Abstract
Transkripsiyonel ve transkripsiyon sonrası düzenleme Her iki genlerin ifadesi üzerinde derin bir etkiye sahip. Ancak, yaygın olarak kabul edilen hücre tabanlı tarama deneyleri esas promotör hedefleme moleküllerinin belirlenmesi amaçlı olan, transkripsiyonel regülasyonu odaklanmak. Sonuç olarak, transkripsiyon sonrası mekanizmalar büyük ölçüde gen ifadesi hedeflenen ilaç gelişimi ile ortaya edilmektedir. Burada ve değiştirmek mümkün bileşiklerin belirlenmesi onun mRNA kaderi modülasyonunda 3 'çevrilmemiş bölge (3' UTR) rolünü araştırmak amacıyla bir hücre bazlı deney tarif eder. Deney kararlı bir şekilde hastalığa, ilgili hücre hattına entegre ilgi konusu bir genin 3 'UTR içeren bir lusiferaz raportör yapının kullanımına dayanmaktadır. Protokol tedavi 24 saat sonra lusiferaz aktivitesi etkileyen moleküllerin tanımlanması amaçlı birincil tarama başlangıç odaklanarak, iki parçaya ayrılmıştır. protokolün ikinci bölümüaçıklar karşı tarama özellikle 3 'UTR ile lusiferaz aktivitesini modüle bileşikleri ayırmak için gerekli. Ayrıntılı protokol ve temsil sonuçlarına ek olarak, biz tahlil geliştirme ve endojen hedefe isabet (ler) doğrulama konusunda önemli hususlar sağlamaktadır. tarif edilen hücre bazlı bir raportör gen deneyi bilim adamları 3 'UTR bağımlı transkripsiyon sonrası mekanizmalar yoluyla protein seviyelerini modüle molekülleri tanımlamak için izin verecektir.
Introduction
Gen ifadesinin uzun bir süre transkripsiyonel düzenleme için protein üretimini kontrol açık olmayan rolü ise önemli bir oynadığı düşünülmektedir edildi. Giderek artan kanıtlar, bununla birlikte, transkripsiyon sonrası düzenleme hücresel protein bolluğu 1,2 belirlemek için olduğu kadar, eğer değilse, transkripsiyonel düzenleme daha fazla katkı göstermektedir. Gen ifadesinin transkripsiyon sonrası kontrol ilk düşünce oldu çok daha karmaşık ve ayrıntılı. Aslında, post-transkripsiyonel kontrol tüm çeşitli aşamalarında mRNA işleme, lokalizasyonu, ciro, çeviri 3 gibi yeni açıklanan geri dönüşümlü RNA metilasyon 4 olmak üzere, düzenlendiği ortaya çıktı. Transkripsiyon sonrası düzenleme olan bir dizi işlem potansiyel olarak etkilenen kaynaktan deney aşağıda tarif edilen mRNA'nın 3 'çevrilmemiş bölge (3' UTR) yer aldığı, bu odaklanmaktadır. 3 'UTR geniş RNA bağlayıcı pr belirli etkileşim yoluyla esas mRNA kaderi etkilerdüzenleyici dizileri ve / veya ikincil yapılar 5 oteins ve kodlayıcı olmayan RNA'lar. Bu nedenle, bu etkileşimleri değiştirebilir veya yukarı sinyal iletim yollarında engel küçük moleküller, protein bolluğu düzenleyen dengeyi kayacak. Bu tedavi yaklaşımı olan bir kanıt, hastalık-ilgili genler, bu şekilde farmakolojik müdahale için potansiyel bir hedef temsil etmektedir post transkripsiyonel düzenlenmesinde tabi olduğunu gösteren Varlığından insan patolojilerinin için özel bir önem taşımaktadır. Bu nedenle, yüksek verimli bir formatta transkripsiyon sonrası kontrol mekanizmaları ile girişim ile mRNA düzeyleri 'modülatörlerinin taranması için izin sistemleri, potansiyel yeni tedavi tanımlanmasında değerli araçlar olabilir.
