Abstract
كلا النسخي والتنظيم بعد النسخي يكون لها تأثير عميق على الجينات التعبير. ومع ذلك، تركز اعتمدت عادة خلية مقرها المقايسات الفرز على تنظيم النسخي، ويجري تهدف أساسا في تحديد جزيئات استهداف المروج. ونتيجة لذلك، يتم كشف آليات ما بعد النسخي إلى حد كبير من التعبير الجيني تطوير الأدوية المستهدفة. نحن هنا وصف فحص خلية القاعدة التي تهدف إلى التحقيق في دور 'المنطقة غير مترجمة (3' 3 UTR) في التشكيل مصير مرنا لها، وإلى تحديد مركبات قادرة على تعديله. ويستند هذا الفحص على استخدام بناء luciferase المراسل تحتوي على "UTR 3 من الجينات في المصالح المتكاملة ثابت في خط الخلية الأمراض ذات الصلة. وينقسم البروتوكول إلى قسمين، مع التركيز في البداية على غربلة أولية تهدف إلى التعرف على الجزيئات التي تؤثر luciferase النشاط بعد 24 ساعة من العلاج. الجزء الثاني من البروتوكوليصف ضرورية لتمييز المركبات تحوير luciferase النشاط على وجه التحديد من خلال UTR 3 'الفرز مضادة. بالإضافة إلى بروتوكول مفصلة ونتائج ممثلة، ونحن نقدم اعتبارات هامة عن تطور الفحص والتحقق من ضرب (ق) على الهدف الذاتية. فإن وصفه خلية مقرها مراسل فحص الجينات تسمح للعلماء لتحديد جزيئات تحوير مستويات البروتين عن طريق آليات ما بعد النسخي تعتمد على "UTR 3.
Introduction
لتنظيم النسخي فترة طويلة من التعبير الجيني كان يعتقد أن تلعب الكبرى إن لم يكن دور الحصري في السيطرة على إنتاج البروتين. تراكم الأدلة، ومع ذلك، يشير إلى أن التنظيم بعد النسخي يساهم بقدر ما، إن لم يكن أكثر من والتنظيم النسخي لتحديد البروتين الخلوي وفرة 1،2. السيطرة بعد النسخي في التعبير الجيني هو أكثر تعقيدا وتفصيلا مما كان يعتقد في البداية. في الواقع، ظهرت جميع مراحل مختلفة من السيطرة ما بعد النسخي إلى أن ينظم، بما في ذلك تجهيز مرنا، التعريب، والدوران، والترجمة 3 فضلا عن وصفه حديثا عكسها RNA مثيلة 4. من عدد من عمليات التنظيم بعد النسخي يحتمل أن تتأثر، ووصف الفحص أدناه يركز على تلك التي تنطوي على "المنطقة غير مترجمة (3 'مرنا 3 UTR). 3 'UTR يؤثر على نطاق واسع مرنا مصير أساسا عن طريق التفاعل محدد من ملزم RNA العلاقات العامةoteins والرنا غير المشفر إلى متواليات التنظيمية و / أو هياكل الثانوية 5. ولذلك، فإن الجزيئات الصغيرة التي تغير هذه التفاعلات أو تتداخل مع المنبع مسارات نقل الإشارة تحول التوازن الذي ينظم وفرة البروتين. هذا النهج العلاجي له أهمية خاصة بالنسبة لأمراض الإنسان التي أدلة موجود يظهر أن الجينات الأمراض ذات الصلة يتعرضون لتنظيم مرحلة ما بعد النسخي، والتي بالتالي تمثل هدفا محتملا للتدخل الدوائي. ولذلك، يمكن لنظم يسمح لفحص جهري مستويات مرنا من خلال التدخل في آليات الرقابة في مرحلة ما بعد النسخي في شكل الإنتاجية العالية تصبح أدوات قيمة في تحديد العلاجات رواية المحتملة.
