблематичными в текущем протоколе, поскольку многие из деградированных паразитов пятно поликлональных антител против T. гондий как энергично, как дикие паразиты типа с разницей в мутанта быть более качественным, чем количественным на уровне интенсивности fluoresence. Кроме того, доза IFN-γ и ЛПС, необходимых для выделения мутантов с дефектом в устойчивости к активации макрофагов инфицированных приводит к подавленной репликации дикого типа паразитов хотя и на более поздних временных точках. Таким образом, измерение общего количества паразитов на переднем экране генетики в том числе с использованием люминесцентных паразитов является проблематичным. Тем не менее, можно протокол окрашивание может быть устранено на этапе скрининга, если родительские клонов паразита, используемые для химического или инсерционного мутагенеза выражена конститутивный или индуцируемый флуоресцентные или Luciferазы маркер. Описанный протокол с помощью ИФА и микроскопии скрининга макрофагов в 96-луночных планшетах позволяет изолировать мутантов дефектных по выживаемости / репликации в активированных макрофагах, но также четко не попадает некоторые потенциальные мутанты из-за ограниченной достижимой микроскопического разрешением, используя формат 96-луночного планшета, как в этом разрешении аморфные набухшие вакуоли это пятно на паразита антигена может быть ошибочно принято за здоровых тиражирование паразитов в пределах нормального PV. Замена 96-луночные крышки стеклянных пластин, а 96-луночные планшеты с оптической поверхности, может достичь более высокое разрешение при экране инфицированных макрофагах в 96-луночных планшетах.
Подавляющее большинство мутантов, выявленных с помощью IFN-γ и ЛПС в описанном протоколе, чтобы активировать макрофаги следующие паразита вторжения имеют дефект в их способности защитить себя от окиси азота 28. В связи с этим, хотя экран предназначен, чтобы быть не-предвзятым,может обогатить для выделения паразитов мутантов с повышенной восприимчивостью к конкретным антимикробных посредников в зависимости от условий активации, типа и вида макрофагов и сроков паразит вторжения отношению к активации макрофагов, которые выбрали для экрана. Таким образом, врожденной иммунной клетки выбраны для экрана и раздражителей активации прикладной являются критическими параметрами, которые влияют на тип антимикробных посредников, которые полученные мутанты паразитов, вероятно, будут подвержены. Генотип паразита также критическим параметром, как типа I генотипы паразита относительно устойчивы к иммунитета, связанных с ГТФ (IRGs) индуцируется в ответ на IFN-γ в то время как тип II и III генотипы, более восприимчивы 26,45,46. В описываемом протокола, макрофаги активируются после инвазии паразита. Хотя генотипа II типа, Prugnaud штамм, используемый в описанном экране подвержен действию иммунитета, связанных с GTPases,llowing паразит вторгнуться в макрофаги первый позволяет воспроизводить диких паразитов типа до полного индукции IRGs. Кроме того, не ясно, что IRGs эффективны против паразитов, если они индуцированного в макрофагах последующих паразитировать вторжение и начало репликации.
Описанный протокол использует макрофаги, чтобы идентифицировать гены паразита, важные для устойчивости к IFN-γ в зависимости от медиаторами клеточного иммунитета автономной, в частности оксида азота. Изоляция из бассейна паразитов мутантов, которые разделяют повышенной чувствительностью к окиси азота, а также общий фенотип оксида азота зависит от митохондриальной фрагментации предоставляет уникальный набор инструментов для выявления генов паразита и путей важные для сопротивления оксида азота и для понимания Действие окиси азота в более широком смысле в отношении Т. гондий и других эукариотических pathogens.The описано протокола с незначительными изменениями могут быть использованы для прямой генетической Studieс для выявления паразитов гены, важные для устойчивости к различным медиаторов клеточного автономного иммунитета. Потенциальные модификации включают изменения типа клетки-хозяина, инфицированного, стимулы активации или сроки активации по отношению к паразитировать вторжения. Например, предварительной активации мышиных макрофагов с IFN-γ до того паразитов приведет к активации иммунитета, связанных с ГТФ. Такая модель может быть использована для идентификации генов паразита в I типа генотипы Т. гондий, которые могут внести свой вклад в сопротивление при посредничестве ROP18 и ROP5 иммунитета, связанных GTPases 24,25. Медиаторы клеток автономной иммунитета против Т. гондий в врожденных иммунных клеток человека не так хорошо, как определено в грызунов. Таким образом, использование человеческих моноцитов периферической крови для скрининга химических мутантов Т. гондий может идентифицировать как паразитами гены, важные для выживания во время инфицирования человека врожденного иммунных клеток, а также механизмов, важных для людей FOR устойчивость к противомикробным препаратам Т. гондий. Паразитов гены, важные для устойчивости к противомикробным конкретных посредников могут быть идентифицированы путем выделения мутантов, неспособных выжить воздействия инфицированных клеток-хозяев в фармакологических агентов, таких как активные формы кислорода или азота видов. Аналогично протокол может быть изменен, чтобы изолировать паразита мутантов с повышенной восприимчивостью к Инфламмасома активации 47-49 или АТФ стимуляции макрофагов пуринергическими рецепторов 50.
