Mosaic Sebrafisk transgenesis for Funksjonell Genomisk Analyse av søker Cooperative Gener i Tumor Patogenese

Summary

The goal of this study is to demonstrate how the mosaic transgenesis strategy can be used in zebrafish to rapidly and efficiently assess the relative contributions of multiple oncogenes in tumor initiation and progression in vivo.

Abstract

Comprehensive genomic analysis has uncovered surprisingly large numbers of genetic alterations in various types of cancers. To robustly and efficiently identify oncogenic “drivers” among these tumors and define their complex relationships with concurrent genetic alterations during tumor pathogenesis remains a daunting task. Recently, zebrafish have emerged as an important animal model for studying human diseases, largely because of their ease of maintenance, high fecundity, obvious advantages for in vivo imaging, high conservation of oncogenes and their molecular pathways, susceptibility to tumorigenesis and, most importantly, the availability of transgenic techniques suitable for use in the fish. Transgenic zebrafish models of cancer have been widely used to dissect oncogenic pathways in diverse tumor types. However, developing a stable transgenic fish model is both tedious and time-consuming, and it is even more difficult and more time-consuming to dissect the cooperation of multiple genes in disease pathogenesis using this approach, which requires the generation of multiple transgenic lines with overexpression of the individual genes of interest followed by complicated breeding of these stable transgenic lines. Hence, use of a mosaic transient transgenic approach in zebrafish offers unique advantages for functional genomic analysis in vivo. Briefly, candidate transgenes can be coinjected into one-cell-stage wild-type or transgenic zebrafish embryos and allowed to integrate together into each somatic cell in a mosaic pattern that leads to mixed genotypes in the same primarily injected animal. This permits one to investigate in a faster and less expensive manner whether and how the candidate genes can collaborate with each other to drive tumorigenesis. By transient overexpression of activated ALK in the transgenic fish overexpressing MYCN, we demonstrate here the cooperation of these two oncogenes in the pathogenesis of a pediatric cancer, neuroblastoma that has resisted most forms of contemporary treatment.

Introduction

Kreft er progressive sykdommer preget av opphopning av patologiske mutasjoner, slettinger og kromosom gevinster over tid. Disse genetiske avvik kan påvirke flere cellulære prosesser som strekker seg fra cellesyklus, celledød, energisk metabolisme og montering av cytoskjelettet til stressresponser som hypoksi. Derfor reflekterer tumorigenesis de kollektive handlinger av flere genetiske avvik over et spektrum av biologiske prosesser. Nyere integrerende genomisk forskningsinnsats, inkludert hele genomsekvensering, exome sekvensering, målrettet sekvensering, dyp sekvensering og genom-wide association studies, har identifisert et økende antall nye genetiske endringer i hovedsak alle typer svulster ^1-4. I mange tilfeller oppstår genetiske lesjoner sammen i et ikke-tilfeldig måte ^5-8, noe som tyder på deres samarbeid i sykdom patogenesen. Dissekere de onkogene roller stort utvalg av abnorme uttrykte gener som følge fROM disse genomiske lesjoner er nødvendig å finne nye terapeutiske strategier og å forstå svarene av kreftceller til disse midlene, men dette har vist seg å være en vanskelig oppgave, som krever svært robuste dyr modellsystemer for gjennomføringen av høy gjennomstrømming funksjonell genomanalyse vivo.

Selv om pattedyr, spesielt gnagere, er favoriserte modeller i kreft biologi, har sebrafisk begynt å tiltrekke seg stor oppmerksomhet. Den teleost sebrafisk (Dario rerio) har blitt brukt som modellorganisme for utviklingsstudie siden 1960-tallet og ble først brukt til studiet av svulst patogenesen i 1982 ^9-11. Enkelt vedlikehold, liten kroppsstørrelse, og høy fruktbarhet gjør sebrafisk en robust modell for store termin genetiske skjermer for å identifisere mutasjoner som unormale og patologiske fenotyper ^10. Den optiske åpenhet av sebrafisk embryo er en annen viktig funksjon som støtter større bruk av denne kreft-modellen, somdet tillater in vivo avbildning skal gjennomføres for å finne svulst utvikling i sanntid ^9, et program som er relativt vanskelig i gnagere ^12. Nyere komparative genomikk analyse av sebrafisk referansen genomet (Zv9) avslørte 26 206 proteinkodende gener, med 71% å ha menneskelige orthologues, hvorav 82% er korrelert med sykdomsassosierte gener i Online Mendels arvelover i Man (OMIM) database ^{13, 14.} Derfor har sebrafisk blitt brukt til å modellere ulike typer kreft hos mennesker, inkludert neuroblastom ^8, T-celle akutt lymfatisk leukemi (T-ALL) ^15,16, melanom ^17,18, Ewings sarkom ^19, rhabdomyosarcoma ^20,21, bukspyttkjertelkreft ^22, leverkreft ²³ og myeloide kreft ^24,25, og har blitt valgt som en kreft modell for xenotransplantasjon studerer ^11,26.

