Hög kapacitet Screening för kemiska modulatorer av Post-transkription Reglerade Gener
Summary
Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3’ UTR.
Abstract
Både transkription och posttranskriptionell reglering har en djupgående inverkan på gener uttryck. Men vanligen antagits cellbaserade screeninganalyser fokuserar på transkriptionsreglering, som i huvudsak syftar till att identifiera promotor-målsökande molekyler. Som ett resultat, är post-transkriptionella mekanismer till stor del otäckt av genuttryck riktad läkemedelsutveckling. Här beskriver vi en cellbaserad analys som syftar till att undersöka den roll som den otranslaterade 3'-regionen (3 'UTR) i moduleringen av ödet av dess mRNA, och vid identifiering av föreningar som kan modifiera den. Analysen är baserad på användningen av en luciferasrapportör konstruktion innehållande 3 'UTR av en gen av intresse integreras stabilt i ett sjukdoms relevant cellinje. Protokollet är uppdelad i två delar, med initialt fokus på den första undersökningen som syftar till att identifiera molekyler som påverkar luciferasaktivitet efter 24 timmar av behandling. Den andra delen av protokolletbeskriver kontra screening nödvändigt att diskriminera föreningar som modulerar luciferasaktivitet specifikt genom 3 'UTR. Utöver den detaljerade protokoll och representativa resultat, vi ger viktiga överväganden om analysutveckling och validering av träffen (s) på endogena målet. Den beskrivna cellbaserade reportergenanalys tillåter forskarna att identifiera molekyler modulerproteinnivåer via post-transkription mekanismer beroende på en 3 'UTR.
Introduction
Under en lång period transkriptionell reglering av gen-expression tros spela en viktig, om inte exklusiv roll i kontrollen proteinproduktion. Ackumulerande bevis tyder emellertid på att posttranskriptionell reglering bidrar lika mycket som, om inte mer än, transkriptionsreglering för att bestämma cellulärt protein överflöd 1,2. Posttranskriptionell kontroll av genuttryck är mycket mer komplex och genomarbetade än var vid första tanken. I själva verket har alla de olika stadierna av posttranskriptionell kontroll framkom att regleras, inklusive mRNA bearbetning, lokalisering, omsättning, översättning 3 samt den nyligen beskrivna reversibla RNA metylering 4. Från ett antal post-transkriptionell reglering processer kan beröras, beskrev analysen nedan fokuserar på de som involverar mRNA 3 'otranslaterad region (3' UTR). 3 'UTR påverkar i stort sett mRNA öde främst via specifik interaktion av RNA-bindande proteins och icke-kodande RNA till dess reglerande sekvenser och / eller sekundära strukturer 5. Därför kommer små molekyler som förändrar dessa interaktioner eller störa uppströms signaltransduktionsvägar skifta balansen som reglerar protein överflöd. Denna terapeutiska tillvägagångssätt är av särskild betydelse för mänskliga sjukdomar för vilka belägg som visar att sjukdomsrelevanta generna utsätts för posttranskriptionell reglering, som därmed utgör ett potentiellt mål för farmakologisk intervention. Därför kan system som möjliggör screening av mRNA nivåer "modulatorer genom interferens med post-transkription kontrollmekanismer i en hög genomströmning format blir värdefulla verktyg i identifieringen av potentiella nya behandlingar.
Den beskrivna cellbaserad reportergen analysen möjliggör identifiering av föreningar som kan modulera mRNA öde via mekanismer som är beroende på dess 3 'UTR. Den består av flera huvud components (Figur 1) och kräver några inledande steg för att validera genomförbarheten av analysen. Först av allt, är reporterkonstruktionen konstruerad att inkludera 3'-ITR från en gen av intresse. Den 3 'UTR smälts till änden av en reportergen såsom eldflugeluciferas (Figur 1). Eventuella ändringar i posttranskription kontrollmekanismer som utövas genom den införda 3 'UTR kommer att förändra stabilitet och / eller effektivitets översättning av denna chimär transkript, vilket resulterar i varierande luciferas nivåer. Därför, förändringar i luciferasaktivitet tjäna som indirekt mått på drabbade post-transkriptionell reglering av genen av intresse. Den andra komponenten i systemet är en styrreporterkonstruktion, en identisk expressionsplasmid som uttrycker samma reportergenen men som inte innehåller någon 3 'UTR. De två reporterplasmider kan utformas i labbet med hjälp av konventionella molekylärbiologiska protokoll eller köpas från kommersiella källor.