Взятые вместе, эти протоколы описывают подход с использованием прямого генетики и врожденные иммунные клетки, чтобы изолировать паразита мутантов важные для Т. гондий устойчивость к IFN-γ-зависимой клеточно-автономными иммунитета. Важно отметить, что подход выдвинул является универсальным и может быть легко изменены, чтобы изолировать гены паразита важно для уклонения конкретные антимикробные медиаторов, выживание паразитов в конкретных типах клеток-хозяев или устойчивость к стрессовым условиям encounteкрасным во время токсоплазмоза. Кроме того, паразит гены, важные для сопротивления активацию клеток-хозяев, во многих случаях может также играть роль прямо или косвенно в производстве кисты в естественных условиях во время инфекции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Hyclone | SH3008101 | https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog Id=29101&productId=3255471&dis type=0&highlightProductsItemsFlag =Y&fromSearch=1&searchType= PROD&hasPromo=0 |
| Hyclone FBS | Thermo | SH3091003 | https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog Id=29104&productId=11737973&dis type=0&highlightProductsItemsFlag =Y&fromSearch=1&searchType= PROD&hasPromo=0 |
| Hyclone DPBS | Thermo | SH3002802 | https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog Id=29104&productId=2434305&dis type=0&highlightProductsItemsFlag =Y&fromSearch=1&searchType =PROD&hasPromo=0 |
| Hyclone L-glutamine | Thermo | SH3003401 | https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog Id=29104&productId=3311957&dis type=0&highlightProductsItemsFlag =Y&fromSearch=1&searchType =PROD&hasPromo=0 |
| Hyclone Pen strep | Thermo | SV30010 | https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/fsproductdetail?storeId=10652&productId=1309668 6&catalogId=29104&matchedCat No=SV30010&fromSearch=1& searchKey=SV30010&highlightPro ductsItemsFlag=Y&endecaSearch Query=%23store%3DRE_SC%23nav%3D0%23rpp%3D25%23offSet%3D0%23keyWord%3DSV30010%2B%23searchType%3DPROD%23SWKeyList%3D%5B%5D&xrefPartType=From&savings= 0.0&xrefEvent=1407777949003_0 &searchType=PROD&hasPromo=0 |
| Hyclone Hanks BSS | Thermo | SH3003002 | https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog Id=29104&productId=3064595&dis type=0&highlightProductsItemsFlag =Y&fromSearch=1&searchType= PROD&hasPromo=0 |
| LPS | LIST biologicals | 201 | http://www.listlabs.com/products-tech.php?cat_id=4&product_id=81&keywords =LPS_from_%3Cem%3EEscherichia_coli%3C/em%3E_O111:B4 |
| IFN-γ | Pepro Tech Inc | 50-813-664 | https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?itemdetail='item'&storeId=10652& productId=2988494&catalogId=29 104&matchedCatNo=50813664& fromSearch=1&searchKey=murine+ifn+pepro+tech&highlightProductsItemsFlag =Y&endecaSearchQuery=%23store%3DRE_SC%23nav%3D0%23rpp%3D25%23offSet%3D0%23keyWord%3Dmurine%2Bifn%2Bpepro%2Btech%23searchType%3DPROD%23SWKeyList%3D%5B%5D&xrefPartType=From&savings =0.0&xrefEvent=1407778210608_ 12&searchType=PROD&hasPromo =0 |
| Chamber slides | Thermo | 177402 | https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog Id=29104&productId=2164545&dis type=0&highlightProductsItemsFlag =Y&fromSearch=1&searchType= PROD&hasPromo=0 |
| 96-well optical plates | Thermo | 165306 | https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog Id=29104&productId=3010670&dis type=0&highlightProductsItemsFlag =Y&fromSearch=1&searchType= PROD&hasPromo=0 |
| 96-well tissue culture plates | Fisher | 353072 | https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog Id=29104&productId=3158736&dis type=0&highlightProductsItemsFlag =Y&fromSearch=1&searchType= PROD&hasPromo=0 |
| Tissue culture flast T25 | Fisher | 156367 | https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/fsproductdetail?storeId=10652&productId=127039 67&catalogId=29104&matchedCat No=12565351&fromSearch=1& searchKey=156367&highlightProdu ctsItemsFlag=Y&endecaSearchQu ery=%23store%3DRE_SC%23nav%3D0%23rpp%3D25%23offSet%3D0%23keyWord%3D156367%23searchType%3DPROD%23SWKeyList%3D%5B%5D&xrefPartType=From&savings =0.0&xrefEvent=1407778974800_ 0&searchType=PROD&hasPromo =0 |
