Introduction
Kankers zijn progressieve ziekten gekenmerkt door de accumulatie van pathologische mutaties, deleties en chromosoom winsten in de tijd. Deze genetische afwijkingen kunnen beïnvloeden meerdere cellulaire processen gaande van de celcyclus, celdood, energetische metabolisme en assemblage van het cytoskelet te antwoorden zoals hypoxie benadrukken. Vandaar het ontstaan van tumoren weerspiegelt de collectieve acties van meerdere genetische afwijkingen over een spectrum van biologische processen. Recente integratieve genomische onderzoeksinspanningen, met inbegrip van whole genome sequencing, exoom sequencing, gerichte sequencing, deep sequencing en genoomwijde associatie studies, hebben een groeiend aantal nieuwe genetische veranderingen die in wezen alle soorten van tumoren 1-4. In veel gevallen, de genetische laesies samen voorkomen in een niet-willekeurige wijze 5-8, suggereert hun samenwerking pathogenese. Het ontleden van de oncogene rol van de grote reeks van afwijkend uitgedrukt genen resulteert from deze genomische afwijkingen is het noodzakelijk om nieuwe therapeutische strategieën te ontwikkelen en om de reacties van tumorcellen om deze middelen te begrijpen, maar dit bleek een hele klus zijn, die zeer robuust diermodel systemen voor het uitvoeren van high-throughput functionele genomische analyse in vivo.
Hoewel zoogdieren, vooral knaagdieren, zijn favoriete modellen in de biologie van kanker, heeft de zebravis begonnen om aandacht te trekken. De teleost zebravis (Dario rerio) is gebruikt als modelorganisme voor de ontwikkeling van onderzoek sinds de jaren 1960 en werd voor het eerst toegepast op de studie van de tumor pathogenese in 1982 9-11. Gemak van onderhoud, kleine lichaamsgrootte, en de hoge vruchtbaarheid maken de zebravis een robuust model voor grootschalige forward genetische screens om mutaties die abnormaal en pathologische fenotypes 10 verlenen identificeren. De optische transparantie van de zebravis embryo's is een ander belangrijk kenmerk ondersteunen ruimer gebruik van deze vorm van kanker model, zoalshet mogelijk in vivo beeldvorming worden uitgevoerd om tumorontwikkeling vinden in realtime 9, een toepassing die in knaagdieren 12 relatief moeilijk. Recente vergelijkende genomica analyse van de zebravis referentie-genoom (Zv9) onthulde 26.206 eiwit-coderende genen, met 71% hebben van de menselijke orthologa, waarvan 82% zijn gecorreleerd met ziekte-geassocieerde genen in de Online Mendeliaanse Inheritance in Man (OMIM) database-13, 14. Bijgevolg heeft de zebravis gebruikt om het model diverse typen menselijke kankers, zoals neuroblastoom 8 T-cel acute lymfoblastische leukemie (T-ALL) 15,16, 17,18 melanoom, Ewing-sarcoom 19, rhabdomyosarcoom 20,21, pancreascarcinoom 22, hepatocellulair carcinoom 23 en myeloïde maligniteiten 24,25, en is geselecteerd als een kanker model voor xenotransplantatie bestudeert 11,26.
Een stabiele transgeneaanpak zebravis wordt vaak gebruikt om het effect van gain-of-functie van genen in normale ontwikkeling en pathogenese 27,28 bestuderen. Om zo'n model (Figuur 1A) ontwikkelen een spuit een DNA construct dat het gen van belang aangestuurd door een weefselspecifieke promoter in een cel wildtype embryo. Drie tot vier maanden na injectie, wanneer de geïnjecteerde embryo geslachtsrijp zijn ze outcrossed met wildtype vis te screenen op diegenen die de integratie van het DNA construct in de kiemlijn, die ze als grondlegger vis licenties. Vele factoren, zoals het aantal kopieën en de integratieplaats van het transgen invloed expressie van het transgen in stabiele transgene lijnen. Dus, om een transgeen tumor model te ontwikkelen, verschillende stabiele transgene lijnen overexpressie één oncogen moeten eerst worden gegenereerd en gescreend op de expressie brengt het transgen op een niveau dat kan leiden tot tumor inductie. Indien overexpressie van een kandidaat oncogene is giftig voor kiemcellen, is het moeilijk om een stabiele transgene lijn genereren door direct overexpressie transgen 29. Daarom kan deze benadering tijdrovend, met een hoog risico van het niet geschikt Cancer genereren.
Hier, illustreren we een alternatieve strategie gebaseerd op mozaïek voorbijgaande transgenese (Figuur 1B) dat unieke voordelen biedt ten opzichte van traditionele stabiele transgenese voor functionele genomische studie in vivo. In deze benadering worden één of meer transgene constructen geïnjecteerd in de één-cel fase van transgene of wildtype embryo. Het geïnjecteerde DNA constructen bevattende transgenen Dan mosaically en willekeurig geïntegreerd in de primaire ingespoten vissen, waardoor gemengde genotypes in verschillende celpopulaties in afzonderlijke vis 30. Bovendien co-injectie van meerdere DNA-constructen in een cel embryo leidt tot co-integratie in dezelfde cel willekeurig plaatsen, zodat men trace de cellen met expressie van transgenen en de interactie van verschillende genen ontdekken tijdens ziekte pathogenese in het mozaïek dieren 31. Als bewijs van principe, we tijdelijk tot overexpressie mutationeel geactiveerd ALK (F1174L) met mCherry reportergen in de perifere sympathische zenuwstelsel (PSNS) onder controle van de dopamine beta hydroxylase (d βh) promotor in wildtype en transgene vis vis overexpressie MYCN. ALK, die een receptor tyrosine kinase codeert, is de meest frequent gemuteerde gen hoog risico neuroblastoom 5-7,32,33. ALK (F1174L), als één van de meest voorkomende en krachtige somatische activerende mutaties, oververtegenwoordigd in MYCN- versterkt neuroblastoom patiënten met een hoog risico en synergie met MYCN overexpressie aan neuroblastoom het ontstaan van tumoren te versnellen, zowel in stabiele transgene muizen en transgene zebravismodellen 8,34,35. Door het mozaïekvoorbijgaande overexpressie van ALK (F1174L) met mCherry in de MYCN transgene vis, we recapituleerde de versnelling van de tumor ontstaan waargenomen in de stabiele transgene vis overexpressie zowel ALK (F1174L) en MYCN, wat suggereert dat het mozaïek transgenese strategie om snel en efficiënt kan worden gebruikt De relatieve bijdragen van meerdere oncogenen in tumorinitiatie in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Alle zebravis studies en het onderhoud van de dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de Mayo Clinic Instituut IACUC-goedgekeurde protocol # A41213.
