Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

בזמן אמת המבוסס על הבדיקה PCR גישות למדידת כמותית של מיקרו-רנ"א

doi: 10.3791/52586 Published: April 14, 2015

Summary

מיקרו-רנ"א במחזור צמחו לאחרונה כסמנים ביולוגיים מבטיחים וחדשניים לסוגי הסרטן שונים ולמחלות אחרות. המטרה של מאמר זה היא לדון בשלוש פלטפורמות שונות המבוסס על בדיקה בזמן אמת PCR ושיטות שאינן זמינים לכמת ולקבוע את השפע של מיקרו-רנ"א במחזור.

Abstract

PCR כמותי המבוסס על בדיקה (qPCR) הוא שיטה מועדפת למדידת שפע תמליל, שכן הוא אחד מהשיטות זיהוי הרגישים ביותר המספקת ניתוח מדויק ושחזור. כימיה מבוססת Probe מציעה את הקרינה רקע לפחות בהשוואה לchemistries אחר (המבוסס על צבע). נכון להיום, יש כמה פלטפורמות זמינות שכימיה מבוססת בדיקה שימוש כדי לכמת שפע תמליל. qPCR בצלחת גם 96 הוא השיטה הנפוצה ביותר באופן שגרתי, אך רק למקסימום של 96 דגימות או miRNAs ניתן לבדוק בטווח אחת. זה זמן רב ומייגע, אם מספר גדול של דגימות / miRNAs הוא להיות מנותח. פלטפורמות מבוססות בדיקה תפוקה גבוהה כגון מיקרופלואידיקה (למשל כרטיס מערך TaqMan) ומערכי nanofluidics (למשל OpenArray) הצעת קלות וביעילות reproducibly לזהות את השפע של מיקרו-רנ"א המרובים במספר גדול של דגימות בזמן קצר. הנה, אנחנו מדגימים את ניסיוני התקנהnd פרוטוקול כדי לכמת את מירנה מסרום או דגימות פלזמה EDTA, באמצעות כימיה מבוססת בדיקה ושלוש פלטפורמות שונות (96 צלחת גם, מיקרופלואידיקה ומערכי nanofluidics) מציעה רמות גוברים של תפוקה.

Introduction

מייקרו RNA (miRNAs) הוא ~ 22 נוקליאוטידים (NC) RNAs ללא קידוד, מתפקד כרגולטורים של ביטוי גני 1-3. רוב miRNAs בבעלי חיים לתפקד באמצעות זיווג בסיס רצף ספציפי עם mRNA, מיקוד 'UTR 3, מה שמוביל לרגולציה שלילית של ביטוי גני 2-4. זו מתרחשת בדרך כלל באמצעות בלימת תרגום mRNA או אחר טיפה-off ריבוזומלי. miRNAs במחזור הוכח להיות סמנים ביולוגיים חדשניים במחקר ובשדות קליניים עבור מגוון רחב של מחלות, כגון סוכרת 5-7, השחלות 8, סרטן הערמונית וסרטן השד 9 10,11, צהבת מסוג B 12 ומחלות אוטואימוניות אחרות 13. מחקר נערך לזהות miRNAs בשפע בתאים או רקמות שונים, כמו גם שבמחזור מפלזמה אנושית ודגימות סרום, שהוא נגיש יותר ופחות פולשני 9,11-15.

שיטות שונות של כימות מירנה היו דוארstablished באמצעות פלטפורמות מרובות, כגון פלטפורמת 96-היטב סטנדרטית צלחת 4,12,16-18, פלטפורמת כרטיס מיקרופלואידיקה 12,18-23 ופלטפורמת מערך nanofluidics 17,24. בזמן אמת PCR (qPCR) מציע את היכולת למדוד מספרים יחסי או מוחלטים של תמלילים באמצעות מרובה (dye- או מבוסס בדיקה) chemistries. כימיה PCR בזמן אמת המבוססת על הבדיקה מציעה את היתרון של הקרינה רקע נמוכה ורגישות גבוהה לגילוי עותק תמליל בודד. הוא יחסית חסכוני, פשוט לשימוש ומאוד לשחזור, מה שהופך את שיטה מועדפת לכימות וקביעת ביטוי מירנה 25. שיטת qPCR מבוססת בדיקה בדרך כלל כרוכה בשני שלבים: להפוך שעתוק (RT) וqPCR 4,26,27. RT הוא המקום שבי פריימר גזע הלולאה RT הוא הכלאה למולקולת מירנה בוגרת או עיקרי והמיר ל- DNA משלים (ג). כימות של מוצר cDNA מתבצעת לאחר מכן באמצעות פריימרים PCR מירנה ספציפיים26-28. עיקרון qPCR מבוסס בדיקה מבוסס על זיהוי של הארכה משלימה גדיל בזמן אמת, הכוללת הידרוליזה של החללית מתויג fluorescently. בדיקות אלה נועדו להכיל כתב ניאון ומרווה, כי הם פשוט בנפרד כדי לאפשר סריג (העברת הקרינה תהודה אנרגיה). זיהוי של הפליטה מכתב הקרינה (פולט) מוסווה בקרבתה של מולקולת המרווה. כאשר פולימראז תקי (pol) משתרע מפריימר במעלה הזרם ומגיע מזלג (סוף '5 של הבדיקה), פעילות exonuclease pol תקי hydrolyses הבדיקה, שהובילה לניתוק / הפרדה פיזית של פולט הניאון מהמרווה. גרסה זו של מולקולה בודדת של פולט הקרינה שתועדה על ידי הגלאים ומוצגת כגידול מצטבר באות הקרינה שמגם / תגובה. העלייה בקרינה היא פרופורציונלית לכמות של מוצר ה- PCR שנוצרה, המאפשר qu מדויקantification של 26,28 היעד המוגבר.

