الإنتاجية العالية للكشف عن المغيرون الكيميائية من الجينات المشاركة ما بعد transcriptionally الخاضعة للرقابة
Summary
Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3’ UTR.
Abstract
كلا النسخي والتنظيم بعد النسخي يكون لها تأثير عميق على الجينات التعبير. ومع ذلك، تركز اعتمدت عادة خلية مقرها المقايسات الفرز على تنظيم النسخي، ويجري تهدف أساسا في تحديد جزيئات استهداف المروج. ونتيجة لذلك، يتم كشف آليات ما بعد النسخي إلى حد كبير من التعبير الجيني تطوير الأدوية المستهدفة. نحن هنا وصف فحص خلية القاعدة التي تهدف إلى التحقيق في دور 'المنطقة غير مترجمة (3' 3 UTR) في التشكيل مصير مرنا لها، وإلى تحديد مركبات قادرة على تعديله. ويستند هذا الفحص على استخدام بناء luciferase المراسل تحتوي على "UTR 3 من الجينات في المصالح المتكاملة ثابت في خط الخلية الأمراض ذات الصلة. وينقسم البروتوكول إلى قسمين، مع التركيز في البداية على غربلة أولية تهدف إلى التعرف على الجزيئات التي تؤثر luciferase النشاط بعد 24 ساعة من العلاج. الجزء الثاني من البروتوكوليصف ضرورية لتمييز المركبات تحوير luciferase النشاط على وجه التحديد من خلال UTR 3 'الفرز مضادة. بالإضافة إلى بروتوكول مفصلة ونتائج ممثلة، ونحن نقدم اعتبارات هامة عن تطور الفحص والتحقق من ضرب (ق) على الهدف الذاتية. فإن وصفه خلية مقرها مراسل فحص الجينات تسمح للعلماء لتحديد جزيئات تحوير مستويات البروتين عن طريق آليات ما بعد النسخي تعتمد على "UTR 3.
Introduction
لتنظيم النسخي فترة طويلة من التعبير الجيني كان يعتقد أن تلعب الكبرى إن لم يكن دور الحصري في السيطرة على إنتاج البروتين. تراكم الأدلة، ومع ذلك، يشير إلى أن التنظيم بعد النسخي يساهم بقدر ما، إن لم يكن أكثر من والتنظيم النسخي لتحديد البروتين الخلوي وفرة 1،2. السيطرة بعد النسخي في التعبير الجيني هو أكثر تعقيدا وتفصيلا مما كان يعتقد في البداية. في الواقع، ظهرت جميع مراحل مختلفة من السيطرة ما بعد النسخي إلى أن ينظم، بما في ذلك تجهيز مرنا، التعريب، والدوران، والترجمة 3 فضلا عن وصفه حديثا عكسها RNA مثيلة 4. من عدد من عمليات التنظيم بعد النسخي يحتمل أن تتأثر، ووصف الفحص أدناه يركز على تلك التي تنطوي على "المنطقة غير مترجمة (3 'مرنا 3 UTR). 3 'UTR يؤثر على نطاق واسع مرنا مصير أساسا عن طريق التفاعل محدد من ملزم RNA العلاقات العامةoteins والرنا غير المشفر إلى متواليات التنظيمية و / أو هياكل الثانوية 5. ولذلك، فإن الجزيئات الصغيرة التي تغير هذه التفاعلات أو تتداخل مع المنبع مسارات نقل الإشارة تحول التوازن الذي ينظم وفرة البروتين. هذا النهج العلاجي له أهمية خاصة بالنسبة لأمراض الإنسان التي أدلة موجود يظهر أن الجينات الأمراض ذات الصلة يتعرضون لتنظيم مرحلة ما بعد النسخي، والتي بالتالي تمثل هدفا محتملا للتدخل الدوائي. ولذلك، يمكن لنظم يسمح لفحص جهري مستويات مرنا من خلال التدخل في آليات الرقابة في مرحلة ما بعد النسخي في شكل الإنتاجية العالية تصبح أدوات قيمة في تحديد العلاجات رواية المحتملة.
ووصف القائم على خلية مقايسة مراسل الجينات يسمح للتعرف على مركبات قادرة على تعديل مرنا مصير عبر آليات تعتمد على لها 'UTR 3. وهو يتألف من عدة ج الرئيسيةomponents (الشكل 1) ويتطلب بضع خطوات تمهيدية للتحقق من صحة جدوى الفحص. أولا وقبل كل شيء، تم تصميم بناء مراسل لتشمل UTR 3 'من الجينات في المصالح. وتنصهر في "UTR 3 إلى نهاية جين مراسل مثل يراعة luciferase (الشكل 1). سوف أية تغييرات في آليات الرقابة في مرحلة ما بعد النسخي المبذولة من خلال إدراج 3 'UTR يغير من الاستقرار و / أو الكفاءة ترجمة هذا النص خيالية، مما أدى إلى مستويات luciferase المراسل متنوعة. لذلك، والتغيرات في luciferase النشاط تخدم مقياس غير مباشر كما في المتضررين التنظيم بعد النسخي من الجينات في المصالح. المكون الثاني من النظام هو بناء مراسل السيطرة، وهو التعبير البلازميد متطابقة أن يعبر عن نفسه مراسل الجينات ولكن لا تحتوي على أي 3 'UTR. البلازميدات مراسل اثنين يمكن أن تصمم في المختبر باستخدام بروتوكولات البيولوجيا الجزيئية التقليدية أو شراؤها من مصادر تجارية.