1. DNA-constructen voor Transgenese
- Versterken van een 5.2-kb dopamine-beta hydroxylase (d βh) promotor gebied 8 met behulp van de CH211-270H11 BAC-kloon (van BacPac middelen centrum (BPRC)) als een DNA-template. Gebruik een PCR systeem geschikt voor lange en nauwkeurige PCR amplificatie van lange DNA-matrijzen en de volgende cyclus programma voor PCR: 94 ° C gedurende 2 min, 10 cycli van (94 ° C, 15 sec, 50 ° C, 30 sec, 68 ° C, 8 min), gevolgd door 30 cycli van (94 ° C, 15 sec, 53 ° C, 30 sec, 68 ° C, 8 min), 68 ° C, 4 min (voorwaartse primer 5'-GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGGCGTACTCCCCCTTTTTAGG-3 ' en reverse primer 5'GGGGACTGCTTTTTTGTACAAACTTGTGTTGCTTTGTCGTCTTTTGA-3 ').
- Maak de d βh -pDONRP4-P1R binnenkomst clone 8 met behulp van commerciële recombinante klonen systeem zoals multisite gateway. Meng 1 ui van gezuiverd dβh PCR-product (172 ng / ul), 1 ui (150 ng / ul) pDONRP4-P1R donorvector (samen met andere gateway vectoren zijn gulle giften van Dr. Chi-Bin Chien, Univ. Van Utah) 4 ui TE-buffer (pH 8,0) met 2 pl BP clonase enzymmengsel, incubeer gedurende 1 uur bij 25 ° C en vervolgens transformeren One Shot TOP10 competente E. coli volgens het protocol van de fabrikant.
- Genereer de d βh: EGFP-MYCN transgene construct 8 met behulp van recombinant-klonen in stap 1.2 genoemde systeem. Meng 1 ui van elk item kloon (150 ng / ul), waaronder een 5,2-kb dβh promotor (dβh -pDONR P4-P1R construct), EGFP ontbreekt een stopcodon (pME-EGFP construct), en menselijke MYCN cDNA (een gulle gift van Dr. Hogarty in het Children's Hospital van Pennsylvania, MYCN-pDONRP2R-P3 construct), 1 pl (150 ng / ul) van de gewijzigde bestemming vector die I-Sce I herkenningsplaatsen (een gulle gift van Dr. C. Grabher, Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, Duitsland), 4 pl TE buffer ( pH 8,0) met 2 pl LR Clonase enzymmengsel, incubeer gedurende 1 uur bij 25 ° C en vervolgens transformeren om chemisch competente E. coli zoals One shot top 10 en volg protocol van de fabrikant.
- Merk MITF: MITF transgene construct 8 door digestie PNP-MITF vector met NotI en SalI restrictie enzymen voor 2 uur bij kamertemperatuur, en door subklonering de vrijgegeven 2.65-kb (een gulle gift van Dr. D. Raible, Univ of Washington). DNA-fragment dat de MITF promoter en de coderende sequentie van de zebravis MITF gen in de Notl en Mlul plaatsen van een gemodificeerde pBluescript vector die flankerende I-Sce I herkenningsplaatsen bevat (een gulle gift van Dr. Hui FeNG, Boston University), met T4 DNA ligase volgens protocol van de fabrikant.
OPMERKING: Om de efficiëntie van het genereren van stabiele MYCN -waar lijnen te verhogen, d βh: EGFP-MYCN en de MITF:. MITF DNA-constructen worden gecoïnjecteerd tot één-cel stadium parelmoer embryo Nacre duidt een soort mutant vis ontbreekt een neurale-afgeleide melanoforen tijdens de ontwikkeling 36. Zo is de verschijning van pigmentcellen in de geïnjecteerde embryo stelt de integratie van MITF: MITF DNA constructen in het genoom. Het is aangetoond dat twee of drie gecoïnjecteerd DNA constructen kunnen gecoïntegreerd in de vis genoom 31. Zo kan pigmentatie veroorzaakt door MITF uitdrukking dienen als een marker voor de integratie van de dβh: EGFP-MYCN transgen en snellere identificatie van MYCN stabiele transgene lijn. - Meng de d βh: EGFP-MYCN en MITF: MITF DNAconstructen in een 3: 1 verhouding in een totaal volume van 15 ul reactie met 1 ui I-Sce I enzymen en 0,75 pl buffer. Zorg ervoor dat de totale hoeveelheid DNA in de reactie niet meer dan 750 ng.
- Het uitvoeren van de I-SceI spijsvertering bij kamertemperatuur 4 uur of O / N. Op de tweede dag, de I-SceI- geknipte DNA klaar zijn voor micro-injectie of kunnen bij -20 ° C voor injectie in de toekomst worden opgeslagen. Bewaar de I-Sce I enzym bij -80 ° C in kleine porties zijn enzymefficiëntie handhaven.