tarif edilen hücre bazlı bir raportör gen deneyi ile 3 'UTR bağlı mekanizmalar yoluyla mRNA'nın kaderi modüle edebilirler bileşiklerin tanımlanmasına izin verir. Birçok ana c oluşmaktadıromponents (Şekil 1) ve birkaç ön adım gerektirir tahlil fizibilite doğrulamak için. Her şeyden önce, raportör yapı, söz konusu geninden 3 'UTR içerecek şekilde tasarlanmıştır. 3 'UTR, örneğin ateşböceği lusiferaz (Şekil 1) gibi bir raportör genin ucuna kaynaştırılır. Takılı 3 'UTR ile uygulanan transkripsiyon sonrası kontrol mekanizmalarının herhangi bir değişiklik, çeşitli lusiferaz seviyelerinde elde edilen bu kimerik transkripti stabilitesini ve / veya translasyon etkinliğini değiştirir. Bu nedenle, lüsiferaz faaliyetindeki değişimler de ilgi konusu genin, etkilenen transkripsiyon sonrası düzenleme dolaylı ölçü vermektedir. sisteminin ikinci bileşeni, bir kontrol raportör yapı, aynı haberci genini tanımlayan fakat herhangi bir 3 'UTR içermeyen benzer bir sentezleme plazmiddir. İki raportör plasmidleri, geleneksel moleküler biyoloji protokollerini kullanarak laboratuarda tasarlanmış ya da ticari kaynaklardan satın alınabilir.
bir hücre sırasına seçimi deney yapımı için kritik önem taşır. Hangi hücre hattı optimum model kullanılabilirlik, transfectability ve büyüme özellikleri gibi sadece pratik konulara patolojiye maksimum benzerlik gibi klinik gereksinimlerine kadar pek çok faktöre bağlıdır. Önemlisi, önce bir raportör gen 3 'UTR füzyon kimerik transkript düzeyinde beklenen etkiye sahip olduğundan emin olmalısınız devam etmek. 3 lusiferaz sinyali anlamlı fark olmaması alternatif olanlar arama için isteyen, UTR bu hücresel modelde işlevsel değil 'UTR taşıyan ve kontrol muhabiri geçici 3 belirtmek istiyorum seçilen hücrelerde transfekte yapılarını'. Yüksek işleme kapasiteli bir düzende, 3 'UTR taşıyan ve kontrol lusiferaz raportör yapılan ile kararlı bir şekilde seçilen bir hücre dizisindeki entegre edilmelidir. Kullanarak stabil bir şekilde geçici olarak üzerinde entegre transfekteHücre hattı, çeşitli nedenlerden dolayı tercih edilir. Bu maliyetleri azalır, transfeksiyon verimliliği hareketlerinden kaynaklanan veri değişkenliği azaltmak, zor transfect hücre hatları da dahil olmak üzere bir hücresel modelin seçimi genişletmek olacaktır. Ayrıca, geçici transfeksiyon hücreleri üzerine çok sık sistemin doygunluk giden bir DNA plazmid ile aşırı yük. Bu şartlarda raportör ekspresyonu daha fazla bir artışın potansiyel regülasyonunda bileşiklere karşı duyarlılık azalmasına neden zor olabilir.
Tüm tahlil bileşenleri kurmak zaman lusiferaz aktivite gerçekten yukarı ve aşağı-regüle '3 takılı yoluyla özellikle olabilir Son olarak, bu deneyde, yani fizibilitesini belirlemek için yüksek verimli formatına geçmeden önce kritik UTR. iyi kontrol ilgi 3 'UTR ile mRNA stabilitesini veya çevrilebilirlik modüle etmek için rapor küçük moleküller olacaktır. Bu sahip isemümkün değil, istenen etkiyi taklit vekil kontroller kabul edilir. Bu miRNA'ların veya ilgi 3 'UTR bağlanma yoluyla etkilere neden olduğu bilinmektedir, RNA bağlanan proteinleri olabilir. Bu tür kontrollerin değerlendirilmesi primer tarama geliştirilen testin işlevselliğini gösterir, aynı zamanda yüksek verimli biçimde dinamik aralık, hassasiyet ve performans tahmini için izin verir sadece daha önce.