| Ted Pella EM grade formaldehyde | Ted Pella | 18505 | http://www.tedpella.com/chemical_html/chem3.htm#anchor267712 |
| Triton X-100 | Fisher | BP151 | https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog Id=29104&productId=3425922&dis type=0&highlightProductsItemsFlag =Y&fromSearch=1&searchType= PROD&hasPromo=1 |
| Alexa 488 - protein conjugation kit | Life Technologies | A20181 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/A10235 |
| goat serum | MP Biomedicals | ICN19135680 | https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog Id=29104&productId=2133236&dis type=0&highlightProductsItemsFlag =Y&fromSearch=1&crossRefData =ICN19135680=2&searchType =PROD&hasPromo=0 |
| Vectashield mounting media | Vector Labs | H1200 | https://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=428 |
| FITC-conjugated dolichos | Vector Labs | FL-1031 | https://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=188 |
| Antibody to LAMP1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | http://dshb.biology.uiowa.edu/LAMP-1 | |
| LysoTracker | Life Technologies | L-7526 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/L7526?ICID=search-product |
| C57BL6 mice | Jackson Laboratories | 664 | http://jaxmice.jax.org/strain/000664.html |
| gp91 phox knock out mice | Jackson Labaoratories | 2365 | http://jaxmice.jax.org/strain/002365.html |
| iNOS knock out mice | Jackson Laboratories | 2609 | http://jaxmice.jax.org/strain/002609.html |
| sodium nitroprusside | ACROS Organics | AC21164-0250 | https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog Id=29104&productId=2627727&dis type=0&highlightProductsItemsFlag =Y&fromSearch=1&searchType= PROD&hasPromo=1 |
| DETA NONOate | ACROS Organics | AC32865-0250 | https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog Id=29104&productId=2252389&dis type=0&highlightProductsItemsFlag =Y&fromSearch=1&searchType= PROD&hasPromo=1 |
| Monoclonal mouse anti-Toxoplasma gondii Ab | Fitzgerald Industries International | 10T19A | http://1degreebio.org/reagents/product/1069274/?qid=652947 |
References
- Scharton-Kersten, T. M., Yap, G., Magram, J., Sher, A. Inducible nitric oxide is essential for host control of persistent but not acute infection with the intracellular pathogen Toxoplasma gondii. J Exp Med. 185 (7), 1261-1273 (1997).
- Schluter, D., et al. Inhibition of inducible nitric oxide synthase exacerbates chronic cerebral toxoplasmosis in Toxoplasma gondii-susceptible C57BL/6 mice but does not reactivate the latent disease in T. gondii-resistant BALB/c mice. J Immunol. 162 (6), 3512-3518 (1999).
- Khan, I. A., Matsuura, T., Fonseka, S., Kasper, L. H. Production of nitric oxide (NO) is not essential for protection against acute Toxoplasma gondii infection in IRF-1-/- mice. J Immunol. 156 (2), 636-643 (1996).
- Khan, I. A., Schwartzman, J. D., Matsuura, T., Kasper, L. H. A dichotomous role for nitric oxide during acute Toxoplasma gondii infection in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (25), 13955-13960 (1997).
- Mordue, D. G., Desai, N., Dustin, M., Sibley, L. D. Invasion by Toxoplasma gondii establishes a moving junction that selectively excludes host cell plasma membrane proteins on the basis of their membrane anchoring. J Exp Med. 190 (12), 1783-1792 (1999).
- Mordue, D. G., Sibley, L. D. Intracellular fate of vacuoles containing Toxoplasma gondii is determined at the time of formation and depends on the mechanism of entry. J Immunol. 159 (9), 4452-4459 (1997).
- Coppens, I., et al. Toxoplasma gondii sequesters lysosomes from mammalian hosts in the vacuolar space. Cell. 125 (2), 261-274 (2006).