עם ביקוש גובר בכימות מירנה, בינוני לטכנולוגיות תפוקה גבוהה פותחו כדי לאפשר למספר גדול יותר של דגימות לעיבוד בפרק זמן קצר. מערך TaqMan בצפיפות נמוכה (TLDA) הוא עיצוב בינוני תפוקה חדשני microfluidic מבוסס על הכימיה qPCR מבוסס בדיקה מציע גידול במספר miRNAs ניתח בצלחת אחת. TLDA כרוך בשימוש בברכה מוגדרת מראש של RT-פריימרים המשמשים לסינתזת cDNA. אז cDNAs אלה הסתחררו לתוך 384 גם מיקרו-fluidic כרטיס מותאם אישית כדי לקבוע את הביטוי של miRNAs מרובה באמצעות qPCR 22,26,29. היטב בכל הכרטיס מכיל מיובש פריימרים ובדיקות כדי להגביר מירנה ספציפית (ים), ולכן עד 384 תגובות יכולות להיות מעובד בכרטיס היחיד TLDA 26.

מערך nanofluidics הוא פלטפורמת תפוקה גבוהה המשמשת לזיהוי של תמלילי גן 24. מאמר זה מתמקד במדגים כיצד שיטות אלה לכימות miRNAs בסרום / פלזמה מבוצעות והגורמים הקריטיים שיש לקחת בחשבון בעת ​​ביצוע ופרשנות נתונים כאלה. נלקחו בחשבון, היתרונות האישיים שלהם ואת המגבלות יידונו במאמר זה.

Protocol

RNA סה"כ יכול להיות מבודד מסרום באמצעות פרוטוקול הוקם במעבדה שלנו 30 או באמצעות ערכות זמינות מסחרי אחרות.

הערה: גיליונות אלקטרוניים אינטראקטיביים נוספים לחישוב כמויות תגובה בכל ניסוי (עם 5% הנפח העודף היוו pipetting הכלול) מסופקות.