Açıklanan protokol kullanarak biz 2.000 bileşik kütüphane 6 gösterildi. Nöroblastom, bebeklik en sık ekstrakraniyal solid tümör, bir biyolojik model olarak kullanıldı ve amplifikasyon MYCN onkogen, 3 'UTR güçlü bir hedef genin 7 olarak nöroblastom olumsuz sonuç, tahmin. 2 deneysel düzen özetliyor Şekil. Tarama bir seferde elenmiş 27 plaka toplu boyutu ile üç aşamada bölündü. 27 plakaları toplu Spektrum Koleksiyonu kütüphane dahilPlakalar n.1-n.8 + n.25 (ilk çalıştırma), n.9-n.16 + n.25 (ikinci dönem) ve n.16-n.24 + n.25 (üçüncü dönem), her plaka üç nüsha olarak tarandı. Böylece, bir kütüphane plakası (n.25) mümkün arası çalışma karşılaştırma yapma üç çalışır içerisinde test edildi. protokol aşağıda üç kopya halinde test edilen 9 kütüphane tabakalarından tek bir çalışma açıklar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Bu tür deney sistemlerinin verimi mevcut HTS laboratuar ekipmanları bağlıdır. Bu protokol, 96-kuyu formatında sıvı taşıma yapan bir Tecan Freedom EVO 200 robot ile kolaylaştırılır. 384-gözlü formata minyatürleştirme da mümkündür. Robotik sıvı taşıma sistemi tüm deneysel adımlar sırasında aseptik koşullarda korumak için bir laminer akış kaputun altında konumlandırılmış. Herhangi bir sıvı işleme otomasyon mevcut ise, protokol hali hazırda düşük verimli bir formata adapte edilebilir.
Birincil Eleme
1. Gün 1: hazırlayın ve Tohum Hücreler
Not: Tohum hücreleri, lusiferaz aktivitesi, tohumlama sonra, yani 48 saat tahlil zamanında% 80 izdiham elde edilir.
- Süspanse% 10 FBS ve% 1 L-glutamin ihtiva eden RPMI içinde 2 x 10 5 hücre / ml 'lik bir konsantrasyona kadar CHP134-mycn3UTR nöroblastoma hücreleri tripsinize. 27 plakaları için en az 250 ml hazırlamak Hesap sıvı taşıma dikkate alarak hücre süspansiyonu, ölü hacimleri ve tekrarlanan pipetleme adımlarını oluklara. Steril rezervuar içine hücre süspansiyonu dökün ve robot masanın üzerine yerleştirin.
- 9 barkodlu beyaz düz tabanlı 96-kuyu plakaları ve robot masasının üzerine 200 ul steril pipet uçları bir kutu yerleştirin. Yerçekimi altında yerleşen hücreleri önlemek için her muafiyet adımından önce pipetleme hücre süspansiyonu karıştırın. Oyuk başına 1.5 x 10 4 hücrelerinin nihai yoğunluk elde etmek için 9 levhaların her bir kuyunun içine hücreleri 75 ul koyun.
- Kapaklı plakaları örtün ve hücreler, alt tortu olanak sağlamak için 30 dakika boyunca kuluçka dışında bırakın. Bu kenar etkilerini en aza indirmek olacaktır.
- Tekrar 27 plakaları toplam sayısını hazırlamak için iki kez 1.2 ve 1.3 adımları.
- 37 ° C'de plakalar yerleştirin ve% 5 CO2 ve 24 saat daha inkübe edilir.
2. Gün 2: Kütüphane Bileşikler ile Hücreler davranın
ntent "> Not: Spektrum Koleksiyonu küçük molekül kütüphane DMSO içinde 10 mM konsantrasyonda 25 96 oyuklu plakalar içinde 8 sıra ve 10 sütundaki düzenlenmiş 2000 bileşiklerden oluşur, ilk ve son sütun üzerine kuyu kontroller için boş bırakılır. . Bileşim tarama tahlilleri tipik olarak 1-10 uM bileşik konsantrasyonu 8 gerçekleştirilir. Burada açıklanan tarama protokolü çalışma konsantrasyonu 2 uM ve analiz edilmesi son nokta olarak 24 saat giderir.- Oda sıcaklığında 9 bileşik kütüphane plakaları çözülme.