En stabil transgentilnærming i sebrafisk er ofte brukt for å studere effekten av gain-of-funksjon av gener i normal utvikling eller sykdom patogenesen ^27,28. For å utvikle en slik modell (figur 1A), injiserer man en DNA-konstruksjon som inneholder genet av interesse som drives av en vevsspesifikk promoter i en celle-villtype-embryoer. Tre til fire måneder etter injeksjon, når de injiserte embryoer blir kjønnsmodne, de outcrossed med vill-type fisk til skjermen for de som viser integrering av DNA konstruere i deres kimlinje, som lisensierer dem som grunnleggeren fisk. Mange faktorer, slik som kopiantall og integrering området av transgenet, påvirker ekspresjonen av transgenet i stabile transgene linjer. Således, for å utvikle en transgen tumormodell, flere stabile transgene linjer som overuttrykker et enkelt onkogen må genereres først og screenet for linje som uttrykker transgenet på et nivå som kan føre til tumorfremkallelse. Men hvis overekspresjon av en kandidat oncogene er giftig for bakterieceller, er det vanskelig å generere en stabil transgen linje ved direkte overekspresjon i transgen ^29. Følgelig kan denne metode være tidkrevende, med en høy risiko for svikt til å generere en passende kreftmodell.

Her illustrerer vi en alternativ strategi basert på mosaikk transient transgenesis (figur 1B) som gir unike fordeler fremfor tradisjonell stabil transgenesis for funksjonell genomstudie in vivo. I denne fremgangsmåten blir en eller flere av transgene konstruksjoner injisert i en celle-stadiet av transgene eller villtype-embryoer. De injiserte DNA-konstruksjoner inneholdende transgener er da mosaically og tilfeldig integrert i primær injisert fisk, noe som resulterer i blandede genotyper i flere cellepopulasjoner i enkeltfisk ^30. Videre coinjection av flere DNA konstruerer i ett-celle embryo fører til co-integrering i samme celle på tilfeldige steder, slik at man i Trace cellene med uttrykk av transgener og utforske samspillet mellom ulike gener under sykdom patogenesen i mosaikk dyr ^31. Som bevis for prinsippet vi transient overuttrykt mutasjons aktivert ALK (F1174L) med mCherry reporter-genet i det perifere sympatiske nervesystem (PSNS) under kontroll av dopamin-beta-hydroksylase (d .eH) promoter i vill-type fisk og transgen fisk som overuttrykker MYCN. ALK, som koder for en reseptor tyrosin kinase, er den hyppigst muterte genet i høy-risiko neuroblastom ^5-7,32,33. ALK (F1174L), som en av de mest hyppige og potente somatiske aktiverende mutasjoner, er overrepresentert i MYCN- forsterket høyrisiko neuroblastom pasienter og synergizes med MYCN overekspresjon å akselerere neuroblastom tumorigenesis i både stabile gene mus og transgene sebrafisk modeller ^8,34,35. Av mosaikktransient overekspresjon av ALK (F1174L) med mCherry i MYCN transgen fisk, rekapitulert vi akselerasjonen av begynnende svulstdannelse observert i den stabile transgene fisken overekspresjon både ALK (F1174L) og MYCN, noe som tyder på at mosaikken transgenesis strategi kan brukes til raskt og effektivt vurdere de relative bidrag fra flere oncogenes i startfasen i vivo.

Protocol

MERK: Alle sebrafisk studier og vedlikehold av dyrene ble gjort i samsvar med Mayo Clinic Institute IACUC-godkjent protokoll # A41213. 1. DNA-konstruksjoner for transgenesis Forsterke en 5,2-kb dopamin beta hydroksylase (d .eH) promoter region 8 bruker CH211-270H11 BAC klone (fra BacPac ressurser sentrum (BPRC)) som en DNA-mal. Bruke en PCR-system egnet for lang og nøyaktig PCR-amplifisering av lange DNA-templater, og de følgende syklusprogrammer for PCR: 94 …

Representative Results

For å undersøke hvorvidt overekspresjon av mutasjons aktivert ALK F1174L eller villtype-ALK kunne samarbeide med MYCN i neuroblastom induksjon, overuttrykt vi enten aktivert humant ALK eller vill-type human ALK under kontroll av d .eH-promoteren i PSNS av transgen fisk som overuttrykker MYCN. Et av følgende konstruksjoner, dβh – ALKF1174L eller dβh – ALKWT, ble coinjected med dβh – mCherry i ett-cel…

Discussion

I denne representative studien brukte vi forbigående coinjection og koekspresjon av aktivert ALK med mCherry reporter genet i MYCN -expressing transgen fisk å vise at disse genene samarbeide til markert akselerere utbruddet av nevroblastom, i tråd med vår tidligere funn i forbindelse stabil transgen fisk coexpressing både aktivert ALK og MYCN ^8. Denne mosaikk transgen tilnærming besitter flere klare fordeler i forhold til den konvensjonelle metoden. Det vikti…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number
Expand Long Template PCR System	Roche Applied Science, IN	11681834001
pCR-TOPO vector	Invitrogen, CA	451641
T4 DNA ligase	New England Biolabs, MA	M0202M
Gateway LR Clonase II enzyme Mix	Invitrogen, CA	11791-100
Gateway® BP Clonase® II enzyme mix	Invitrogen, CA	11789-020
GC-RICH PCR System	Roche Applied Science, IN	12 140 306 001
Meganuclease I-SceI	New England Biolabs, MA	R0694S
Nikon SMZ-1500 stereoscopic fluorescence microscope	Nikon, NY
Nikon digital sight DS-U1 camera	Nikon, NY