- Subkloneren het menselijk ALKF1174L en wild-type ALK-gen van de pcDNA3 vector (een gulle gift van Dr. George bij het Dana-Farber Cancer Institute) 7 in EcoRI en Notl plaatsen van een pENTRY1A vector (een gulle gift van Dr. C. Grabher, Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, Duitsland) met T4 DNA ligase volgens het protocol van de fabrikant.
- Genereer de d βh: ALKF1174L </ Em> of dβh: ALKWT transgene constructies met behulp van de recombinant-systeem zoals vermeld in Protocol 1.2. Kortom, combineer drie binnenkomst klonen, dβh -pDONRP4-P1R, ALKF1174L- pENTRY1A (of ALKWT -pENTRY1A) en P3e-polyA, in de gewijzigde bestemming vector die I-SceI erkenning sites (een gulle gift van Dr. C. Grabher, Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, Duitsland), met LR Clonase enzymmengsel, volgens het protocol van de fabrikant.
- Meng de d βh: ALKF1174L (of dβh: ALKWT) en dβh: mCherry DNA-constructen in een 3: 1 verhouding en lineariseren ze met I-SceI enzym zoals beschreven in PROTOCOL 1,5-1,6.
2. Micro-injectie
- Gebruik glazen micropipetten met 1,0 mm diameter voor injecties 37. Breek het topje van de glazen micropipetten met een scheermesje voor injectie. Kalibreer de injectie volume door injecterening H2O in een druppel minerale olie. Meet de diameter van de resulterende druppels en stel de microinjector (druk of duur van drukpuls) ervoor zorgen dat het injectievolume minder dan 10% van het totale celvolume van een cel-embryo's.
- Voeg een extra 0,5 pi vers I-Sce I enzym (5 eenheden / ul) in 5 pl injectie oplossing die DNA constructen vlak voor de injectie om de efficiëntie van transgenese 38 verhogen. Injecteer 50-80 pg gelineariseerd DNA constructen in het cytoplasma van een cel embryo's. Om het succes van toediening te garanderen, meng het monster met 0,25% fenolrood voor visualisatie. Als cellen rood na de injectie, het geeft de micro-injectie succesvol is. Om een hoog slagingspercentage voor het genereren van transgene vis zorgen, we injecteren meestal maar liefst 500 embryo's.
- Om transgene vis stabiel tot expressie MYCN genereren, coinject de gelineariseerde d βh: EGFP-MYCN en MITF: MITF DNA-constructen (met een 3: 1 verhouding) in embryo's van pigmentatie mutant parelmoer zebravis één-cellig stadium. De expressie van MITF fungeert als reporter voor de integratie van transgene constructen in het genoom vis.
- Mozaïekpanelen overexpressie van ALK in het wild-type of MYCN transgene embryo, co-injecteren gelineariseerde d βh: ALK F1174L (of dβh: ALKWT) met dβh: mCherry DNA constructen (een 3: 1 verhouding) in de één-cel embryo's die voortvloeien uit de fokkerij van F1 heterozygote Tg (dβh: EGFP-MYCN) transgene vis met wild-type AB vis. Aldus helft van nakomelingen transgeen voor MCYN en helft wildtype.
3. Scherm voor Stabiele of Mosaic transgene vis
- Om de efficiëntie van identificatie van stabiele MYCN -expressie lines, verdoven primair geïnjecteerde embryo nair met tricaïne (0,02%) eent dagen 3-5 van postfertilization en het scherm voor pigmentatie. Breng de embryo's met pigmentatie een nieuwe petrischaal met vers ei water en verhogen ze geslachtsrijp verdere screening grondlegger vis, waarbij de d βh dragen: EGFP-MYCN transgen in de kiemcellen.
- Aan de stichter met kiemlijntransmissie van EGFP-MYCN, outcross gepigmenteerde F0 volwassen vis met wild-type AB vis en scherm voor EGFP-positieve embryo's in 1-2 dagen na de bevruchting voor verdere genotypering identificeren. Plaats één EGFP-positieve F1 embryo in een PCR-buis en verwijder alle vloeistof. Voeg 50 ui gDNA extractiebuffer die 12,5 ui 4x lysis buffer, 35 ui H2O en 2,5 ul proteinase K (10 mg / ml) aan één embryo bevat. Incubeer het reactiemengsel gedurende 2-3 uur bij 55 ° C, gevolgd door 10 min incubatie bij 98ºC om proteinase K te inactiveren Aan 50 ml van 4x lysis buffer, voeg 500 ul 1 M Tris (pH 8,4), 2,5 ml 1M KCl to 47 ml H2O OPMERKING: Na het F0 MYCN stabiele transgene vis worden gefokt met het wild-type AB vis, alle nakomelingen zijn gepigmenteerd. Aldus kan pigmentatie niet dienen als marker voor de identificatie van MYCN- positieve vis. Terwijl in de MYCN transgene vis, wordt de EGFP-MYCN fusie-eiwit expressie in de PSNS, inclusief het sympathische neuronen van de superieure cervicale ganglia en sequentiële segmentale ganglion van de sympathische keten en de niet-PSNS dopaminerge neuronen zoals de medulla oblongata en craniale ganglia 8. Aldus kan de expressie van EGFP dienen als een merker voor identificatie van de MYCN stabiele transgene embryo.
- Gebruik 2 pl gDNA geëxtraheerd uit de gepigmenteerde F1 embryo als sjabloon, primers MYCN-test F1: 5'-CTG CTT GAG AAC GAG CTG TG-3 '; MYCN -R3: 5'-AGG CAT CGT TTG AGG ATC AG-3 ', en het volgende programma with de GC-RICH PCR System: 1 cyclus van 95 ° C gedurende 3 min, 25 cycli van 95 ° C gedurende 30 seconden, 58 ° C gedurende 30 seconden en 72 ° C gedurende 3 min. We genotype doorgaans 14-16 gepigmenteerde's uit een enkele paring om de aanwezigheid van geïntegreerde MYCN transgen in de gepigmenteerde embryo, meer dan 6 grondlegger vis overexpressie MITF en MYCN werden geïdentificeerd door deze te bevestigen.