- Steril PBS ve PBS-% 0.5 DMSO çözümleri ile iki olukları hazırlayın ve robot masanın üzerine koyun. Her bir kütüphane levha için hazırlanması ve buna uygun olarak tek bir seyreltme plakası etiket - en az 400 ul bir çalışma hacmine sahip bir polipropilen U-tabanlı 96-çukurlu plaka. Sıvı eylemci sabit ipuçlarını kullanarak steril PBS 398 ul seyreltme plakaları 11 sütun 2 Her çukurun doldurun. Dolgu sütun 1 ve steril PBS 12 50 ile ulKontrol kuyuları araç konsantrasyonu (% 0.02) yeniden üretilmesi için,% 0.5 DMSO ile.
- İki kütüphane tabak, buna etiketli seyreltme plakaları, 50 ul steril pipet uçları iki kutu ve robot masasına altı hücreleri tabak yerleştirin. Hücreler plakaları ortaya çıkarın.
- Pipet 2, ilgili seyreltme plakası iki kütüphane tabakalarından biri 10 mM stok çözeltisi ul ve iyice karıştırın. Bu 50 uM'lik bir ara bileşikler konsantrasyonu ile sonuçlanır. Uçları aynı kümesini kullanarak hücreleri ile 3 Barkodlanan beyaz 96 gözlü plakalar içinde 50 uM seyreltme 3 ul dağıtmak. Her bir konsantrasyonunu çalışan 2 uM Bu seyreltme şeması sonuçlar bileşik olarak test edilmiştir.
NOT: ipuçları ile gereksiz manipülasyonlar önlemek kütüphane plakaları sadece 80 bileşikleri içeren olsa bile, baştan 96 ipuçları tam bir set kullanın. İlk ve kütüphane plakalarının son sütunları boş olduğundan bu mümkün. - Pipet ipuçları değiştirin ve St tekrarİkinci kütüphane plaka için ep 2.4.
- Hücreler plakaları örtün ve 24 saat için inkübatör onları geri.
- Kalan kütüphane plakaları için 2,3-2,6 iki kez daha Adımları.
3. Gün 3: Lüsiferaz Testi gerçekleştirin
Not: lusiferaz deneyi gerçekleştirmeden önce, her bir kuyuya 9 bir hücre canlılığı endeksi elde etmek için resazurin azalmaya dayalı olarak, bir hücre canlılığı deneyi ile multipleks mümkündür. Çoğullama lusiferaz ve canlılık testi hücreleri, lusiferaz aktivitesi yeterince yüksek düzeyde sağlamak, ancak, göz ardı edilebilir, lusiferaz sinyalinin bir azalma deneyleri sonuçları. Lusiferaz aktivitesi sabit lüminesan sinyal ticari ve ev yapımı 10,11 lusiferaz deney reaktif çeşitli saptanabilir.
- Oda sıcaklığına kadar seçim yeniden lusiferaz reaktif dengelenmesi. Hacmi, tüm tahlil plakalar için yeterli olduğundan emin olun. 27 plaka içinlusiferaz reaktifi s 170 ml hesap sıvı taşıma dikkate alınarak gerekli olacaktır, ölü hacim ve tekrarlanan pipetleme adımlarını oluklara. Bir rezervuar içine lusiferaz reaktif dökün ve robot masanın üzerine yerleştirin.
- , Inkübatör hücreleri ile 9 plakaları çıkarın robot masanın üzerine koyun, ortaya çıkarmak ve oda sıcaklığına dengelendi kadar bekleyin. Plakası ile plaka başına lusiferaz reaktifi 50 ul ekle. Plakalar arasında bir plaka lüminesans okuma süresine eşit bir gecikme. Bu, tüm plakaları reaktif ek eşit zaman aralığında ölçülür güvence altına alacaktır.