Valet av en lämplig cellinje är kritisk för analysen konstruktion. Vilken cellinje är den optimala modellen beror på flera faktorer som sträcker sig från kliniska krav som maximal likhet med patologi att bara praktiska frågor som tillgänglighet, transfectability och tillväxtegenskaper. Viktigt före vidare en bör se till att fusion av 3 'UTR till reportergenen har en förväntad effekt på nivån av den chimära transkriptet. Frånvaron av signifikant skillnad i luciferas signal från 3 'UTR bärande och kontroll reporter konstruktioner transient i de markerade cellerna skulle indikera att 3' UTR fungerar inte i denna cellulära modell, fråga efter jakt efter alternativa sådana. För hög genomströmning format, bör de 3 'UTR bärande och luciferas kontroll reporter konstruktioner stabilt integreras i den valda cellinje. Med hjälp av en stabilt integrerad över transient transfekteradecellinje är att föredra av flera skäl. Detta kommer att bredda valet av en cellulär modell inkluderande svår transfektera cellinjer, minska variationen i uppgifterna på grund av fluktuationer i transfektionseffektivitet, avta kostnaderna. Dessutom, efter transient transfektion celler mycket ofta överbelastade med en DNA-plasmid som leder till mättnad av systemet. I dessa inställningar en ytterligare ökning av reportern uttrycket kan vara utmanande, vilket resulterar i minskad känslighet för potentiella upregulating föreningar.
Slutligen när alla analyskomponenter sätts upp, är det viktigt för flyttning till hög genomströmning format för att avgöra om det är möjligt för analysen, dvs om luciferasaktivitet kan vara verkligen upp- och nedregleras specifikt via insatt 3 ' UTR. De bästa kontrollerna skulle vara små molekyler rapporterats att modulera stabiliteten eller översättbarhet av mRNA genom 3 'UTR av intresse. Om att ha dessa ärinte är möjligt, är surrogat kontroller imiterar den önskade effekten accepteras. Dessa kan vara miRNA eller RNA-bindande proteiner som är kända för att utöva sina effekter via bindning till den 3 'UTR av intresse. Utvärdering av sådana kontroller innan den första undersökningen visar inte bara funktionalitet utvecklade analysen, men också tillåter uppskattning av dess dynamiska omfång, känslighet och prestanda i hög genomströmning format.
Använda beskrivna protokollet vi skärmad en 2.000-förening bibliotek 6. Neuroblastom är den vanligaste extrakraniella fast tumör av linda, användes som en biologisk modell och 3 'UTR av MYCN onkogenen, vars förstärkning förutsäger starkt negativt utfall av neuroblastom, såsom en målgen 7. Figur 2 skisserar experimentella layouten. Screeningen delades i tre körningar med satsstorlek på 27 plattor screenade i en körning. Satsen av 27 plattor ingår Spectrum Collection bibliotekplattor n.1-n.8 + n.25 (första körningen), n.9-n.16 + n.25 (andra åket) och n.16-n.24 + n.25 (tredje körning), vardera platta skärmad i tre exemplar. Således var ett bibliotek platta (n.25) analyseras inom alla tre körningar gör möjligt inter run jämförelse. Protokollet nedan beskriver en enda körning av nio biblioteksplattor testade i tre exemplar.
Protocol
Representative Results
Discussion
This protocol describes a cell-based reporter-gene assay aiming at the identification of modulators that target 3’ UTR-dependent post-transcriptional processes. It encompasses the primary screening and the counter-screen and, if needed, can be accompanied by a cytotoxicity assay. The outcome of the primary screening is a number of valuable candidate compounds, whose reproducibility and specificity is further validated in the counter-screening.