ووصف القائم على خلية مقايسة مراسل الجينات يسمح للتعرف على مركبات قادرة على تعديل مرنا مصير عبر آليات تعتمد على لها 'UTR 3. وهو يتألف من عدة ج الرئيسيةomponents (الشكل 1) ويتطلب بضع خطوات تمهيدية للتحقق من صحة جدوى الفحص. أولا وقبل كل شيء، تم تصميم بناء مراسل لتشمل UTR 3 'من الجينات في المصالح. وتنصهر في "UTR 3 إلى نهاية جين مراسل مثل يراعة luciferase (الشكل 1). سوف أية تغييرات في آليات الرقابة في مرحلة ما بعد النسخي المبذولة من خلال إدراج 3 'UTR يغير من الاستقرار و / أو الكفاءة ترجمة هذا النص خيالية، مما أدى إلى مستويات luciferase المراسل متنوعة. لذلك، والتغيرات في luciferase النشاط تخدم مقياس غير مباشر كما في المتضررين التنظيم بعد النسخي من الجينات في المصالح. المكون الثاني من النظام هو بناء مراسل السيطرة، وهو التعبير البلازميد متطابقة أن يعبر عن نفسه مراسل الجينات ولكن لا تحتوي على أي 3 'UTR. البلازميدات مراسل اثنين يمكن أن تصمم في المختبر باستخدام بروتوكولات البيولوجيا الجزيئية التقليدية أو شراؤها من مصادر تجارية.
اختيار خط الخلية المناسبة أمر بالغ الأهمية لبناء الفحص. الذي خط الخلية هو النموذج الأمثل يعتمد على عوامل عديدة تتراوح بين المتطلبات السريرية مثل تشابه القصوى لعلم الأمراض على القضايا العملية فقط مثل خصائص توافر، وtransfectability، والنمو. الأهم من ذلك، قبل المضي قدما ينبغي لأحد أن تأكد من أن انصهار 3 'UTR إلى الجين مراسل له تأثير متوقع على مستوى النص خيالية. غياب اختلاف كبير في إشارة luciferase المراسل من 3 'UTR الحاملة والسيطرة مراسل يبني عابر في الخلايا المحددة تشير إلى أن 3' UTR ليس وظيفي في هذا النموذج الخلوي، مما دفع للبحث عن بديل منها. لتنسيق الإنتاجية العالية، 3 'UTR الحاملة والسيطرة luciferase المراسل يبني مراسل ينبغي إدماج ثابت في خط الخلية المحددة. باستخدام متكاملة مستقر على مدى عابر transfectedخط الخلية هو الأفضل لعدة أسباب. هذا وسوف توسيع اختيار نموذج الخلوية بما في ذلك خطوط الخلايا التي يصعب بالنقل، والحد من التباين في البيانات الناشئة عن التقلبات في كفاءة ترنسفكأيشن، تهدأ التكاليف. وعلاوة على ذلك، على خلايا ترنسفكأيشن عابرة وفي أحيان كثيرة جدا مثقلة البلازميد الحمض النووي مما يؤدي إلى تشبع النظام. في هذه الإعدادات قد تكون زيادة أخرى في التعبير مراسل تحديا، مما أدى إلى انخفاض حساسية تجاه مركبات upregulating المحتملة.
وأخيرا، عندما يتم تعيين كافة مكونات فحص ما يصل، فمن الأهمية بمكان قبل أن ينتقل إلى تنسيق الإنتاجية العالية لتحديد جدوى الفحص، أي إذا luciferase النشاط يمكن أن يكون في الواقع الأعلى وإلى الأسفل تنظم على وجه التحديد عن طريق إدخال 3 " UTR. فإن أفضل الضوابط أن يكون جزيئات صغيرة ذكرت لتعديل الاستقرار أو ترجمتها من مرنا من خلال UTR 3 'من الفائدة. إذا كان وجود هذه هيغير ممكن، وتقبل ضوابط بديلة تقليد التأثير المطلوب. يمكن أن تكون هذه miRNAs أو البروتينات ملزم RNA المعروف أن ممارسة آثارها عن طريق ملزمة ل'UTR 3 من الفائدة. تقييم هذه الضوابط قبل الفحص الأولي يشير ليس فقط وظيفة الفحص المتقدمة، ولكن يسمح أيضا لتقدير لها ديناميكية نطاق والحساسية والأداء في شكل الإنتاجية العالية.