اختيار خط الخلية المناسبة أمر بالغ الأهمية لبناء الفحص. الذي خط الخلية هو النموذج الأمثل يعتمد على عوامل عديدة تتراوح بين المتطلبات السريرية مثل تشابه القصوى لعلم الأمراض على القضايا العملية فقط مثل خصائص توافر، وtransfectability، والنمو. الأهم من ذلك، قبل المضي قدما ينبغي لأحد أن تأكد من أن انصهار 3 'UTR إلى الجين مراسل له تأثير متوقع على مستوى النص خيالية. غياب اختلاف كبير في إشارة luciferase المراسل من 3 'UTR الحاملة والسيطرة مراسل يبني عابر في الخلايا المحددة تشير إلى أن 3' UTR ليس وظيفي في هذا النموذج الخلوي، مما دفع للبحث عن بديل منها. لتنسيق الإنتاجية العالية، 3 'UTR الحاملة والسيطرة luciferase المراسل يبني مراسل ينبغي إدماج ثابت في خط الخلية المحددة. باستخدام متكاملة مستقر على مدى عابر transfectedخط الخلية هو الأفضل لعدة أسباب. هذا وسوف توسيع اختيار نموذج الخلوية بما في ذلك خطوط الخلايا التي يصعب بالنقل، والحد من التباين في البيانات الناشئة عن التقلبات في كفاءة ترنسفكأيشن، تهدأ التكاليف. وعلاوة على ذلك، على خلايا ترنسفكأيشن عابرة وفي أحيان كثيرة جدا مثقلة البلازميد الحمض النووي مما يؤدي إلى تشبع النظام. في هذه الإعدادات قد تكون زيادة أخرى في التعبير مراسل تحديا، مما أدى إلى انخفاض حساسية تجاه مركبات upregulating المحتملة.
وأخيرا، عندما يتم تعيين كافة مكونات فحص ما يصل، فمن الأهمية بمكان قبل أن ينتقل إلى تنسيق الإنتاجية العالية لتحديد جدوى الفحص، أي إذا luciferase النشاط يمكن أن يكون في الواقع الأعلى وإلى الأسفل تنظم على وجه التحديد عن طريق إدخال 3 " UTR. فإن أفضل الضوابط أن يكون جزيئات صغيرة ذكرت لتعديل الاستقرار أو ترجمتها من مرنا من خلال UTR 3 'من الفائدة. إذا كان وجود هذه هيغير ممكن، وتقبل ضوابط بديلة تقليد التأثير المطلوب. يمكن أن تكون هذه miRNAs أو البروتينات ملزم RNA المعروف أن ممارسة آثارها عن طريق ملزمة ل'UTR 3 من الفائدة. تقييم هذه الضوابط قبل الفحص الأولي يشير ليس فقط وظيفة الفحص المتقدمة، ولكن يسمح أيضا لتقدير لها ديناميكية نطاق والحساسية والأداء في شكل الإنتاجية العالية.
باستخدام بروتوكول يصف نحن فرز مكتبة 2،000 مركبة 6. وقد استخدم العصبية، والأورام الصلبة خارج القحف الأكثر شيوعا من الطفولة، كنموذج البيولوجي و"UTR 3 من الجين الورمي MYCN، الذي التضخيم يتوقع بقوة نتائج السلبية لالعصبية، باسم الجينات المستهدفة 7 الشكل 2 الخطوط العريضة لتخطيط التجريبية. تم تقسيم الفرز في ثلاثة أشواط مع حجم دفعة من 27 لوحات عرضه في تشغيل واحد. وتضمنت دفعة من 27 لوحات مكتبة الطيف مجموعةلوحات N.1-n.8 + n.25 (الجولة الأولى)، n.9-n.16 n.25 + (الجولة الثانية) وn.16-n.24 n.25 + (المدى الثالث)، كل لوحة عرضه في ثلاث نسخ. وهكذا، كان يعاير لوحة مكتبة واحدة (n.25) في جميع أشواط ثلاثة مما يجعل احتمال المقارنة بين التشغيل. يصف بروتوكول أدناه تشغيل واحد من 9 لوحات مكتبة اختبار في ثلاث نسخ.
Protocol
Representative Results
Discussion
This protocol describes a cell-based reporter-gene assay aiming at the identification of modulators that target 3’ UTR-dependent post-transcriptional processes. It encompasses the primary screening and the counter-screen and, if needed, can be accompanied by a cytotoxicity assay. The outcome of the primary screening is a number of valuable candidate compounds, whose reproducibility and specificity is further validated in the counter-screening.