The identification of primary hits is based …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Italian Neuroblastoma Foundation for the full financial support to this project.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Culture plate 96-well White | PerkinElmer | 6005688 | |
| StorPlate 96-well U bottom (dilution plate) | PerkinElmer | 6008190 | |
| 100 ml disposable trough for reagents | Tecan | 10 613 048 | |
| 300 ml disposable robotic reservoir | VWR | PB12001301 | |
| Robot tips DITI 50μL Sterile | Tecan | 30038607 | |
| Robot tips DITI 200μL Sterile | Tecan | 30038617 | |
| Matrix 1.4 ml 2D Barcoded w, Flat Bottom Tubes | Thermo Scientific | 3711 | |
| ONE-Glo Luciferase Assay System | Promega | E6120 | |
| RPMI | Lonza | BE12-918F | |
| PBS-1X, w/o Ca++, Mg++ | Lonza | BE17-516F | |
| L-Glutamine 200mM | Lonza | BE17-605E | |
| FBS | Lonza | DE14-801F | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| The Spectrum collection (compound library) | MicroSource Discovery Systems | N/A | |
| Tecan Freedom EVO200 robot | Tecan | N/A | |
| Tecan F200 multiplate reader | Tecan | N/A |
References
- Schwanhäusser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
- Tebaldi, T., et al. Widespread uncoupling between transcriptome and translatome variations after a stimulus in mammalian cells. BMC Genomics. 13 (1), 220 (2012).
- Mitchell, S. F., Parker, R. Principles and properties of eukaryotic mRNPs. Mol. Cell. 54 (4), 547-558 (2014).
- Fu, Y., Dominissini, D., Rechavi, G., He, C. Gene expression regulation mediated through reversible m6A RNA methylation. Nat. Rev. Genet. 15 (5), 293-306 (2014).
- Matoulkova, E., Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. The role of the 3’ untranslated region in post-transcriptional regulation of protein expression in mammalian cells. RNA Biol. 9 (5), 563-576 (2012).
- Sidarovich, V., Adami, V., Quattrone, A. A Cell-Based High-Throughput Screen Addressing 3’ UTR-Dependent Regulation of the MYCN Gene. Mol. Biotechnol. 56 (7), 631-643 (2014).
- Cheung, N. -. K. V., Dyer, M. A. Neuroblastoma: developmental biology, cancer genomics and immunotherapy. Nat. Rev. Cancer. 13 (6), 397-411 (2013).
- Hughes, J. P., Rees, S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L. Principles of early drug discovery. Br. J. Pharmacol. 162 (6), 1239-1249 (2011).
- Herbst, J., et al. Multiplexing a high-throughput liability assay to leverage efficiencies. Assay Drug Dev. Techn. 7 (3), 294-303 (2009).
- van Olst, E. S. i. e. b. r. i. n. g. -., et al. Affordable luciferase reporter assay for cell-based high-throughput screening. J. Biomol. Screen. 18 (4), 453-461 (2013).
- Baker, J. M., Boyce, F. M. High-throughput functional screening using a homemade dual-glow luciferase assay. J. Vis. Exp. (88), (2014).
- Malo, N., Hanley, J. A., Cerquozzi, S., Pelletier, J., Nadon, R. Statistical practice in high-throughput screening data analysis. Nat. Biotechnol. 24 (2), 167-175 (2006).
- Hitti, E., et al. A versatile ribosomal protein promoter-based reporter system for selective assessment of RNA stability and post-transcriptional control. RNA. 16 (6), 1245-1255 (2010).
- Oikonomou, P., Goodarzi, H., Tavazoie, S. Systematic identification of regulatory elements in conserved 3’ UTRs of human transcripts. Cell Rep. 7 (1), 281-292 (2014).
- Gandin, V., et al. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. J. Vis. Exp. (87), (2014).
- Conne, B., Stutz, A., Vassalli, J. D. The 3’ untranslated region of messenger RNA: A molecular “hotspot” for pathology. Nat. Med. 6 (6), 637-641 (2000).
- Cheneval, D., Kastelic, T., Fuerst, P., Parker, C. N. A review of methods to monitor the modulation of mRNA stability: a novel approach to drug discovery and therapeutic intervention. J. Biomol. Screen. 15 (6), 609-622 (2010).
- Pascale, A., Govoni, S. The complex world of post-transcriptional mechanisms: is their deregulation a common link for diseases? Focus on ELAV-like RNA-binding proteins. Cell. Mol. Life Sci. 69 (4), 501-517 (2012).
- Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. Impaired pre-mRNA processing and altered architecture of 3’ untranslated regions contribute to the development of human disorders. Int. J. Mol. Sci. 14 (8), 15681-15694 (2013).
- Bhattacharyya, A., Trotta, C. R., Peltz, S. W. Mining the GEMS–a novel platform technology targeting post-transcriptional control mechanisms. Drug Discov. Today. 12 (13-14), 553-560 (2007).
- Peltz, S. W., Welch, E. M., Trotta, C. R., Davis, T., Jacobson, A. Targeting post-transcriptional control for drug discovery. RNA Biol. 6 (3), 329-334 (2009).