باستخدام بروتوكول يصف نحن فرز مكتبة 2،000 مركبة 6. وقد استخدم العصبية، والأورام الصلبة خارج القحف الأكثر شيوعا من الطفولة، كنموذج البيولوجي و"UTR 3 من الجين الورمي MYCN، الذي التضخيم يتوقع بقوة نتائج السلبية لالعصبية، باسم الجينات المستهدفة 7 الشكل 2 الخطوط العريضة لتخطيط التجريبية. تم تقسيم الفرز في ثلاثة أشواط مع حجم دفعة من 27 لوحات عرضه في تشغيل واحد. وتضمنت دفعة من 27 لوحات مكتبة الطيف مجموعةلوحات N.1-n.8 + n.25 (الجولة الأولى)، n.9-n.16 n.25 + (الجولة الثانية) وn.16-n.24 n.25 + (المدى الثالث)، كل لوحة عرضه في ثلاث نسخ. وهكذا، كان يعاير لوحة مكتبة واحدة (n.25) في جميع أشواط ثلاثة مما يجعل احتمال المقارنة بين التشغيل. يصف بروتوكول أدناه تشغيل واحد من 9 لوحات مكتبة اختبار في ثلاث نسخ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: إنتاجية هذه النظم الفحص تعتمد على معدات المختبرات المتاحة HTS. ومما يسهل هذا البروتوكول من قبل TECAN الحرية EVO 200 الروبوت، الذي يؤدي التعامل مع السائل في شكل 96-جيدا. التصغير إلى تنسيق 384 جيدا هو ممكن أيضا. يتم وضع نظام مناولة السائل الروبوتية تحت غطاء تدفق الصفحي من أجل الحفاظ على ظروف معقمة خلال جميع الخطوات التجريبية. إذا لم يكن هناك أتمتة معالجة السائل هو متاح، بروتوكول يمكن تكييفها بسهولة إلى تنسيق منخفضة الإنتاجية.
الفحص الأولي
1. يوم 1: إعداد وخلايا البذور
ملاحظة: خلايا البذور لتسفر عن 80٪ التقاء في وقت معايرة luciferase النشاط، أي 48 ساعة بعد البذر.
- في resuspend trypsinized الخلايا العصبية CHP134-mycn3UTR إلى تركيز من 2 × 10 5 خلية / مل في RPMI تحتوي على 10٪ FBS و 1٪ L-الجلوتامين. لمدة 27 لوحات إعداد 250 مل على الأقل من تعليق الخلية مع الأخذ بعين الاعتبار التعامل السائل، أحواض كميات الميتة والخطوات pipetting لالمتكررة. صب تعليق خلية في خزان معقم ووضعه على طاولة الروبوت.
- ضع 9 barcoded بيضاء مسطحة القاع لوحات 96-جيدا وعلبة من 200 ميكرولتر نصائح الماصة العقيمة على مكتب الروبوت. مزيج تعليق خلية من قبل pipetting قبل كل خطوة إعفاء لتجنب خلايا تسوية تحت الجاذبية. الاستغناء 75 ميكرولتر من الخلايا في كل بئر من 9 لوحات للحصول على الكثافة النهائية من 1.5 × 10 4 خلايا لكل بئر.
- تغطية لوحات مع الأغطية وتركهم خارج الحاضنة لمدة 30 دقيقة للسماح للخلايا لالرواسب في قاع البئر. وهذا تقليل الآثار الحافة.
- كرر الخطوات من 1.2 و 1.3 ضعف من أجل إعداد إجمالي عدد 27 لوحات.
- وضع لوحات عند 37 درجة مئوية وCO 2 5٪ واحتضان لمدة 24 ساعة.
2. يوم 2: علاج للخلايا مع المركبات المكتبة
ntent "> ملاحظة: تتكون المكتبة الطيف مجموعة جزيء صغير من 2،000 المركبات مرتبة في 8 الصفوف والأعمدة 10 في 25 لوحات 96-جيدا في تركيز 10 ملم في DMSO يتم ترك الآبار على الأعمدة الأولى والأخيرة فارغة لعناصر. وعادة ما يتم تنفيذ. المقايسات فحص المركبة في 1-10 ميكرومتر تركيز مركب (8). بروتوكول الفحص الموصوفة هنا بإصلاح 2 ميكرومتر باسم تركيز العمل و 24 ساعة كنقطة نهاية الفحص.- ذوبان الجليد 9 لوحات مكتبة المجمع في درجة حرارة الغرفة.