- Op te richten de rest van de EGFP-positieve F1 embryo's. Fin clip en genotype ze op 2-3 maand oud met behulp van het bovenstaande protocol om verder te bevestigen de integratie van MYCN transgen in de vis. Broeden F1 MYCN stabiele transgene vis met wild-type AB vis. Co-injecteer de gelinealiseerd d βh: ALK F1174L (of dβh: ALKWT) met dβh: mCherry DNA-constructen in de één-cel embryo's, zoals beschreven in Protocol 2.4.
- Sorteer de MYCN -waar embryo's in het experiment beschreven in Protocol 2.4 met behulp van een stereoscopische fluorescence microscoop en het scherm van de eerste plaats geïnjecteerde embryo's op dag 1-3 van postfertilization voor de expressie van EGFP-MYCN in de PSNS. Vervolgens, gedurende dag 2-5 van postfertilization, verdoven de embryo's met tricaïne (0,02%) en sorteren die MYCN- positief of negatief embryo wederom gebaseerd op de expressie van mCherry in de PSNS met een stereoscopische fluorescentiemicroscoop. De expressie van mCherry dient als een marker voor de co-expressie van ALK in weefsels van het mozaïek primaire geïnjecteerde dieren.
OPMERKING: ~ 600 nakomelingen als gevolg van het fokken van MYCN stabiele transgene vis met wild-type vis werden geïnjecteerd per groep met het gelineariseerde DNA-constructen, waaronder d βh: ALK F1174L en dβh: mCherry, dβh: ALKWT en dβh: mCherry, of dβh : mCherry alleen respectievelijk. Mozaïek expressie van mCherry kan worden waargenomen in 70-90% van de primair geïnjecteerde vis. Een half tot een-derde van de geïnjecteerde vissen overleefden door de larven podium voor tumor horloge. - Verhoog alle mCherry + MYCN + en mCherry + MYCN - embryo volgens de standaardprotocollen van de zebravis boek 39 en monitoren tumor ontstaan vanaf 5 weken postfertilization.
4. Tumor Kijk in Mozaïek transgene vis
- Monitor mCherry- positieve voornamelijk geïnjecteerd vis per 2 weken vanaf 5 weken postfertilization voor het bewijs van de tumor ontstaan.
- Verdoven vis met tricaïne (0,02%) en het scherm voor de aanwezigheid van mCherry - en EGFP expressie brengen tumoren in de PSNS onder Nikon SMZ-1500 stereoscopische fluorescentiemicroscoop uitgerust met een digitale zicht DS-U1 camera.
- Te bevestigen of de tumoren zijn de uiting van de ALK transgen, isoleren de mCherry- en EGFP-positieve massa's voor ALK genotypering PCR.
- Met behulp van PCR amplificeren van genomisch DNAgeëxtraheerd uit ontwikkelde tumoren met de volgende primers: ALK P7: 5'-AGG CCA GGT GTC CGG AAT GC-3 en ALK P18: 5'-TGT CTT CAG GCT GAT GTT GC-3 'en de volgende PCR-reactie: 1 cyclus van 94 ° C gedurende 5 min, 30 cycli van (94 ° C gedurende 30 sec, 55 ° C gedurende 30 seconden en 72 ° C gedurende 60 sec). Vervolgens opeenvolging het PCR-product met ALK P7 primer om verder te bevestigen het bestaan van mutant of wild-type ALK in de mCherry-positieve tumoren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om te onderzoeken of overexpressie van mutationeel geactiveerd ALK F1174L of wildtype ALK kan samenwerken met MYCN in neuroblastoom inductie, we ofwel geactiveerde humane ALK of wild type humaan ALK overexpressie gebracht onder controle van de d βh promoter in de PSNS van transgene vis overexpressie MYCN. Een van de volgende constructies, dβh - ALKF1174L of dβh - ALKWT, werden gecoïnjecteerd met dβh - mCherry tot één-cel wild-type of MYCN transgene embryo's (Figuur 2A) 8. De expressie van mCherry diende als een marker voor de co-expressie van ALK in weefsels van het mozaïek primaire geïnjecteerde dieren. Alle verwachte genotypen waren vertegenwoordigd in de geïnjecteerde vis: (1) MYCN -expressie vis met mozaïek co-expressie van geactiveerd ALKF1174L en mCherry MYCN -expressie vis met mozaïek co-expressie van wild-type ALK en mCherry, aangewezen MYCN; mozaïek ALKWT; (3) MYCN -expressie vis met mozaïek uitdrukking van mCherry, aangewezen MYCN; mozaïek mCherry; (4) wild-type vis met mozaïek co-expressie van geactiveerd ALKF1174L en mCherry, aangewezen WT; mozaïek ALKmut; en (5) wild-type vis met mozaïek co-expressie van wild-type ALK en mCherry, aangewezen WT; mozaïek ALKWT. Een tumor horloge werd vervolgens uitgevoerd om de 2 weken 5 weken postfertilization (wpf) op een totaal van 492 geïnjecteerde dieren.
Acht GFP + / mCherry + tumoren ontstaan in de interrenal klier, het menselijke bijnier gelijkwaardig, met 9 wpf in de MYCN -waar vis gecoïnjecteerd met d βh - ALKF1174 L en dβh - mCherry (Figuren 2B en 3). Deze tumoren waren histologisch, immunohistochemisch en ultrastructureel vergelijkbaar met de menselijke neuroblastoom (gegevens zijn te vinden in referentie-8). Daarentegen werden geen tumoren waargenomen bij 9 weken oud in de MYCN -waar vis gecoïnjecteerd met dβh - ALKWT en dβh - mCherry (Figuren 2C en 3, p = 0,002) of geïnjecteerd met dβh - mCherry alone (figuren 2D en 3, p = 0.007). Tumoren ontstaan in zowel de MYCN; mozaïek ALKWT en MYCN; mozaïek mCherry vis met dezelfde snelheid van inductie na 12 weken leeftijd. Bovendien werden neuroblastomen niet gedetecteerd in wildtype vis gecoïnjecteerd met ofwel het wildtype ALK en mCherry of ALKF1174L en mCherry transgenen gedurende de 15 weken van de monitoring. Tezamen bieden deze bevindingen blijkt dat mozaïek overexpressie van mutationeel geactiveerd ALK versnelt MYCN geïnduceerde tumor onset, ongeacht de integratieplaats in individuele mozaïek dieren, en dat overexpressie van wildtype ALK op de aangedreven door dβh promoter niveaus lijkt niet samenwerken met MYCN overexpressie te neuroblastoom induceren in dit modelsysteem.