- 30 dakikalık bir kuluçkadan sonra, luminometrede birinci plaka yerleştirmek ve kısa bir çalkalama adımından sonra lüminesans ölçümü. Tüm plakaları için tekrarlayın. Her plaka barkod kaydedin ve ele plakaların çok sayıda kaynaklanan hataları önlemek için ilgili veri dosyasına ilişkilendirmek.
- Tekrar hücreleri ile kalan 18 plakaları için iki kez 3,2-3,3 adımları. Kalan lusiferaz reaktif toplayın ve -20 ° C'de saklayın.
4. Gün 4: Veri Analizi
- On plaka, araçla tedavi edilen kontrollere ortalamasına tüm örneklerin normalleştirme kullanarak işlem deneysel veriler. Her kütüphane bileşik için, üçlü üzerinden ortalama değer x ve SD hesaplamak.
- Seçin regülatör-yukarı ve aşağı düzenleyen ortalama değer x ve SD tüm tahlil işlenmiş değerler üzerinden hesaplanır SD, ve k × ± k X bir eşiği ayarlayarak hit tanımlı sabittir.
- Rasgele bir eşik cut-off <lusiferaz sinyalinin bir azalma muhtemelen bileşik toksisite ile ilişkili olan, araç ile tedavi edilen kontrol grubu% 20 seçin. Bu eşiğin altında hit atarak önemli ölçüde karşı tarama yalancı-pozitif hit bir dizi azaltacaktır.
NOT: yerine denetimi tabanlı normalleştirme, deneysel veriler Z skoru ya da sağlam analog B s uygulanarak işlenebilirÇekirdek 12. Buna ek olarak, isabet seçimi için alternatif istatistiksel yaklaşımlar 12 mevcuttur.
5. Karşı-tarama
Not: Primer taramada tespit edilen bileşikler doğruladı ve bir karşı tarama ile özgüllüğü için değerlendirilmektedir ('hit "etiketli).
- Kiraz ilgili düzenini tasarrufu, tek 2D barkodlu tüplerde saklanan alikotları seçilen hit almak ve yeni "plakaları vurmak" yaratmak. Kontroller için ücretsiz pozisyonları bırakmak unutmayın.
Not: etkin kiraz toplama sisteminin yokluğunda, tek bir kontrol ve Primer taramada paralel olarak 3 'UTR taşıyan hücreleri hem de test edebilir. Bu durumda, sadece kişiye 3 'UTR bağlı etkileri olan bileşikler söz konusu seçimi, karşı tarama ihtiyacını ortadan kaldırarak Primer taramada sonra mümkün olacaktır. Ancak, iki hücre hatlarında paralel tarama deneyi katına çıkacakmaliyetler. - Primer tarama protokolüne (Bölüm "1. Gün: hazırlayın ve Tohum hücreler") sonra, her bir "hit levha" her CHP134-mycn3UTR ve CHP134-CTRL kararlı üç hücre 96 oyuklu plakalar hazırlamak.
- Birincil tarama için protokol (Bölüm "Gün 2: Kütüphane Bileşikler ile Hücreler davranın") ardından, konsantrasyon çalışan 2 uM üç CHP134-mycn3UTR ve üç CHP134-CTRL plakaları tedavi etmek için her hit plakasını kullanın.
Not: Burada tarif edilen karşı ekran 2 uM tek bir dozda, üç kez yapılır iken, standart çoğaltır yerine 2 uM 20 nM arasında değişen 10 kat seyreltik olarak 3 konsantrasyonlarda hit test etmek için faydalı olabilir. Bu yaklaşımı uygulamak sadece yanlış-pozitif oranları en aza indirerek, birincil hit üzerinde ön doz-yanıt verileri elde etmek de birincil ekran verileri teyit, ama izin vermedi. Bu durumda, başka bir analiz hattı başvurunun olmalıdıred deneysel verileri işlemek ve hit onaylamak için. - Birincil tarama için protokol (Bölüm "Gün 3: Lüsiferaz Testi gerçekleştirin") ardından, tüm CHP134-mycn3UTR ve CHP134-CTRL plakaları lusiferaz aktivitesini ölçmek.