- إعداد اثنين من أحواض مع معقم PBS وPBS-0.5٪ DMSO الحلول ووضعها على المنضدة الروبوت. لكل لوحة المكتبة، وإعداد وتسمية وفقا لذلك واحدة لوحة التخفيف - البولي بروبلين U-أسفل لوحة 96-جيدا مع حجم عمل لا يقل عن 400 ميكرولتر. ملء كل بئر من الأعمدة 2 إلى 11 لوحات التخفيف مع 398 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني العقيمة باستخدام نصائح الثابتة معالج السائل. ملء الأعمدة 1 و 12 مع 50 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني العقيمةمع 0.5٪ DMSO من أجل التكاثر تركيز المركبات في آبار المراقبة (0.02٪).
- وضع اثنين من لوحات المكتبة، لوحات تخفيف المسمى المقابل، صندوقين من 50 ميكرولتر نصائح الماصة العقيمة وستة خلايا لوحات على الطاولة الروبوت. كشف خلايا لوحات.
- الماصة 2 ميكرولتر من 10 ملي حل الأوراق المالية من واحد من اثنين من لوحات مكتبة في لوحة التخفيف المقابلة وتخلط جيدا. وهذا يؤدي إلى تركيز مركبات وسيطة من 50 ميكرومتر. باستخدام نفس مجموعة من النصائح، الاستغناء 3 ميكرولتر من التخفيف 50 ميكرومتر في 3 البيضاء barcoded لوحات 96-جيدا مع الخلايا. هذه النتائج خطة التخفيف في 2 ميكرومتر تركيز كل العمل اختبار المجمع.
ملاحظة: لتجنب التلاعب غير الضرورية مع النصائح، واستخدام مجموعة كاملة من 96 نصائح من البداية، على الرغم من أن لوحات مكتبة تحتوي على مركبات فقط 80. وهذا ممكن منذ أول والأعمدة الأخيرة من لوحات مكتبة فارغة. - استبدال نصائح الماصة وكرر القديسالجيش الشعبي 2.4 لوحة مكتبة الثانية.
- تغطية لوحات الخلايا وإعادتها إلى حاضنة لمدة 24 ساعة.
- كرر الخطوات من 2،3-2،6 مرتين أخريين لوحات مكتبة المتبقية.
3. يوم 3: إجراء الفحص luciferase المراسل
ملاحظة: قبل تنفيذ فحص luciferase المراسل، فمن الممكن أن معدد مع مقايسة بقاء الخلية على أساس الحد من ريسازورين من أجل الحصول على مؤشر الخلية الجدوى من كل بئر 9. مضاعفة و luciferase جدوى فحص النتائج المقايسات في الحد من إشارة luciferase المراسل أن، ومع ذلك، يمكن تجاهلها إذا توفر الخلايا على مستوى عال يكفي من luciferase النشاط. ويمكن الكشف عن luciferase النشاط من قبل مجموعة متنوعة من 10،11 luciferase المراسل الكواشف فحص التجارية ومحلية الصنع مع مستقرة إشارة الانارة.
- تتوازن الكاشف luciferase المراسل أعيد الاختيار إلى درجة حرارة الغرفة. تأكد من أن حجم ما يكفي لجميع لوحات يعاير. 27 لوحةسوف تكون هناك حاجة ق 170 مل من luciferase المراسل كاشف مع الأخذ بعين الاعتبار التعامل السائل، أحواض حجم القتلى والخطوات pipetting لالمتكررة. صب كاشف luciferase المراسل في خزان ووضعه على طاولة الروبوت.