The identification of primary hits is based …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Italian Neuroblastoma Foundation for the full financial support to this project.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Culture plate 96-well White | PerkinElmer | 6005688 | |
| StorPlate 96-well U bottom (dilution plate) | PerkinElmer | 6008190 | |
| 100 ml disposable trough for reagents | Tecan | 10 613 048 | |
| 300 ml disposable robotic reservoir | VWR | PB12001301 | |
| Robot tips DITI 50μL Sterile | Tecan | 30038607 | |
| Robot tips DITI 200μL Sterile | Tecan | 30038617 | |
| Matrix 1.4 ml 2D Barcoded w, Flat Bottom Tubes | Thermo Scientific | 3711 | |
| ONE-Glo Luciferase Assay System | Promega | E6120 | |
| RPMI | Lonza | BE12-918F | |
| PBS-1X, w/o Ca++, Mg++ | Lonza | BE17-516F | |
| L-Glutamine 200mM | Lonza | BE17-605E | |
| FBS | Lonza | DE14-801F | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| The Spectrum collection (compound library) | MicroSource Discovery Systems | N/A | |
| Tecan Freedom EVO200 robot | Tecan | N/A | |
| Tecan F200 multiplate reader | Tecan | N/A |
References
- Schwanhäusser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
- Tebaldi, T., et al. Widespread uncoupling between transcriptome and translatome variations after a stimulus in mammalian cells. BMC Genomics. 13 (1), 220 (2012).
- Mitchell, S. F., Parker, R. Principles and properties of eukaryotic mRNPs. Mol. Cell. 54 (4), 547-558 (2014).
- Fu, Y., Dominissini, D., Rechavi, G., He, C. Gene expression regulation mediated through reversible m6A RNA methylation. Nat. Rev. Genet. 15 (5), 293-306 (2014).
- Matoulkova, E., Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. The role of the 3’ untranslated region in post-transcriptional regulation of protein expression in mammalian cells. RNA Biol. 9 (5), 563-576 (2012).
- Sidarovich, V., Adami, V., Quattrone, A. A Cell-Based High-Throughput Screen Addressing 3’ UTR-Dependent Regulation of the MYCN Gene. Mol. Biotechnol. 56 (7), 631-643 (2014).
- Cheung, N. -. K. V., Dyer, M. A. Neuroblastoma: developmental biology, cancer genomics and immunotherapy. Nat. Rev. Cancer. 13 (6), 397-411 (2013).
- Hughes, J. P., Rees, S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L. Principles of early drug discovery. Br. J. Pharmacol. 162 (6), 1239-1249 (2011).
- Herbst, J., et al. Multiplexing a high-throughput liability assay to leverage efficiencies. Assay Drug Dev. Techn. 7 (3), 294-303 (2009).
- van Olst, E. S. i. e. b. r. i. n. g. -., et al. Affordable luciferase reporter assay for cell-based high-throughput screening. J. Biomol. Screen. 18 (4), 453-461 (2013).
- Baker, J. M., Boyce, F. M. High-throughput functional screening using a homemade dual-glow luciferase assay. J. Vis. Exp. (88), (2014).
- Malo, N., Hanley, J. A., Cerquozzi, S., Pelletier, J., Nadon, R. Statistical practice in high-throughput screening data analysis. Nat. Biotechnol. 24 (2), 167-175 (2006).
- Hitti, E., et al. A versatile ribosomal protein promoter-based reporter system for selective assessment of RNA stability and post-transcriptional control. RNA. 16 (6), 1245-1255 (2010).
- Oikonomou, P., Goodarzi, H., Tavazoie, S. Systematic identification of regulatory elements in conserved 3’ UTRs of human transcripts. Cell Rep. 7 (1), 281-292 (2014).
- Gandin, V., et al. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. J. Vis. Exp. (87), (2014).
- Conne, B., Stutz, A., Vassalli, J. D. The 3’ untranslated region of messenger RNA: A molecular “hotspot” for pathology. Nat. Med. 6 (6), 637-641 (2000).
- Cheneval, D., Kastelic, T., Fuerst, P., Parker, C. N. A review of methods to monitor the modulation of mRNA stability: a novel approach to drug discovery and therapeutic intervention. J. Biomol. Screen. 15 (6), 609-622 (2010).
- Pascale, A., Govoni, S. The complex world of post-transcriptional mechanisms: is their deregulation a common link for diseases? Focus on ELAV-like RNA-binding proteins. Cell. Mol. Life Sci. 69 (4), 501-517 (2012).
- Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. Impaired pre-mRNA processing and altered architecture of 3’ untranslated regions contribute to the development of human disorders. Int. J. Mol. Sci. 14 (8), 15681-15694 (2013).
- Bhattacharyya, A., Trotta, C. R., Peltz, S. W. Mining the GEMS–a novel platform technology targeting post-transcriptional control mechanisms. Drug Discov. Today. 12 (13-14), 553-560 (2007).
- Peltz, S. W., Welch, E. M., Trotta, C. R., Davis, T., Jacobson, A. Targeting post-transcriptional control for drug discovery. RNA Biol. 6 (3), 329-334 (2009).