Figuur 1: Schematisch overzicht van conventionele stabiele en mozaïek voorbijgaande zebravis transgene strategieën in de studie van de Coöperatieve bijdragen van kandidaat oncogenen tot Tumorgenese (A) Stabiele transgene strategie.. Gelineariseerde transgeen DNA-construct dat kandidaat oncogen geïnjecteerd in één-cellig stadium wild-type of mutant nair zebravisembryo's waar het transgen kan worden geïntegreerd in het genoom vis willekeurig genomische loci. Integratie van transgen in de kiemcellen is vereist voor de generation van stabiele transgene lijn. Voornamelijk geïnjecteerde embryo's te nemen 3 tot 4 maanden geslachtsrijp (F0 generatie van vis), die zal worden outcrossed met wild-type of parelmoer mutant vis om het scherm voor de stichter vis met het transgen kiemlijntransmissie bereiken. De resulterende nakomelingen van de oprichter van vis, aangeduid als de F1-generatie, dragen de heterozygote allelen van het transgen in hun genoom. Om de samenwerkende effecten van twee kandidaat oncogenen, zoals gentherapie "a" gen "b", in tumorigenese beoordelen we gefokt F1 nakomelingen van twee stabiele transgene lijnen overexpressie deze transgenen, slechts een kwart van nakomelingen die de verbinding transgenen. Vanwege de relatief lage efficiëntie van het genereren van stabiele transgene lijnen is deze benadering niet uitvoerbaar voor high-throughput functionele genomische analyse. (B) Mozaïek voorbijgaande transgene strategie. Net als de stabiele transgenese, gelineariseerd transgeen DNA co nstructs met kandidaatgenen worden geïnjecteerd in één-cellig stadium wildtype embryo. Omdat het transgen niet te worden geïntegreerd in het genoom van kiemcellen, kan veel tijd en moeite worden opgeslagen in de identificatie grondlegger vis. Indien daarentegen het transgene vis lijn overexpressie een van de kandidaat oncogenen is beschikbaar (in ons geval werden MYCN transgene vis ontwikkeld), gelineariseerd transgeen DNA constructen die andere kandidaatgenen worden geïnjecteerd in een cel stadium transgene embryo hun samenwerking bestuderen het ontstaan van tumoren. Tot drie transgene constructen kunnen worden gecoïnjecteerd en tot expressie komen in de eerste plaats geïnjecteerde vis 31; Zo kan de interactie van kandidaat oncogenen in het ontstaan van tumoren worden beoordeeld in het primair ingespoten vis. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
"Src =" / files / ftp_upload / 52567 / 52567fig2.jpg "/>
Figuur 2: Mozaïek Expressie van Geactiveerde ALK Versnelt de Onset van MYCN -geïnduceerde Neuroblastoom 8 Gemodificeerde figuur met toestemming van Elsevier (referentie 3466510609819).. (A) Aanpak voor het construeren van mozaïek transgenese. (BF) 2-dagen oude larven van primair geïnjecteerde embryo. Zijdelings uitzicht op stabiele EGFP expressie in de dopaminerge neuronen, waaronder craniale ganglia (CG, pijlpunten) in samengevoegde fluorescentie-helderveld beelden (bovenste panelen). Zijdelings uitzicht mozaïek mCherry expressie (onderste panelen) in de craniale ganglia (CG, pijlpunten), het verlengde merg (MO, pijlen). Sommige ectopische mCherry expressie wordt waargenomen in de niet-PSNS en niet- dopaminerge neuronen. (G - K) 7 weken oud primair ingespoten vis.(B, G) MYCN -expressie vis gecoïnjecteerd met d βh - ALKF1174L en dβh - mCherry construeert (MYCN; mozaïek ALKmut). EGFP - en mCherry -positieve tumoren ontstaan op 7 weken (witte lege pijlen in G). (C, H) MYCN -expressie vis gecoïnjecteerd met dβh - ALKWT en dβh - mCherry construeert (MYCN; mozaïek ALKWT). (D, I) MYCN -expressie vis geïnjecteerd met dβh - mCherry construeren alleen (MYCN; mozaïek mCherry). (E, J) Wild-type (WT) vis gecoïnjecteerd met dβh - ALKF1174L en dβh - mCherry construeert (WT; mozaïek ALKmut). (F, K) Wild-type (WT) vis gecoïnjecteerd met dβh - ALKWT en dβh - mCherry constructies (WT; mozaïek ALKWT). Neuroblastomen werden niet waargenomen in de MYCN -waar vis gecoïnjecteerd met dβh-ALKWT en dβh - mCherry of dβh - mCherry alleen al om 7 WPF, of in een van de broers en zussen die niet erven de MYCN transgen en werden geïnjecteerd met ofwel de ALKWT gen of de ALKF1174L gen. Schaal bars, 100 micrometer op B - F en 1 mm in G - K. Een Nikon SMZ-1500 stereoscopische fluorescentiemicroscoop uitgerust met een digitale zicht DS-U1 camera en Leica MZ10F stereoscopische fluorescentiemicroscoop uitgerust met een Leica DFC 345FX digitale camera gebruikt om de fluorescerende afbeeldingen.The vangen verkregen beelden werden bewerkt en samengesteld met Adobe Photoshop en Illustrator CS3 (Adobe) software. Klik hier om een grotere versie te bekijkenvan dit cijfer.