- إزالة 9 لوحات مع الخلايا من الحاضنة، ووضعها على طاولة الروبوت، والكشف عن وانتظر حتى معايرتها إلى درجة حرارة الغرفة. إضافة 50 ميكرولتر من كاشف luciferase المراسل في لوحة جيدا من لوحة. بين لوحات، وإدخال تأخير يساوي الوقت في القراءة التلألؤ من لوحة واحدة. وهذا يؤكد أن يتم قياس جميع لوحات ضمن فترة زمنية متساوية من إضافة كاشف.
- بعد حضانة 30 دقيقة، ووضع لوحة الأولى في luminometer وقياس التلألؤ بعد خطوة تهز وجيزة. أكرر للجميع لوحات. تسجيل الباركود من كل لوحة وربطه إلى ملف بيانات المطابق لتجنب الأخطاء الناجمة عن عدد كبير من لوحات التعامل معها.
- كرر الخطوات من 3،2-3،3 مرتين ل18 لوحات المتبقية مع الخلايا. جمع ما تبقى من luciferase المراسل كاشف وتخزينه في -20 ° C.
4. يوم 4: تحليل البيانات
- عملية البيانات التجريبية باستخدام تطبيع جميع العينات إلى متوسط ضوابط المعالجة مركبة على لوحة. لكل مجمع مكتبة، وحساب X القيمة المتوسطة وSD على يثلث.
- حدد يصل التنظيم ويضرب من خلال تحديد عتبة X ± ك × SD، حيث يتم احتساب X القيمة المتوسطة وSD على كل القيم فحص معالجتها، و k-تنظيم أسفل هو تعريف ثابت.
- تحديد عتبة التعسفية قطع <20٪ من الضوابط المعالجة المركبة عند تخفيض إشارة luciferase المراسل هو على الارجح المرتبطة سمية المركب. والتخلص من الزيارات دون هذه العتبة تقلل إلى حد كبير عدد الزيارات إيجابية كاذبة في مكافحة الفرز.
ملاحظة: بدلا من القائم على السيطرة التطبيع، البيانات التجريبية يمكن معالجة تطبيق Z درجة أو ما قوية التناظرية B قالأساسية 12. وبالإضافة إلى ذلك، تتوفر 12 النهج الإحصائية بديلة لاختيار تضررا.
5. مكافحة الفحص
ملاحظة: المركبات التي تم تحديدها في الشاشة الرئيسية (المسمى 'يضرب') تأكدت وتقييمها لخصوصية من قبل مكافحة الفرز.
- الكرز اختيار يضرب مختارة من مأخوذة المخزنة في واحدة أنابيب barcoded 2D وخلق فرص عمل جديدة "ضرب لوحات"، وتوفير تخطيط المقابل. لا تنسى أن تترك مواقف مجانية للضوابط.
ملاحظة: في حالة عدم وجود نظام الانتقاء كفاءة، يمكن للمرء أن يختبر كل من السيطرة و3 'UTR الحاملة للخلايا بالتوازي في الفحص الأولي. في هذه الحالة، سوف اختيار محددة من المركبات مع الآثار تعتمد فقط على قدم 3 'UTR يكون ممكنا بعد الفحص الأولي مما يلغي الحاجة لمكافحة الفرز. ومع ذلك، فإن فحص مواز في اثنين من خطوط الخلايا مضاعفة فحصالتكاليف. - بعد بروتوكول للفحص الأولي (القسم "يوم 1: إعداد وخلايا البذور")، لكل "ضرب لوحة" إعداد ثلاث لوحات 96-جيدا من كل CHP134-mycn3UTR وCHP134-CTRL خلايا مستقرة.
- بعد بروتوكول للفحص الأولي (القسم "يوم 2: علاج للخلايا مع مكتبة مركبات")، استخدم كل لوحة ضرب لعلاج ثلاثة CHP134-mycn3UTR وثلاث لوحات CHP134-CTRL في 2 ميكرومتر تركيز العمل.