- Joiner, K. A., Fuhrman, S. A., Miettinen, H. M., Kasper, L. H., Mellman, I. Toxoplasma gondii: fusion competence of parasitophorous vacuoles in Fc receptor-transfected fibroblasts. Science. 249 (4969), 641-646 (1990).
- Dobrowolski, J. M., Sibley, L. D. Toxoplasma invasion of mammalian cells is powered by the actin cytoskeleton of the parasite. Cell. 84 (6), 933-939 (1996).
- Kim, S. K., Fouts, A. E., Boothroyd, J. C. Toxoplasma gondii dysregulates IFN-gamma-inducible gene expression in human fibroblasts: insights from a genome-wide transcriptional profiling. J Immunol. 178 (8), 5154-5165 (2007).
- Lang, C., et al. Impaired chromatin remodelling at STAT1-regulated promoters leads to global unresponsiveness of Toxoplasma gondii-Infected macrophages to IFN-gamma. PLoS Pathog. 8, e1002483 (2012).
- Kim, L., Butcher, B. A., Denkers, E. Y. Toxoplasma gondii interferes with lipopolysaccharide-induced mitogen-activated protein kinase activation by mechanisms distinct from endotoxin tolerance. J Immunol. 172 (5), 3003-3010 (2004).
- Leng, J., Butcher, B. A., Egan, C. E., Abdallah, D. S., Denkers, E. Y. Toxoplasma gondii prevents chromatin remodeling initiated by TLR-triggered macrophage activation. J Immunol. 182 (1), 489-497 (2009).
- Leng, J., Denkers, E. Y. Toxoplasma gondii inhibits covalent modification of histone H3 at the IL-10 promoter in infected macrophages. PLoS One. 4, e7589 (2009).
- Seabra, S. H., de Souza, W., DaMatta, R. A. Toxoplasma gondii partially inhibits nitric oxide production of activated murine macrophages. Exp Parasitol. 100 (1), 62-70 (2002).
- Butcher, B. A., et al. Toxoplasma gondii rhoptry kinase ROP16 activates STAT3 and STAT6 resulting in cytokine inhibition and arginase-1-dependent growth control. PLoS Pathog. , e1002236 (2011).
- Ong, Y. C., Reese, M. L., Boothroyd, J. C. Toxoplasma rhoptry protein 16 (ROP16) subverts host function by direct tyrosine phosphorylation of STAT6. J Biol Chem. 285 (37), 28731-28740 (2010).
- Saeij, J. P., et al. Toxoplasma co-opts host gene expression by injection of a polymorphic kinase homologue. Nature. 445 (7125), 324-327 (2007).
- Jensen, K. D., et al. Toxoplasma polymorphic effectors determine macrophage polarization and intestinal inflammation. Cell Host Microbe. 9 (6), 472-483 (2011).
- Rosowski, E. E., et al. Strain-specific activation of the NF-kappaB pathway by GRA15, a novel Toxoplasma gondii dense granule protein. J Exp Med. 208 (1), 195-212 (2011).
- Bougdour, A., et al. Host cell subversion by Toxoplasma GRA16, an exported dense granule protein that targets the host cell nucleus and alters gene expression. Cell Host Microbe. 13 (4), 489-500 (2013).
- Braun, L., et al. A Toxoplasma dense granule protein, GRA24, modulates the early immune response to infection by promoting a direct and sustained host p38 MAPK activation. J Exp Med. 210 (10), 2071-2086 (2013).
- El Hajj, H., et al. ROP18 is a rhoptry kinase controlling the intracellular proliferation of Toxoplasma gondii. PLoS Pathog. 3, e14 (2007).
- Etheridge, R. D., et al. The Toxoplasma Pseudokinase ROP5 Forms Complexes with ROP18 and ROP17 Kinases that Synergize to Control Acute Virulence in Mice. Cell Host Microbe. 15 (5), 537-550 (2014).
- Niedelman, W., et al. The rhoptry proteins ROP18 and ROP5 mediate Toxoplasma gondii evasion of the murine, but not the human, interferon-gamma response. PLoS Pathog. 8, e1002784 (2012).
- Zhao, Y., et al. Virulent Toxoplasma gondii evade immunity-related GTPase-mediated parasite vacuole disruption within primed macrophages. J Immunol. 182 (6), 3775-3781 (2009).
- Mordue, D. G., Scott-Weathers, C. F., Tobin, C. M., Knoll, L. J. A patatin-like protein protects Toxoplasma gondii from degradation in activated macrophages. Mol Microbiol. 63 (2), 482-496 (2007).