1. מבוסס Probe בזמן אמת qPCR באמצעות פלטפורמת צלחת 96-היטב רגילה

  1. סינתזת cDNA (שעתוק לאחור) על דגימות RNA בסרום / פלזמה למירנה
    1. לחשב ולהוציא 10 ng של RNA לכל תגובת סינתזת cDNA. מוסיף מים nuclease ללא להביא הנפח הסופי של RNA 10 ng ל1.67 μl (לתגובת 5 μl). שמור על דגימות קרח.
    2. בחר את מירנה ולהפשיר פריימרים RT.
    3. להפשיר את מרכיבי תערובת מגיב RT: RT חוצץ (10X), dNTPs (100 מ"מ), RNase אינהיביטור (20 U / μl). לעולם אל תשמור אנזים מקום (וירוס לוקמיה רקומביננטי מולוני עכברי(RMoMuLV)) (וירוס לוקמיה העכברית מולוני recombinanat (rMoMuLV) transcriptase ההפוך (50 U / μl) על קרח. אחסן אותו ב -20 ° C עד צורך או בבלוק מקפיא.
    4. הכן תערובת מגיב RT על קרח, כמתואר בטבלה 1 א. מומלץ להכין לפחות 5% בנפח עודף כדי לפצות על שגיאת pipetting.
    5. להוסיף 2.33 μl של התמהיל מגיב RT כל לתוך צינור 0.2 מיליליטר PCR / צלחת.
    6. מערבולת צינורות פריימר RT לערבב, אז בקצרה צנטריפוגות ב 10,000 XG במשך 10 שניות. הוסף 1 μl של פריימר RT הספציפי מירנה לצינורות שלהם בהתאמה PCR או צלחת. להוסיף 1.67 μl של RNA המדולל לצינורות שלהם בהתאמה PCR או בארות בצלחת. לבצע את כל תוספות על קרח.
    7. צנטריפוגה צינור התגובה או צלחת ב1,950 XG במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
    8. הגדיר את תכנית סינתזת מירנה cDNA על Cycler התרמית בתנאי ההגדרה הבאה: 16 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות, 42 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, 85 °C דקות 5 ו -4 ° C בהמתנה.
    9. להגדיר נפח תגובה עד 10 μl. טען את צינורות תגובה או צלחת לתוך Cycler תרמית. התחל לרוץ RT. אחסן את תגובות cDNA (RT) ב -20 ° C, אם ההגברה PCR בזמן אמת לא התקדמה באופן מיידי.
  2. בדיקה מבוססת בזמן אמת qPCR לגילוי של miRNAs הבוגר
    1. להפשיר את מבחני שנבחרו מבוסס הבדיקה qPCR (20X) עבור מוצר RT בהתאמה.
    2. מערבבים את הפתרון היחיד תקינות בזמן אמת PCR (תערובת מגיב qPCR) על ידי מתערבל את הבקבוק.
    3. מכין את התערובת מגיב qPCR עבור כל מירנה להיות מנותחת. כדי להכין את qPCR להשיג צינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge סטרילי עבור כל דגימת מירנה ולהוסיף רכיבים לתוך צינור אחד, כמתואר בטבלה 1 ב. מומלץ להכין לפחות 5% בנפח עודף כדי לפצות על שגיאת pipetting.
    4. להוסיף 4.2 μl של התמהיל מגיב qPCR המתאים היטב בכל צלחת אופטית 96-היטב (או צינורות). להוסיף 0.8 μlתגובת cDNA בהתאמה (מסונתז בשלב 1.1 עבור כל miRNAs) ולהתאמה.
    5. חותם את הצלחת עם מכסה אופטי מתאים. צנטריפוגה את הצלחת (או צינורות) ב1,950 XG במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס
    6. הפעל את המחשב, קורא מערך הצלחת / מיקרופלואידיקה 96-היטב ולבסוף להפעיל את התוכנה. ודא שמכונית חיבור תקין ובלוק נכון ומכסה מחומם (לצלחת גם מהירה 96) נמצא במקום.
    7. ניסוי בחר כ96-גם לחסום מהיר (0.1 מיליליטר), עקומה סטנדרטית, ריאגנטים TaqMan ומצב מהיר. הגדרת qPCR על מערכת Real Time PCR באמצעות תנאי אופניים התכנית הבאים: 95 מעלות צלזיוס למשך 20 שניות, 50 מחזורים (95 מעלות צלזיוס למשך 1 שניות, 60 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות).
    8. להגדיר נפח תגובה עד 10 μl. טען את צינור התגובה או צלחת לתוך המכשיר. לחץ על "התחל לרוץ". התכנית תימשך כשעה 1 כדי להשלים.

2. כרטיס מערך מיקרופלואידיקה מבוסס Probe (Card A ו- B)

הערה: מבוסס Probe פנל מירנה מגיע כסט של שני כרטיסים 384 גם microfluidic (כרטיס Array וכרטיס B Array). כל כרטיס מכיל Primers מיובש ובדיקות עד 380 miRNAs ובקרות. מוצר cDNA (עם או בלי טרום הגברה) ספציפי לכרטיס או כרטיס B נטען על גבי המערך המתאים בזמן אמת PCR.