ملاحظة: في حين يتم تنفيذ الشاشة مضادة الموصوفة هنا في يثلث في جرعة واحدة من 2 ميكرومتر، قد يكون من المفيد استبدال مكررات القياسية واختبار يضرب في 3 تركيزات كما التخفيفات 10 أضعاف تتراوح بين 2 ميكرومتر إلى 20 نانومتر. ان تطبيق هذا النهج لن تسمح فقط لتأكيد البيانات من الشاشة الرئيسية، ولكن أيضا للحصول على بيانات الاستجابة للجرعة أولية عن الضربات الأولية، والتقليل من معدلات إيجابية كاذبة. في هذه الحالة، يجب أن يكون خط أنابيب تحليل مختلف تطبيق صحيفةإد لمعالجة البيانات التجريبية والتأكد من الزيارات. - بعد بروتوكول للفحص الأولي (القسم "يوم 3: إجراء الفحص luciferase المراسل")، وقياس luciferase النشاط في جميع لوحات CHP134-mycn3UTR وCHP134-CTRL.
- بعد بروتوكول للفحص الأولي (القسم "يوم 4: تحليل البيانات")، وتطبيع البيانات التجريبية من الآبار المعالجة إلى متوسط ضوابط المعالجة مركبة على لوحة وحساب المتوسط وSD على مكررات. لكل مجمع اختبارها، وحساب التغير أضعاف من luciferase النشاط في CHP134-mycn3UTR مقابل خلايا CHP134-CTRL. اختر تغيير أضعاف التعسفي خفض العرضية ل> 1.5 وأهمية ص القيم ل<0.01.
ملاحظة: في إعدادات الفحص وصف المعلمة المحدد لضرب خصوصية هو تغيير أضعاف كبير من luciferase النشاط في CHP134-mycn3UTR مقابل خلايا CHP134-CTRL. إذا لزم الأمر، يمكن للمرء أن أيضا تقييم سمية المركبة عن طريق أداء في وقت واحد مقايسة بقاء الخلية على ذاتهمركبات lected. قد يكون هذا مفيدا خاصة إذا كان يضرب الأولية يتم فحص مكافحة في تحليل الاستجابة للجرعة. لجرعة واحدة، تجربتنا يشير إلى وجود علاقة قوية انخفاض luciferase النشاط مع انخفاض خلية بقاء 6. لذلك، انخفض luciferase النشاط في الخلايا المستهدفة وكذلك الخلايا السيطرة يمكن اعتباره مؤشرا على سمية المركب في تركيز اختبارها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
باستخدام نهج وصفها، وفرز مكتبة 2،000 مركبة لجهري المحتملة لآليات الرقابة في مرحلة ما بعد النسخي المبذولة من خلال 'UTR 3 من الجين MYCN الشكل 3 يصور نتائج الفرز الأولية يتضح من لوحة مكتبة واحدة. تم الحصول على إشارة luciferase المراسل عرض كنسبة مئوية من الضوابط المعالجة السيارة عن طريق قياس luciferase النشاط في لوحات ثلاث نسخ من خلايا CHP134-mycn3UTR تعامل مع المركبات من لوحة مكتبة واحدة. كما هو متوقع، كان غالبية المركبات أي تأثير على luciferase النشاط كما يتبين من القيم قريبة من خط الأساس 100٪. وقد تم اختيار يضرب (المربعات واضحة) تحديد عتبة X ± 2 SD، حيث يتم احتساب X القيمة المتوسطة وSD على كل القيم الفحص. يجب إزالة المركبات الحد luciferase النشاط أقل من 20٪ (واحد ملحوظ مع النجمة) من الخضوع للتثبيط الكشف على الأرجح النتائج من pronounced سمية الخلوية للمجمع.
ويوضح الشكل 4 أمثلة التمثيلية قليلة من البيانات التي تم الحصول عليها في مكافحة فحص حوالي 100 مركبات. كما يمكن الحكم من تطبيع إشارة luciferase المراسل في الخلايا CHP134-CTRL، W المجمع في 2 ميكرومتر تركيز ليس له تأثير على بقاء الخلية، في حين مجمع X يعرض بعض النشاط السامة للخلايا. كلا المركبات W و X، ومع ذلك، تسبب MYCN 3 'UTR محددة تصل تنظيم luciferase النشاط، كما يتبين من أضعاف الفرق التغيير واختبار (ت). Y المجمع في 2 ميكرومتر تركيز يبدو لتقديم تنازلات حيوية خلايا CHP134. من حيث خصوصية لا يوجد فرق في luciferase النشاط في CHP134-mycn3UTR والخلايا CHP134-CTRL. وأخيرا، فإن الزيادة في luciferase النشاط المكتشفة في الفحص الأولي للمجمع Z لا تعتمد حقا على MYCN 3 'UTR، منذ لوحظ معادل يصل التنظيم في الخلايا CHP134-CTRL. لم نكتشف أي ضرب مما أدى إلى MYCN 3 'UTR محددة أسفل تنظيم luciferase النشاط.