- Primer tarama protokolüne (Bölüm "4. Gün: Veri Analizi") sonra, on plaka, araçla tedavi edilen kontrollere ortalamasına işlenmiş olan gözeneklerden elde deneysel verileri normalleştirmek ve tekrarın ortalama ve SD hesaplar. Test edilen her bir bileşik için, CHP134-CTRL hücreleri vs CHP134-mycn3UTR lusiferaz etkinliğinin kat değişimi hesaplamak. Keyfi kat değişikliği cut-off> <0.01 1.5 ve önemi p-değerleri seçin.
NOT: hit özgüllüğü için belirleyici parametre CHP134-CTRL hücreleri vs CHP134-mycn3UTR içinde lusiferazm önemli bir kat değişiklik açıklanan tahlil ayarlarında. Gerekirse, bir de se olarak eş zamanlı olarak, bir hücre canlılığı deneyi gerçekleştirilerek bileşik toksisitesini değerlendirmek olabilirseçilir ve bileşikler. Birincil hit bir doz yanıt analizinde karşı taranır Bu özellikle faydalı olabilir. Tek bir doz için, deneyim 6 hücre canlılığı azalmış indirgenmiş lusiferaz aktivitesinin güçlü bir korrelasyonu göstermektedir. Bu nedenle, hedef hücreleri ve kontrol hücreleri, lusiferaz aktivitesi azalmış Test edilen konsantrasyonda bileşiğin toksisitesinin bir göstergesi olarak kabul edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tarif edilen yaklaşımı kullanarak, MYCN geninin 3 'UTR ile uygulanan transkripsiyon sonrası kontrol mekanizmalarının potansiyel modülatörleri için bir 2000-bileşiği kütüphanesini taramıştır. 3, tek bir kütüphane plaka ile örneklenen primer tarama sonuçlarını tasvir etmektedir. Araç ile muamele edilen kontrol yüzdesi olarak gösterildi: Lusiferaz sinyali tek bir kütüphane plaka bileşikleri ile tedavi CHP134-mycn3UTR hücre plakaları üçer defa lusiferaz etkinliğinin ölçülmesiyle elde edilmiştir. Beklendiği gibi,% 100 başlangıç yakın değerleri ile gösterildiği gibi, bileşiklerin çoğunluğu lusiferaz aktivitesi üzerinde bir etkisi olmamıştır. isabet (net kareler) ortalama değer x ve SD tüm tahlil değerleri üzerinden hesaplanır x ± 2 SD, bir eşiği ayarı seçilmiştir. Tespit engellenmesi en büyük ihtimalle pronou sonucu olarak% 20 (bir yıldız işareti ile işaretlenmiştir bir) altında lusiferaz aktivitesini azaltan bileşikler göz çıkarılmalıdırbileşik Advanced hücresel toksisite.
Şekil 4, yaklaşık 100 bileşiklerin karşı taramada elde edilen verilerin birkaç temsilci örnekleri göstermektedir. Bileşim, burada X bir sitotoksik aktivite gösterir ise CHP134-CTRL hücrelerinde normalize lusiferaz sinyalinden değerlendirilebileceği gibi, 2 uM konsantrasyonda bileşik, B hücre ömrü üzerinde hiç bir etkisi yoktur. W ve X Her iki bileşik, tam MYCN 3 neden 'yukarı-regülasyonu kat değişiklik farkı ve t-testi ile belirtildiği üzere, lusiferaz aktivitesi, UTR özgü. 2 mM konsantrasyonda Bileşik Y CHP134 hücrelerinin canlılığını tehlikeye görünüyor; özelliği açısından CHP134-mycn3UTR ve CHP134-CTRL hücrelerde lusiferaz aktivitesi açısından bir fark yoktur. Eşdeğer yukarı regülasyonu CHP134-CTRL hücrelerde gözlemlenen çünkü Son olarak, bileşik Z Primer taramada tespit edilen lusiferaz aktivitesi artışı MYCN 3 'UTR ile gerçekten bağımlı değildir. Biz M sonuçlanan herhangi bir isabet tespit etmediYCN 3 'UTR özgü aşağı-regülasyonu lusiferazm.