  1. הפוך תמלול (RT)
    1. השתמש בפרוטוקול זה לקלט RNA כולל של 1-1,000 ng. אם הקלט הוא בין 1-350 ng, לבצע צעד מראש הגברה (pre-אמפר). לנתונים לעיל 350 ng, לטעון cDNA ישירות על כרטיסי המערך ללא קדם-מגבר.
      הערה: לפרופיל מירנה סרום, להתחיל עם של רנ"א הכל 100 ng. לפרופיל מירנה מלא, להפעיל שתי בריכות מוגדרות מראש של קבוצות RT-פריימר של תגובות RT (בריכה וברכה ב ') לדגימה.
    2. להפשיר את ריאגנטים הבאים על קרח. RT Primers (10x): בריכה וברכת B, dNTPs עם dTTP (100 מ"מ), RT חוצץ (10x), MgCl 2 (25 מ"מ), RNase אינהיביטור (20 U / ו# 181; יב). אין להחזיק את האנזים (הווירוס לוקמיה העכברית מולוני רקומביננטי (rMoMuLV)) transcriptase ההפוך (50 U / μl) על קרח. לאחסן אותו ב -20 ° C עד צורך.
    3. בעדינות מערבולת את כל חומרים כימיים, למעט האנזים, ואז צנטריפוגות בקצרה את הצינורות על 10,000 XG במשך 10 שניות.
    4. לשלב חומרים כימיים, כפי שמתואר בטבלה 2 א, לשני צינורות; צינור אחד לברכה, אחר לברכה ב 'בכל צינור יכיל בריכה מוגדרת מראש רק אחד מקבוצת פריימר RT, גם מברכה או מB. הבריכה מומלץ להכין לפחות 5% בנפח עודף כדי לפצות על שגיאת pipetting .
    5. היפוך לערבב, וזמן קצר לאחר מכן צנטריפוגות ב 10,000 XG במשך 10 שניות. Aliquot 100 ng של כל דגימת RNA לתוך צינור חדש, ולאחר מכן להוסיף נפח מתאים של מים nuclease חינם כדי להפוך את הסכום כולל של 3 μl.
    6. Aliquot 4.5 μl של התמהיל מגיב RT המתאים לצינורות המתאימים. היפוך לערבב, ואז צנטריפוגות בקצרה על 10,000 XG במשך 10 שניות. דגירה על קרחבמשך 5 דקות.
    7. דגימות מקום לthermocycler ולהתחיל RT באמצעות התנאים הבאים: 40 המחזורים (16 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, 42 מעלות צלזיוס במשך דקות 1, 50 מעלות צלזיוס במשך 1 שניות), 85 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, להחזיק ב 4 ° ג cDNA חנות שנוצר על ידי שימוש במאגר מוגדר מראש אלה של RT-פריימרים ב -15 עד -25 ° C או להשתמש מייד.
  2. טרום הגברה
    1. להפשיר את הבריכה המוגדרת מראש של פריימרים מראש מגבר על קרח. בעדינות פריימרים מערבולת, ואז צנטריפוגות בקצרה אותם ב10,000 XG במשך 10 שניות. תערובת מגיב מערבולת TaqMan קדם המגבר (2X) על ידי הקשה עדינה, לערבב.
    2. לשלב חומרים כימיים, כפי שמתואר בטבלה 2 ב ', לשני צינורות; צינור אחד לברכה, אחר לברכה ב '
      הערה: כפי שתואר לעיל, פריימרים מראש מגבר בריכה ילכו לצינור והברכה B פריימרים צריכים ללכת ל- B צינור מומלץ להכין לפחות 5% בנפח עודף כדי לפצות על שגיאת pipetting.
    3. היפוך לערבב, ואז צנטריפוגות בקצרה על 10,000 XG במשך 10 שניות.Aliquot 22.5 μl של התמהיל מגיב קדם המגבר המתאים לתוך צינורות חדשים. Aliquot 2.5 μl של מדגם cDNA (מוכן בשלב RT) לתוך הצינור בהתאמה.
    4. היפוך לערבב, ואז צנטריפוגות בקצרה על 10,000 XG במשך 10 שניות. דגירה על קרח למשך 5 דקות. דגימות מקום לthermocycler ולהתחיל את המחזור לפני המגבר. תנאי רכיבה על אופניים: 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, 55 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, 72 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, 12 מחזורים (95 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, 60 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות), 99.9 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, להחזיק ב 4 מעלות צלזיוס.