Figuur 3: Begin van Neuroblastoom in MYCN transgene vis of wild-type (WT) Vis als Mozaïeken gecoïnjecteerd met de DNA-constructen. Overgenomen met toestemming van Elsevier (referentie 3466510609819) d βh - ALKF1174 L en dβh - mCherry (mozaïek ALKmut). Dβh - ALKWT en dβh - mCherry (mozaïek ALKWT); of dβh - mCherry (mozaïek mCherry) alleen al 8. Het verschil tussen de tumor ontstaan door 9 wpf in de MYCN -waar vis gecoïnjecteerd met dβh - ALKF1174 L en dβh - mCherr y (MYCN; mozaïek ALKmut) en dat in de MYCN lijn gecoïnjecteerd met dβh - ALKWT dβh - mCherry (MYCN; mozaïek ALKWT) of dβh - mCherry alleen (MYCN; mozaïek mCherry) is significant bij p = 0,002 en p = 0,007, respectievelijk door een tweezijdige Fisher's exact test.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In deze representatieve studie, gebruikten we transiënte co-injectie en co-expressie van geactiveerde ALK de mCherry reportergen in MYCN -expressie transgene vis te tonen dat deze genen samenwerken om het begin van neuroblastoom, in overeenstemming met onze eerdere bevindingen in verbinding stabiele transgene vis co-expressie aanzienlijk versnellen zowel geactiveerd ALK en MYCN 8. Dit mozaïek transgene aanpak bezit een aantal verschillende voordelen ten opzichte van de conventionele methode. Meest belangrijk, het maakt een snelle onderzoek van de effecten van co-expressie kandidaat oncogenen in de eerste plaats ingespoten dieren (F0 generatie) zonder de vereiste voor stabiele transgene dieren, zoals het wegvallen van de overmatige tijd en arbeid meestal bezig met het fokken en identificatie van ALK -waar stabiele transgene vis. We hebben ook onderzocht het effect van overexpressie van wild-type ALK, met of zonder MYCN bovenexpressie op tumor initiatie. De resultaten laten zien dat voorbijgaande overexpressie van wild-type ALK in onze vis-model is niet voldoende om neuroblastoom ontstaan van tumoren initiëren, ongeacht de status van het MYCN oncogen. Het zou interessant zijn om te testen in de toekomst of transiënte co-expressie van zowel geactiveerde ALK en MYCN in wild-type vis eerder begin van het ontstaan van tumoren in de eerste plaats geïnjecteerd vis kon induceren. Dit onderzoek zou meer getrouw na te bootsen de werkelijke context ziekte, waarbij somatische veranderingen van beide genen co-optreden in een subset van hoog-risico neuroblastoom patiënten 5.
Een belangrijk element van het mozaïek voorbijgaande transgene strategie is het opnemen van een reportergen voor co-injectie met een kandidaat oncogenen plaats, hetgeen helpt bij het screenen voor dieren met succesvolle integratie van transgenen bij het primair geïnjecteerde zebravis embryo en de positieve vis voor toezicht Tumor ontstaan en de progressie. Om de efficiëntie van transgenese vergroten, hebben we de I-Sce-meganuclease gemedieerde transgene benadering, die aanzienlijk verhoogt de uniforme promoter-afhankelijke expressie van transgenen van 26% van de primair geïnjecteerde embryo zonder meganuclease tot 76% van de geïnjecteerde embryo's met meganuclease 38 aangebracht . Hoewel het gebruik van de I-Sce-meganuclease gemedieerde transgene benadering de efficiëntie van transgenese opmerkelijk is verbeterd, het percentage geïnjecteerde embryo positief voor de transgenen nog steeds ruim onder 100%. Aldus kan de expressie van een reportergen gecoïnjecteerd dienen als marker geïnjecteerde embryo met succesvolle integratie van kandidaat-transgenen te identificeren voor verdere analyse van de vis voor het ontstaan van tumoren. Daarentegen is een Tol2 transposon-gemedieerde transgene aanpak uitgegroeid tot een populaire genetische instrument in model gewervelde dieren en is met succes gebruikt voor transgenese, mutagenese, gene trapping, en enhancer trapping 40,41. Co-injectie van Tol2 transposon transposase mRNA in bevruchte embryo's vroege gebeurtenissen integratie die de efficiëntie van chromosomale integratie verhoogt en versterkt succesvolle kiemlijntransmissie van het transgen 42 vergemakkelijken. Vanwege de "cut-and-paste" mechanisme van DNA omzetting, een enkele kopie van transgen wordt geïntegreerd in het chromosoom per insertie locus 42. Aldus worden gecoïnjecteerd kandidaatgenen waarschijnlijk afzonderlijk geïntegreerd in het genoom vis op verschillende locaties, die kunnen leiden tot de expressie van kandidaat genen in verschillende cellen en een ingewikkelder transiënte en mozaïek expressiepatroon van gecoïnjecteerd genen in het primair geïnjecteerde vis.