Şekil 1:. Hücre bazlı bir raportör gen deneyi bileşenleri üst panel MYCN geninin şematik bir diyagramını gösterir. MYCN transkript (NM_005378.4) ölçekle çizilmiştir. Kutular gölgeli bölgeler CDS karşılık gelen eksonları temsil çizgiler intronlan temsil eder. muhabir Luc-CTRL ve Luc-3UTR-MYCN aşağıda şematik temsil edilmektedir oluşturur. CMV, sitomegalovirüs; SV40, maymun virüsü 40. CHP134 nöroblastom hücre hattı Anılan plazmidler kullanılarak stabil transfekte hücreleri üretmek için seçildi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2:. Primer taramada ana hatları her biri, tek bir bileşik kütüphanesi plak CHP134-mycn3UTR hücrelerinin triplikat plakalar tedavi etmek için kullanılmıştır. Lusiferaz aktivitesi Tedavi, 24 saat sonra ölçüldü.
Şekil 3:. Primer taramada bir tek 96-yuvalı plaka temsil normalize değerlerin Levha iyi dağılım grafiği 96 oyuklu plakalar içinde büyüyen CHP134-mycn3UTR hücreleri, 2 uM konsantrasyonda kütüphane bileşikler ile tedavi edildi. Her bir nokta, aynı kalıp içinde, araçla tedavi edilen kontrol tespit ortalama lusiferaz sinyale 24 tedavi saat ve normalize sonra tek bir bileşik için tespit lusiferaz aktivitesi karşılık gelir. Veri noktaları, 96 oyuklu bir plaka içerisinde bileşikler pozisyonda (ham A sütun 2-10'da 10 bileşikleri, aşağıdaki gösterildiG). SD gösterilir ± üzerinden üç çoğaltır ortalama. hit net kareler olarak görüntülenir. % 20'nin altında azaltılmış lusiferaz aktivitesi ile karakterize bir isabet yıldız işaretiyle işaretlenir.
Şekil 4:., Karşı tarama CHP134-mycn3UTR ve CHP134-CTRL kararlı hücre temsili örnekleri bileşikleri, birincil taramada önceden seçilmiş paralel olarak tedavi edildi. lusiferaz deneyi, 2 uM konsantrasyonda muamele, 24 saat sonra yapıldı. Grafik Her çubuk belirtilen sabit hücrelerde, araçla tedavi edilen kontrol ortalama lusiferaz sinyal, tek bir bileşik ve normalize için tespit edilen lusiferaz aktivitesi karşılık W, X, Y, ve Z belirlenmiş dört seçilmiş bileşikler için temsili sonuçlar gösterilmektedir. Gösterildi iki-kuyruklu t-testi değişim farkı ve istatistiksel anlamlılık Katlama, ** p <0.01,*** P <0.001.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Culture plate 96-well White | PerkinElmer | 6005688 | |
| StorPlate 96-well U bottom (dilution plate) | PerkinElmer | 6008190 | |
| 100 ml disposable trough for reagents | Tecan | 10 613 048 | |
| 300 ml disposable robotic reservoir | VWR | PB12001301 | |
| Robot tips DITI 50 μl Sterile | Tecan | 30038607 | |
| Robot tips DITI 200 μl Sterile | Tecan | 30038617 | |
| Matrix 1.4 ml 2D Barcoded w, Flat Bottom Tubes | Thermo Scientific | 3711 | |
| ONE-Glo Luciferase Assay System | Promega | E6120 | |
| RPMI | Lonza | BE12-918F | |
| PBS-1x, w/o Ca2+, Mg2+ | Lonza | BE17-516F | |
| L-Glutamine 200 mM | Lonza | BE17-605E | |
| FBS | Lonza | DE14-801F | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| The Spectrum collection (compound library) | MicroSource Discovery Systems | N/A | |
| Tecan Freedom EVO200 robot | Tecan | N/A | |
| Tecan F200 multiplate reader | Tecan | N/A |
References
- Schwanhäusser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
- Tebaldi, T., et al. Widespread uncoupling between transcriptome and translatome variations after a stimulus in mammalian cells. BMC Genomics. 13 (1), 220 (2012).