    5. הפוך מראש מוגבר cDNA לערבב, ולאחר מכן צנטריפוגות בקצרה על 10,000 XG במשך 10 שניות. הוסף 75 μl של 0.1x TE הצפת (pH 8.0) cDNA מראש מוגבר (1: 4 דילול). הפוך דגימות מראש מגבר מדוללים לערבב, ואז צנטריפוגות בקצרה על 10,000 XG במשך 10 שניות. חנות דילול מוגברת מראש cDNA ב -15 עד -25 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע, או להשתמש בו מייד.
  3. טעינת כרטיסי מיקרופלואידיקה וביצוע qPCR
    1. שמור מיקרופלואידיקהכרטיסי מירנה מחוץ למחצית שעה לפחות כדי להגיע לטמפרטורת חדר. להפשיר cDNA מוגבר מראש מדולל על קרח ומערבבים על ידי היפוך הצינורות ואחרי ספין קצר. מערבבים תערובת מגיב qPCR על ידי מתערבל את הבקבוק.
    2. בצינור חדש להוסיף 450 μl של תערובת מגיב qPCR עד 9 μl של cDNA מוגבר מראש בדילול מלא. לכרטיס, להשתמש במוצר מראש מוגבר מוכן באמצעות א בריכת פריימר להוסיף 441 μl של מים חופשיים nuclease לפצות את הנפח הסופי עד 900 μl. להפוך את הצינור לערבב, ואז צנטריפוגות בקצרה על 10,000 XG במשך 10 שניות.
    3. הסר את כרטיס TLDA מהאריזה שלו (פעם שהוא מגיע לטמפרטורת חדר) והנח אותו על אזור נקי עם צד רדיד למטה. הוספה של תערובת תגובת PCR 100 μl לכל אחד מ8 יציאות המילוי על הכרטיס. ישנם 2 יציאות בכל אחד מהמאגר (8 מאגרים בסך הכל בכל כרטיס).
      הערה: נמל המילוי הוא החור הגדול שבו את תערובת התגובה הוא הוסיף, ואילו נמל פורקן הוא החור הקטן. לכל אחד יש כרטיס מירנה TLDA 8 מאגרים, כל מוביל ל -48 בארות (24 בארות בעמודה אחת x 2 עמודים), ובכך מעמיס את כל 384 בארות בכרטיס עם אותו תמהיל תגובת PCR. ודא שברכה וברכה ב 'של כל דגימה מועמסים על כרטיסי TLDA בהתאמה. הנח את כרטיס המערך בדליי בעל כרטיס המתמחים מערך מיקרופלואידיקה בצנטריפוגה.
    4. לכרטיסי מערך מיקרופלואידיקה, להשתמש צנטריפוגות מתאימה (כגון Heraeus Multifuge 3SR, צנטריפוגות 230V) ודליים ספציפיים (כגון מחזיקי "כרטיס מערך TaqMan"). כל אחד מהסלים יכולים להכיל עד 3 כרטיסים (עמוסים / ריק). תמיד לוודא שכל 3 החריצים של דלי עסוקים והדלי הוא מאוזנת על ידי הצבת דלי דומה (הדלי הזה צריך להכיל גם 3 כרטיסים, ריקים או מלאים) בחריץ השני של צנטריפוגות. תוך שימת הכרטיס בבעל הדלי, לוודא כי המאגרים 8 להקרין כלפי מעלה ובארות תגובת הפנים לקיר החיצוני של צנטריפוגות.
      1. ספין הכרטיסים ב331 XG 1 דקות בטמפרטורת חדר. לאחרראשון ספין, לפתוח את צנטריפוגות וחזותית להבטיח את תערובת התגובה כבר חילקה באמצעות 384 הבארות. חזור על הספין באותן הגדרות עבור 1 יותר זמן. הסר את הכרטיס מהדלי ולהבטיח כי רמת תערובת תגובה בכל אחד מהמאגרים 8 היא אחידה. כל חוסר עקביות בנפחי הנוזל שנותרו במאגרים להפוך את הכרטיס לשימוש בלתי הולם נוסף.
    5. כרטיסי מערך מיקרופלואידיקה צריכים אוטם מיוחד שיש לו הרכבה חרט דיוק (מרכבה) כדי לאטום את ערוצי הפצת הנוזל של המערך ולא פחות להפיץ את תערובת תגובה בכל הבארות (סה"כ μl נפח תגובת 1 / טוב).
    6. להביא את העגלה למצב ההתחלתי ולהכניס את הכרטיס נטען לאוטם בצד נייר כסף ועמד בתור כדי סיכות חרט על אוטם. בשבץ אחיד איטי, יציב ובודד, לדחוף את העגלה על פני הכרטיס עד שהוא מגיע לנקודת הסיום של אוטם. הסר את כרטיס המערך האטום ולאחר מכן לנתק את המאגרים מהכרטיס באמצעות מספריים.
    7. ודא שמוביל בלוק הנכון, המכסה ומדגם מחוממים מותקן בזמן אמת מערך מיקרופלואידיקה מערכת PCR / מכונה.
    8. הפעל את המחשב, ולאחר מכן מערכת מערך מיקרופלואידיקה ולבסוף להפעיל את התוכנה. ודא שמכונה מחוברים כהלכה. ניסוי בחר ככרטיס מערך, עקומה סטנדרטית, ריאגנטים TaqMan ומצב רגיל. לייבא את קבצי התקנה לאחת מהכרטיס וכרטיס B. שמור את הקובץ.
    9. הנח את הכרטיס החתום במגש המכשיר עם A1 גם בפינה השמאלית העליונה וברקוד לכיוון החלק הקדמי של המכשיר. לחץ על "התחל הפעלה". התכנית תימשך כשעה 2 כדי להשלים.