Kortom, de huidige studie ondersteunt het toekomstige gebruik mozaïek transgenese een snelle wijze naar het samenwerkend misschien synergetische relatie tussen meerdere oncogenen in een high-de evaluatieroughput wijze, een uitdaging die moeilijk om met andere dierlijke modellen, waaronder knaagdieren. Tot nu toe, deze strategie is ook met succes toegepast in transgene zebravis genen die de geactiveerde RAS geïnduceerde opening van rhabdomyosarcoom 31 onderdrukken en de stralingsgevoeligheid van MYC-geïnduceerde T-cel acute lymfatische leukemie 31 wijzigen identificeren. Bovendien Langenau et al, 15 hebben aangetoond dat de combinatie van de co-injectie aanpak met een heat-shock-induceerbare transgene aanpak transgene expressie kan induceren door heat shock in het primair ingespoten vis, die zeer nuttig zijn bij het verkennen van de coöperatie rollen van oncogenen in de tumor zou zijn progressie, want het laat genexpressie wordt ingeschakeld nadat de primaire tumor is vastgesteld. Zeer recent, Langenau en collega's ontwikkelde de eerste immuungecompromitteerde zebravismodel door zich te richten RAG2 gen met gemanipuleerde zink-vinger nucleases 43. Verliesfunctieverlies van RAG2 toegestane robuuste en langdurige aanslaan van meerdere weefsels en kankercellen 43, een voordeel dat nuttig transplanteren van de heterogene kankercellen die kandidaat transgenen overexpressie en het effect van mozaïek transgenexpressie op zelfvernieuwingscapaciteit, therapeutisch kunnen zijn reacties en de groeisnelheid van deze kankercellen.
Tot slot, mozaïek transgenese biedt een ander uniek voordeel ten opzichte van stabiele transgenese. Bij stabiele transgene dieren, worden de transgenen geïntegreerd in het genoom van elke cel in het lichaam en zijn erfelijk van generatie op generatie 27. Veel kankers ontstaan door genetische veranderingen in somatische cellen plaats van erfelijke mutaties in kiemcellen 44. Zo is de mozaïek patroon van transgene integratie in de primaire geïnjecteerd vis en de gemengde genotypen binnen cel populaties van individuele mozaïek transgene vis zou beter recapituleren the somatische afwijkingen gevonden bij patiënten en zou de kunstmatige positionele effect veroorzaakt door een enkele plaats waar ze in een stabiele transgene lijn te voorkomen. Aan de andere kant, de mosaïcisme en kleine populatie van overexpressie de transgenen in het primair geïnjecteerde vis maakt mechanistische onderzoek bemoeilijkt.
Samengevat, het mozaïek transgene strategie biedt een robuust hulpmiddel voor een snelle en effectieve beoordeling van de coöperatie bijdrage van oncogenen aan tumorinitiatie en te verspreiden. Dit voorschot zal naar verwachting rudimentaire informatie over de interactie tussen kandidaat oncogenen, die dringend nodig is voor de verdere productieve onderzoek van oncogene mechanismen en paden en voor het ontwikkelen van effectieve gerichte therapie te genereren. De efficiëntie van co-integratie van meer dan drie gecoïnjecteerd DNA constructen zou de mogelijkheid openen voor het onderzoek van de complexe relaties tussen gelijktijdig uitgedrukt multigenfamilie combinaties diverse cancenten. Uitdagingen voor de toekomst zal zijn om het mozaïek transgene strategie om elke genomische of epigenetische veranderingen die een rol zouden kunnen spelen bij de neoplastische proces, in plaats van te beperken het gebruik ervan tot mutaties die alleen eiwit-codering te veranderen of om genen tegemoet te wijzigen zijn overexpressie, gewonnen of geamplificeerd. Recentelijk zijn verbeterd genoom bewerkingstechnieken, zoals transcriptie activator-achtige effector nucleasen (TALENS) 45 en geclusterde regelmatig afgewisseld korte palindroom herhalingen (CRISPR) / CRISPR-geassocieerde (Cas) systemen 46, schaal worden gebruikt sneller en efficiënt endogene wijzigen genen in verschillende soorten cellen en organismen 46. Dergelijke technieken zou ons in staat om te presteren gerichte, zeer efficiënte modificaties van genoomsequentie en genexpressie in de zebravis modelsysteem en om beter inzicht in het mechanisme (s) ten grondslag liggen aan de rol van genomische of epigenetische veranderingen in de tumor pathogenese. Deze op hun beurt waarschijnlijk sporen the ontwikkeling van nieuwe moleculaire therapieën voor een scala van kanker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Expand Long Template PCR System | Roche Applied Science, IN | 11681834001 | |
| pCR-TOPO vector | Invitrogen, CA | 451641 | |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs, MA | M0202M | |
| Gateway LR Clonase II enzyme Mix |
Invitrogen, CA | 11791-100 | |
| Gateway® BP Clonase® II enzyme mix | Invitrogen, CA | 11789-020 | |
| GC-RICH PCR System | Roche Applied Science, IN | 12 140 306 001 | |
| Meganuclease I-SceI | New England Biolabs, MA | R0694S | |
| Nikon SMZ-1500 stereoscopic fluorescence microscope | Nikon, NY | ||
| Nikon digital sight DS-U1 camera | Nikon, NY |
References
- Tenesa, A., Dunlop, M. G. New insights into the aetiology of colorectal cancer from genome-wide association studies. Nat Rev Genet. 10 (6), 353-358 (2009).
- Maher, B. Exome sequencing takes centre stage in cancer profiling. Nature. 459 (7244), 146-147 (2009).
- Meyerson, M., Gabriel, S., Getz, G. Advances in understanding cancer genomes through second-generation sequencing. Nat Rev Genet. 11 (10), 685-696 (2010).
- Chung, C. C., Chanock, S. J. Current status of genome-wide association studies in cancer. Hum Genet. 130 (1), 59-78 (2011).
- Mosse, Y. P., et al. Identification of ALK as a major familial neuroblastoma predisposition gene. Nature. 455 (7215), 930-935 (2008).
- Janoueix-Lerosey, I., et al. Somatic and germline activating mutations of the ALK kinase receptor in neuroblastoma. Nature. 455 (7215), 967-970 (2008).
- George, R. E., et al. Activating mutations in ALK provide a therapeutic target in neuroblastoma. Nature. 455 (7215), 975-978 (2008).
- Zhu, S., et al. Activated ALK Collaborates with MYCN in Neuroblastoma Pathogenesis. Cancer Cell. 21 (3), 362-373 (2012).