. تعرض لوحة العليا مكونات الفحص الجيني مراسل خلية القاعدة الرسم التخطيطي للجين MYCN: الشكل 1. ويوجه نص MYCN (NM_005378.4) إلى مقياس. وتمثل صناديق إلى exons مع المناطق المظللة المقابلة لCDS، وخطوط تمثل الإنترونات. مراسل يبني لوك-CTRL ولوك-3UTR-MYCN يتم تمثيل تخطيطي أدناه. CMV، الفيروس المضخم للخلايا. SV40، الفيروس القردي 40. وقد تم اختيار خط الخلية العصبية CHP134 لإنتاج الخلايا ستابلي استخدام البلازميدات المذكورة آنفا. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الخطوط العريضة للفحص الأولي كانت تستخدم كل واحدة لوحة مكتبة المجمع لعلاج لوحات ثلاث نسخ من خلايا CHP134-mycn3UTR. وقد تم قياس luciferase النشاط بعد 24 ساعة من العلاج.
الرقم 3: لوحة جيدا مبعثر مؤامرة من القيم تطبيع يمثل واحدة لوحة 96-جيدا من الفرز الأولي تم علاج خلايا CHP134-mycn3UTR المتزايد في لوحات 96-جيدا مع مركبات المكتبة في 2 تركيز ميكرومتر. كل نقطة يناظر luciferase النشاط الكشف عن مركب واحد بعد 24 ساعة من العلاج وتطبيع للإشارة luciferase المراسل متوسط الكشف في الضوابط المعالجة المركبة داخل نفس اللوحة. يتم عرض نقاط البيانات التالية الموقف المركبات داخل لوحة 96-جيدا (10 مركبات في الأعمدة 2-10 من الألف الخام لG). يعني أكثر من ثلاثة مكررات ± يظهر SD. يتم عرض يضرب كمربعات واضحة. يتم وضع علامة على ضرب تتميز انخفاض النشاط luciferase المراسل أقل من 20٪ مع النجمة.
وعولج أمثلة التمثيلية للمكافحة فحص CHP134-mycn3UTR وCHP134-CTRL خلايا مستقرة بالتوازي مع مركبات محددة مسبقا في الفحص الأولي: الشكل 4. تم إجراء فحص luciferase المراسل بعد 24 ساعة من العلاج في 2 تركيز ميكرومتر. الرسم البياني يبين نتائج ممثلة لمدة أربعة مركبات اختيار المعينة W، X، Y، Z. ويقابل كل شريط لluciferase النشاط الكشف عن مركب واحد وتطبيع للإشارة luciferase المراسل متوسط ضوابط المعالجة المركبة في الخلايا مستقرة المشار إليها. أضعاف الفرق التغيير ودلالة إحصائية في ثنائي الطرف اختبار t يتم عرضها، ** P <0.01،*** P <0.001.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Culture plate 96-well White | PerkinElmer | 6005688 | |
| StorPlate 96-well U bottom (dilution plate) | PerkinElmer | 6008190 | |
| 100 ml disposable trough for reagents | Tecan | 10 613 048 | |
| 300 ml disposable robotic reservoir | VWR | PB12001301 | |
| Robot tips DITI 50 μl Sterile | Tecan | 30038607 | |
| Robot tips DITI 200 μl Sterile | Tecan | 30038617 | |
| Matrix 1.4 ml 2D Barcoded w, Flat Bottom Tubes | Thermo Scientific | 3711 | |
| ONE-Glo Luciferase Assay System | Promega | E6120 | |
| RPMI | Lonza | BE12-918F | |
| PBS-1x, w/o Ca2+, Mg2+ | Lonza | BE17-516F | |
| L-Glutamine 200 mM | Lonza | BE17-605E | |
| FBS | Lonza | DE14-801F | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| The Spectrum collection (compound library) | MicroSource Discovery Systems | N/A | |
| Tecan Freedom EVO200 robot | Tecan | N/A | |
| Tecan F200 multiplate reader | Tecan | N/A |
References
- Schwanhäusser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
- Tebaldi, T., et al. Widespread uncoupling between transcriptome and translatome variations after a stimulus in mammalian cells. BMC Genomics. 13 (1), 220 (2012).