- Skariah, S., Bednarczyk, R. B., McIntyre, M. K., Taylor, G. A., Mordue, D. G. Discovery of a novel Toxoplasma gondii conoid-associated protein important for parasite resistance to reactive nitrogen intermediates. J Immunol. 188 (7), 3404-3415 (2012).
- Zhao, Z., et al. Autophagosome-independent essential function for the autophagy protein Atg5 in cellular immunity to intracellular pathogens. Cell Host Microbe. 4, 458-469 (2008).
- Bohne, W., Heesemann, J., Gross, U. Reduced replication of Toxoplasma gondii is necessary for induction of bradyzoite-specific antigens: a possible role for nitric oxide in triggering stage conversion. Infect Immun. 62 (5), 1761-1767 (1994).
- Bohne, W., Heesemann, J., Gross, U. Induction of bradyzoite-specific Toxoplasma gondii antigens in gamma interferon-treated mouse macrophages. Infect Immun. 61 (3), 1141-1145 (1993).
- Tobin, C., Pollard, A., Knoll, L. Toxoplasma gondii cyst wall formation in activated bone marrow-derived macrophages and bradyzoite conditions. J Vis Exp. (42), 2091 (2010).
- Gajria, B., et al. ToxoDB: an integrated Toxoplasma gondii database resource. Nucleic Acids Res. 36, D553-D556 (2008).
- Farrell, A., et al. Whole genome profiling of spontaneous and chemically induced mutations in Toxoplasma gondii. BMC Genomics. 15, 354 (2014).
- Farrell, A., et al. A DOC2 protein identified by mutational profiling is essential for apicomplexan parasite exocytosis. Science. 335 (6065), 218-221 (2012).
- Brown, K. M., et al. Forward genetic screening identifies a small molecule that blocks Toxoplasma gondii growth by inhibiting both host- and parasite-encoded kinases. PLoS Pathog. 10, e1004180 (2014).
- Jammallo, L., et al. An insertional trap for conditional gene expression in Toxoplasma gondii: identification of TAF250 as an essential gene. Mol Biochem Parasitol. 175 (2), 133-143 (2011).
- Coleman, B. I., Gubbels, M. J. A genetic screen to isolate Toxoplasma gondii host-cell egress mutants. J Vis Exp. (60), 3807 (2012).
- Trouplin, V., et al.
- Sibley, L. D., Adams, L. B., Fukutomi, Y., Krahenbuhl, J. L. Tumor necrosis factor-alpha triggers antitoxoplasmal activity of IFN-gamma primed macrophages. J Immunol. 147 (7), 2340-2345 (1991).
- Navone, S. E., et al. Isolation and expansion of human and mouse brain microvascular endothelial cells. Nat Protoc. 8 (9), 1680-1693 (2013).
- Pino, P. A., Cardona, A. E. Isolation of brain and spinal cord mononuclear cells using percoll gradients. J Vis Exp. Feb. (48), 2348 (2011).
- Walker, T. L., Kempermann, G. One mouse, two cultures: isolation and culture of adult neural stem cells from the two neurogenic zones of individual mice. J Vis Exp. (84), e51225 (2014).
- Eidell, K. P., Burke, T., Gubbels, M. J. Development of a screen to dissect Toxoplasma gondii egress. Mol Biochem Parasitol. 171 (2), 97-103 (2010).
- Fentress, S. J., et al. Phosphorylation of immunity-related GTPases by a Toxoplasma gondii-secreted kinase promotes macrophage survival and virulence. Cell Host Microbe. 8 (6), 484-495 (2010).
- Fleckenstein, M. C., et al. A Toxoplasma gondii Pseudokinase Inhibits Host IRG Resistance Proteins. PLoS Biol. 10, e1001358 (2012).
- Cirelli, K. M., et al. Inflammasome sensor NLRP1 controls rat macrophage susceptibility to Toxoplasma gondii. PLoS Pathog. 10, e1003927 (2014).
- Ewald, S. E., Chavarria-Smith, J., Boothroyd, J. C. NLRP1 is an inflammasome sensor for Toxoplasma gondii. Infect Immun. 82 (1), 460-468 (2014).
- Gorfu, G., et al. Dual role for inflammasome sensors NLRP1 and NLRP3 in murine resistance to Toxoplasma gondii. MBio. 5 (1), (2014).
- Lees, M. P., et al. P2X7 receptor-mediated killing of an intracellular parasite, Toxoplasma gondii, by human and murine macrophages. J Immunol. 184 (12), 7040-7046 (2010).