לוח Nanofluidics מירנה האדם מבוסס Probe 3.

  1. הפוך תמלול (RT)
    1. השתמש בפרוטוקול זה לקלט RNA כולל של 50-200 ng, אולם 100 ng הוא אופטימלי עבור רוב הדגימות. לפרופיל מירנה מלא, להפעיל שתי predefiבריכות נד של ערכות RT-פריימר של תגובות RT (בריכה וברכה ב ') לדגימה.
    2. להפשיר את ריאגנטים על קרח: בריכה מוגדרת מראש של קבוצות RT פריימר (10X), dNTPs עם dTTP (100 מ"מ), RT חוצץ (10x), MgCl 2, (25 מ"מ), RNase אינהיביטור (20 U / μl). אין להחזיק את האנזים (וירוס לוקמיה העכברית מולוני רקומביננטי (rMoMuLV) transcriptase ההפוך (50 U / μl) על קרח. אחסן אותו ב -20 ° C עד צורך. בעדינות מערבולת את כל חומרים כימיים, למעט האנזים, ובקצרה צנטריפוגות ב10,000 XG במשך 10 שניות.
    3. לשלב חומרים כימיים, כמתואר בטבלה 3 א, לשני צינורות; צינור אחד לברכה, אחר לברכה ב 'בכל צינור יכיל בריכה מוגדרת מראש רק אחד מקבוצת RT-פריימר, או מברכה או מB. הבריכה מומלץ להכין לפחות 5% בנפח עודף כדי לפצות על pipetting שגיאה.
    4. פיפטה לערבב ולאחר מכן בקצרה צנטריפוגות ב 10,000 XG במשך 10 שניות. Aliquot 100 ng של כל דגימת RNA לתוך צינור חדש, ולאחר מכן להוסיף נפח מתאיםמים nuclease ללא לעשות כולל של 3 μl. Aliquot 4.5 μl של התמהיל מגיב RT המתאים לתוך הצינור בהתאמה.
    5. היפוך לערבב, ואז צנטריפוגות בקצרה על 10,000 XG במשך 10 שניות. דגירה על קרח למשך 5 דקות. דגימות מקום לthermocycler ולהפעיל את תכנית RT. תנאי רכיבה על אופניים: 40 מחזורים (16 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, 42 מעלות צלזיוס במשך דקות 1, 50 מעלות צלזיוס במשך 1 שניות), 85 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, להחזיק ב 4 מעלות צלזיוס. cDNA חנות שנוצר באמצעות בריכה המוגדרת מראש אלה של RT-פריימר להגדיר ב -15 עד -25 ° C או להשתמש מייד.
  2. טרום הגברה (pre-אמפר)
    1. להפשיר את הבריכה המוגדרת מראש של פריימר מראש המגבר להגדיר על קרח. בעדינות פריימרים מערבולת, אז צנטריפוגות בקצרה אותם ב10,000 XG במשך 10 שניות. תערובת מגיב מערבולת TaqMan קדם המגבר (2X) לערבב.
    2. לשלב חומרים כימיים, כמתואר בטבלה 3 ב, לשני צינורות; צינור אחד לברכה, אחר לברכה ב 'בכל צינור יכיל בריכה מוגדרת מראש רק אחד מסטי RT-פריימר, או frאום בריכה או מהברכה B. מומלץ להכין לפחות 5% בנפח עודף כדי לפצות על pipetting שגיאה.
    3. פיפטה לערבב, ואז בקצרה צנטריפוגות על 10,000 XG במשך 10 שניות. Aliquot 22.5 μl של התמהיל מגיב קדם המגבר המתאים לתוך צינורות חדשים. Aliquot 2.5 μl של מדגם cDNA לתוך הצינור בהתאמה. היפוך לערבב, ואז צנטריפוגות בקצרה את הצינורות על 10,000 XG במשך 10 שניות. דגירה על קרח למשך 5 דקות.
    4. דגימות מקום לthermocycler ולהפעיל את הקדם-המגבר. להגדיר נפח תגובה ל -25 μl. תנאי רכיבה על אופניים: 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, 55 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, 72 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, 12 מחזורים (95 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, 60 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות), 99.9 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, להחזיק ב 4 מעלות צלזיוס.
    5. הפוך מראש מוגבר cDNA לערבב, ולאחר מכן צנטריפוגות בקצרה על 10,000 XG במשך 10 שניות. בצינורות חדשים להוסיף 4 μl של cDNA הגברה מראש 156 μl של 0.1x TE מאגר pH (דילול 01:40) 8.0. הפוך דגימות מדוללים מראש מגבר לערבב, ולאחר מכן ce בקצרהntrifuge ב10,000 XG במשך 10 שניות. חנות מדוללת וcDNA מוגבר מראש חי ב -15 עד -25 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע, או להשתמש באופן מיידי.
  3. טעינת מערכי Nanofluidics וביצוע qPCR
    1. הורד את קובץ הצלחת הרלוונטי (.tpf) מאתר האינטרנט של 31 באמצעות המספר הסידורי שקופית מערך nanofluidics. זה מכיל מידע לרוץ לשקופית מערך nanofluidics הספציפית.