- White, R., Rose, K., Zon, L. Zebrafish cancer: the state of the art and the path forward. Nat Rev Cancer. 13 (9), 624-636 (2013).
- Amatruda, J. F., Patton, E. E. Genetic models of cancer in zebrafish. Int Rev Cell Mol Biol. 271, 1-34 (2008).
- Konantz, M., et al. Zebrafish xenografts as a tool for in vivo studies on human cancer. Ann N Y Acad Sci. 1266, 124-137 (2012).
- Ellenbroek, S. I., van Rheenen, J. Imaging hallmarks of cancer in living mice. Nat Rev Cancer. 14 (6), 406-418 (2014).
- Kettleborough, R. N., et al. A systematic genome-wide analysis of zebrafish protein-coding gene function. Nature. 496 (7446), 494-497 (2013).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Langenau, D. M., et al. Myc-induced T cell leukemia in transgenic zebrafish. Science. 299 (5608), 887-890 (2003).
- Feng, H., et al. T-lymphoblastic lymphoma cells express high levels of BCL2, S1P1, and ICAM1, leading to a blockade of tumor cell intravasation. Cancer Cell. 18 (4), 353-366 (2010).
- Patton, E. E., et al. BRAF mutations are sufficient to promote nevi formation and cooperate with p53 in the genesis of melanoma. Current biology : CB. 15 (3), 249-254 (2005).
- Santoriello, C., Anelli, V., Alghisi, E., Mione, M. Highly penetrant melanoma in a zebrafish model is independent of ErbB3b signaling. Pigment Cell Melanoma Res. 25 (2), 287-289 (2012).
- Leacock, S. W., et al. A zebrafish transgenic model of Ewing's sarcoma reveals conserved mediators of EWS-FLI1 tumorigenesis. Dis Model Mech. 5 (1), 95-106 (2012).
- Le, X., et al. Heat shock-inducible Cre/Lox approaches to induce diverse types of tumors and hyperplasia in transgenic zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (22), 9410-9415 (2007).
- Langenau, D. M., et al. Effects of RAS on the genesis of embryonal rhabdomyosarcoma. Genes & development. 21 (11), 1382-1395 (2007).
- Park, S. W., et al. Oncogenic KRAS induces progenitor cell expansion and malignant transformation in zebrafish exocrine pancreas. Gastroenterology. 134 (7), 2080-2090 (2008).
- Zheng, W., et al. Xmrk, kras and myc transgenic zebrafish liver cancer models share molecular signatures with subsets of human hepatocellular carcinoma. PLoS One. 9 (3), e91179 (2014).
- Forrester, A. M., et al. NUP98-HOXA9-transgenic zebrafish develop a myeloproliferative neoplasm and provide new insight into mechanisms of myeloid leukaemogenesis. British journal of haematology. 155 (2), 167-181 (2011).
- Alghisi, E., et al. Targeting oncogene expression to endothelial cells induces proliferation of the myelo-erythroid lineage by repressing the Notch pathway. Leukemia. 27 (11), 2229-2241 (2013).
- Veinotte, C. J., Dellaire, G., Berman, J. N. Hooking the big one: the potential of zebrafish xenotransplantation to reform cancer drug screening in the genomic era. Dis Model Mech. 7 (7), 745-754 (2014).
- Patton, E. E., Zon, L. I. The art and design of genetic screens: zebrafish. Nat Rev Genet. 2 (12), 956-966 (2001).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
- Igoucheva, O., Alexeev, V., Yoon, K. Differential cellular responses to exogenous DNA in mammalian cells and its effect on oligonucleotide-directed gene modification. Gene Ther. 13 (3), 266-275 (2006).
- Koster, R. W., Fraser, S. E. Tracing transgene expression in living zebrafish embryos. Dev Biol. 233 (2), 329-346 (2001).
- Langenau, D. M., et al. Co-injection strategies to modify radiation sensitivity and tumor initiation in transgenic Zebrafish. Oncogene. 27 (30), 4242-4248 (2008).
- Chen, Y., et al. Oncogenic mutations of ALK kinase in neuroblastoma. Nature. 455 (7215), 971-974 (2008).
- Pugh, T. J., et al. The genetic landscape of high-risk neuroblastoma. Nature genetics. , (2013).
- Berry, T., et al. The ALK(F1174L) mutation potentiates the oncogenic activity of MYCN in neuroblastoma. Cancer Cell. 22 (1), 117-130 (2012).
- Heukamp, L. C., et al. Targeted expression of mutated ALK induces neuroblastoma in transgenic mice. Sci Transl Med. 4 (141), 141ra191 (2012).
- Lister, J. A., Robertson, C. P., Lepage, T., Johnson, S. L., Raible, D. W. nacre encodes a zebrafish microphthalmia-related protein that regulates neural-crest-derived pigment cell fate. Development. 126 (17), 3757-3767 (1999).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
- Thermes, V., et al. I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish. Mech Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- Urasaki, A., Asakawa, K., Kawakami, K. Efficient transposition of the Tol2 transposable element from a single-copy donor in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (50), 19827-19832 (2008).
- Caneparo, L., Pantazis, P., Dempsey, W., Fraser, S. E. Intercellular bridges in vertebrate gastrulation. PLoS One. 6 (5), e20230 (2011).
- Ivics, Z., Izsvak, Z. The expanding universe of transposon technologies for gene and cell engineering. Mob DNA. 1 (1), 25 (2010).
- Tang, Q., et al. Optimized cell transplantation using adult rag2 mutant zebrafish. Nat Methods. 11 (8), 821-824 (2014).
- Watson, I. R., Takahashi, K., Futreal, P. A., Chin, L. Emerging patterns of somatic mutations in cancer. Nat Rev Genet. 14 (10), 703-718 (2013).
- Sander, J. D., et al. Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs. Nat Biotechnol. 29 (8), 697-698 (2011).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol. 32 (4), 347-355 (2014).