- Mitchell, S. F., Parker, R. Principles and properties of eukaryotic mRNPs. Mol. Cell. 54 (4), 547-558 (2014).
- Fu, Y., Dominissini, D., Rechavi, G., He, C. Gene expression regulation mediated through reversible m6A RNA methylation. Nat. Rev. Genet. 15 (5), 293-306 (2014).
- Matoulkova, E., Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. The role of the 3’ untranslated region in post-transcriptional regulation of protein expression in mammalian cells. RNA Biol. 9 (5), 563-576 (2012).
- Sidarovich, V., Adami, V., Quattrone, A. A Cell-Based High-Throughput Screen Addressing 3’ UTR-Dependent Regulation of the MYCN Gene. Mol. Biotechnol. 56 (7), 631-643 (2014).
- Cheung, N. -K. V., Dyer, M. A. Neuroblastoma: developmental biology, cancer genomics and immunotherapy. Nat. Rev. Cancer. 13 (6), 397-411 (2013).
- Hughes, J. P., Rees, S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L.
- Herbst, J., et al. Multiplexing a high-throughput liability assay to leverage efficiencies. Assay Drug Dev. Techn. 7 (3), 294-303 (2009).
- van Olst, E. S. iebring-, et al. Affordable luciferase reporter assay for cell-based high-throughput screening. J. Biomol. Screen. 18 (4), 453-461 (2013).
- Baker, J. M., Boyce, F. M. High-throughput functional screening using a homemade dual-glow luciferase assay. J. Vis. Exp. (88), (2014).
- Malo, N., Hanley, J. A., Cerquozzi, S., Pelletier, J., Nadon, R. Statistical practice in high-throughput screening data analysis. Nat. Biotechnol. 24 (2), 167-175 (2006).
- Hitti, E., et al. A versatile ribosomal protein promoter-based reporter system for selective assessment of RNA stability and post-transcriptional control. RNA. 16 (6), 1245-1255 (2010).
- Oikonomou, P., Goodarzi, H., Tavazoie, S. Systematic identification of regulatory elements in conserved 3’ UTRs of human transcripts. Cell Rep. 7 (1), 281-292 (2014).
- Gandin, V., et al. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. J. Vis. Exp. (87), (2014).
- Conne, B., Stutz, A., Vassalli, J. D. The 3’ untranslated region of messenger RNA: A molecular “hotspot” for pathology. Nat. Med. 6 (6), 637-641 (2000).
- Cheneval, D., Kastelic, T., Fuerst, P., Parker, C. N. A review of methods to monitor the modulation of mRNA stability: a novel approach to drug discovery and therapeutic intervention. J. Biomol. Screen. 15 (6), 609-622 (2010).
- Pascale, A., Govoni, S. The complex world of post-transcriptional mechanisms: is their deregulation a common link for diseases? Focus on ELAV-like RNA-binding proteins. Cell. Mol. Life Sci. 69 (4), 501-517 (2012).
- Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. Impaired pre-mRNA processing and altered architecture of 3’ untranslated regions contribute to the development of human disorders. Int. J. Mol. Sci. 14 (8), 15681-15694 (2013).
- Bhattacharyya, A., Trotta, C. R., Peltz, S. W. Mining the GEMS--a novel platform technology targeting post-transcriptional control mechanisms. Drug Discov. Today. 12 (13-14), 553-560 (2007).
- Peltz, S. W., Welch, E. M., Trotta, C. R., Davis, T., Jacobson, A. Targeting post-transcriptional control for drug discovery. RNA Biol. 6 (3), 329-334 (2009).