    2. תמהיל הפשרה מדולל מוגבר מראש cDNA וTaqMan בזמן אמת qPCR מגיב (אם שימוש בפעם הראשונה) על קרח. מערבבים תערובת מגיב qPCR על ידי מתערבל את הבקבוק. בצינורות חדשים להוסיף 22.5 μl של תערובת מגיב qPCR 22.5 μl של cDNA מוגבר מראש המדולל. בעדינות מערבולת לערבב, ואז צנטריפוגות בקצרה על 10,000 XG במשך 10 שניות.
    3. Aliquot 5 μl של כל דגימה לתוך בארות 8 (2 עמודות, 4 שורות) של צלחת מדגם 384 גם העבודה מערך nanofluidics. ודא שברכה וברכה ב 'של כל דגימה הם בלוקים 8 היטב סמוכים (ראה figure 1 או משלימים גיליון Excel לפריסה).
      1. כל צלחת מדגם יכולה להכיל עד שמונה מגלשות בשווי של דגימות. עם זאת, המערכת למערך nanofluidics יכולה לעבד רק 4 מערכי nanofluidics בטווח אחת. אם יותר מארבעה שקופיות בשווי של דגימות הן להיות טעונות על צלחת מדגם אחד, ודא הסעיפים שנותרו חתומים. חותם עם אוטם צלחת מדגם OpenArray.
        הערה: לחתוך מראש מומלץ אוטם לחלקים הנדרשים, כך החלקים עשויים להיות אטום / חתומים בנפרד כדי להפחית את האידוי. לחלופין, הצלחת עשויה להיות אטומה עם אוטם ללא פגע, ולאחר מכן חלקים ניתן לגזור באופן אינדיבידואלי בעת טעינה.
    4. צלחת צנטריפוגות ב 490 XG דקות 1 ב 4 מעלות צלזיוס. טען את שקופיות מערך nanofluidics בתוך שעה 1. בשל הזמן המוגבל אפשר לאטום את השקופיות, בבקשה רק לטעון שקופית אחת בכל פעם. הסר את שקופית מערך nanofluidics מהמקפיא ולאפשר להם להגיע לטמפ 'החדרerature (~ 15 דקות).
    5. ודא שמוביל בלוק הנכון, המכסה ומדגם מחוממים מותקן במערכת מערך nanofluidics. הפעל את מערכת טעינת מערכת PCR בזמן אמת למחשב, ו. גש לתוכנה המתאימה ולהבטיח כי המכונות מחוברות. הסר את חומרים מתכלים מערכת טעינה (מיכסה שקופיות Array, תקע וטבילת נוזל) מהאריזה.
    6. משכו בעדינות את הבוכנה של מזרק טבילת הנוזל כדי לשחרר. הסר את המכסה, למקם את הקצה ובאוויר סומק מהקצה. הנח את הטיפים מערכת טעינה בתוך המכונה ולהסיר את המכסה. מניחים צלחת מדגם בתוך מערכת PCR.
    7. שים כפפות ב. לוודא שהם בחוזקה מתאימות כדי למזער את הסיכון של סימון המכסה השקופיות בטעות. אריזת שקופיות בזהירות פתוחה. לאט להטות שקופית לתוך יד. אל תיגע בחלק העליון של השקופיות.
    8. הנח שקופיות למערכת PCR, עם ברקוד בצד השמאל. הסר אוטם מהחלק מצלחת המדגם המיועד לטעינה. השתמש במערכת הטעינהתוכנה להיכנס לרקוד השקופית, להחליק עמדה, עמדת מדגם ותצורת קצה.
    9. כאשר כל הבדיקות הרלוונטיות הושלמו, שקופיות עומס עיתונות. בעוד מערכת PCR טוענת שקופיות, להסיר את הפלסטיק השקוף ואדום מהחלק התחתון של המכסה השקופיות. בסיום טעינה, להסיר בזהירות ולאטום את השקופיות בתוך 90 שניות.
      1. מניחים את השקף במהדק הצלחת. מניחים את המכסה השקופית לשקופית. הצמד למשך 30 שניות. להבטיח את המכסה מוקם כך ברקוד שמוצג כראוי. הסר את המכלול ממהדק הצלחת.
      2. מזרק נוזל טבילת עמדה בשקף כך הקצה לוחץ על המכסה. לאט לאט למלא שקופיות עם טבילת נוזל, כדי להבטיח את ריצות נוזל לאורך המכסה. ברגע מלא, לאטום את השקופיות עם התקע, סיבוב הבורג עד הידית משתתקת.
      3. הסר את כיסוי הפלסטיק בחלק העליון של מכסה השקופיות, ולאחר מכן למקם בזהירות לתוך מנשא השקופיות של מערכת PCR בזמן אמת. ודא שיש support על החלק התחתון של השקופית בזמן שהוא הוריד, כך שהוא לא שחרר פתאום, ולא נוגע בחלק העליון של השקופיות. זה בסדר לגעת בצדדים של המערכת / cassette.Initialize PCR שקופיות ולהפעיל את התכנית לqPCR בתוך שעה 1.
    10. בחר באפשרות "OpenArray" בתוך תוכנת PCR-המערכת. לחץ על "מצא את תעודות זהות של שקופיות". זה ייקח כמה דקות. אם התוכנה לא יכולה למצוא את הזהות של הצלחת, הוא יבקש את זה כדי להיות מוזן באופן ידני.
    11. לחץ על "אישור מרכזי פלייט". שוב, זה ייקח כמה דקות. בדוק שהנקודה האדומה נמצאת במרכז ושאין טביעות אצבעות / סימנים על גבי השקופית. טען את קובץ .tpf המתאים לכל שקופית ולציין שם קובץ תוצאה ומיקום. לחץ על "התחל הפעלה". התכנית תימשך כשעה 2 כדי להשלים.