- Mitchell, S. F., Parker, R. Principles and properties of eukaryotic mRNPs. Mol. Cell. 54 (4), 547-558 (2014).
- Fu, Y., Dominissini, D., Rechavi, G., He, C. Gene expression regulation mediated through reversible m6A RNA methylation. Nat. Rev. Genet. 15 (5), 293-306 (2014).
- Matoulkova, E., Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. The role of the 3’ untranslated region in post-transcriptional regulation of protein expression in mammalian cells. RNA Biol. 9 (5), 563-576 (2012).
- Sidarovich, V., Adami, V., Quattrone, A. A Cell-Based High-Throughput Screen Addressing 3’ UTR-Dependent Regulation of the MYCN Gene. Mol. Biotechnol. 56 (7), 631-643 (2014).
- Cheung, N. -K. V., Dyer, M. A. Neuroblastoma: developmental biology, cancer genomics and immunotherapy. Nat. Rev. Cancer. 13 (6), 397-411 (2013).
- Hughes, J. P., Rees, S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L. Principles of early drug discovery. Br. J. Pharmacol. 162 (6), 1239-1249 (2011).
- Herbst, J., et al. Multiplexing a high-throughput liability assay to leverage efficiencies. Assay Drug Dev. Techn. 7 (3), 294-303 (2009).
- van Olst, E. S. iebring-, et al. Affordable luciferase reporter assay for cell-based high-throughput screening. J. Biomol. Screen. 18 (4), 453-461 (2013).
- Baker, J. M., Boyce, F. M. High-throughput functional screening using a homemade dual-glow luciferase assay. J. Vis. Exp. (88), (2014).
- Malo, N., Hanley, J. A., Cerquozzi, S., Pelletier, J., Nadon, R. Statistical practice in high-throughput screening data analysis. Nat. Biotechnol. 24 (2), 167-175 (2006).
- Hitti, E., et al. A versatile ribosomal protein promoter-based reporter system for selective assessment of RNA stability and post-transcriptional control. RNA. 16 (6), 1245-1255 (2010).
- Oikonomou, P., Goodarzi, H., Tavazoie, S. Systematic identification of regulatory elements in conserved 3’ UTRs of human transcripts. Cell Rep. 7 (1), 281-292 (2014).
- Gandin, V., et al. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. J. Vis. Exp. (87), (2014).
- Conne, B., Stutz, A., Vassalli, J. D. The 3’ untranslated region of messenger RNA: A molecular “hotspot” for pathology. Nat. Med. 6 (6), 637-641 (2000).
- Cheneval, D., Kastelic, T., Fuerst, P., Parker, C. N. A review of methods to monitor the modulation of mRNA stability: a novel approach to drug discovery and therapeutic intervention. J. Biomol. Screen. 15 (6), 609-622 (2010).
- Pascale, A., Govoni, S. The complex world of post-transcriptional mechanisms: is their deregulation a common link for diseases? Focus on ELAV-like RNA-binding proteins. Cell. Mol. Life Sci. 69 (4), 501-517 (2012).
- Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. Impaired pre-mRNA processing and altered architecture of 3’ untranslated regions contribute to the development of human disorders. Int. J. Mol. Sci. 14 (8), 15681-15694 (2013).
- Bhattacharyya, A., Trotta, C. R., Peltz, S. W. Mining the GEMS--a novel platform technology targeting post-transcriptional control mechanisms. Drug Discov. Today. 12 (13-14), 553-560 (2007).
- Peltz, S. W., Welch, E. M., Trotta, C. R., Davis, T., Jacobson, A. Targeting post-transcriptional control for drug discovery. RNA Biol. 6 (3), 329-334 (2009).