Representative Results

הנפח המומלץ לתגובת qPCR מבוססת assay הבדיקה מירנה הוא 20 μl. הערה: יש לנו אישר כי עוצמת תגובה של 5 μl היא מסוגלת לייצר תוצאות דומות לאלה שהושגו באמצעות 4,7,30 נפח 20 μl. הפחתת נפח התגובה ל5 μl מאפשרת לירידה של 75% בעלויות מגיב ללא הפסד ניכר ברגישות. כפי שהוצגו באיור 2, כרכי תגובה של 20 μl ו -5 μl להראות שיתוף ביחס חזק עד 39 מחזורים (עם r 2 של 0.92, p = 0.0002).

מערך מיקרופלואידיקה מספק כלי לקבלת נתונים על 754 miRNAs בא לידי ביטוי במדגם בסביבות 5 שעות (לכרטיס והכרטיס B), שהיא דרך יעילה יותר של ניתוח דגימות מרובות בהשוואה ל -96 PCRs צלחת גם הקונבנציונלי. אנחנו לעומת כרטיסי מירנה מערך מיקרופלואידיקה עבור אותו המדגם (לדוגמא ודוגמה חוזרת) איור 3 א -. B מציג עלילה בלנד-אלטמן (<strong> 3 א) ועלילת מתאם (3B) לכל 754 miRNAs נבדק דגימות אלה. ישנם 3 miRNAs שונה שליטה (U6, RNU44 וRNU48) ממוקם באופן אקראי בשני כרטיסים (Card ו- B) במקומות רבים. כאשר סף מחזור U6 ערכים (CT) הם בהשוואה בין 2 הריצות, אנחנו לא רואים הבדלים משמעותיים בין הערכים (לוח 4). כמו כן, חשוב לציין כאן שU6 מתבטא בשפע גדול יותר (ערך נמוך Ct) במדגם העריך. לאחר מכן, אנו לעומת כל miRNAs שיש לי ערכי ה- CT בין 0-19.99 בשתי הריצות (n = 150), שהיה לי ביטוי דומה של miRNAs כולל עם שיתוף יעיל של נחישות של 98% (איור 3 ג-ד). מכל 277 miRNAs שיש לי ערכי ה- CT בין 20 ל 29.99 בשתי הריצות, 16 מירס היה שונה משמעותי בין הריצות המקוריות וחזור (איור 3E - F) מספר miRNAs עם הבדל משמעותי betwee.n הריצות מוגברות (89 של 327), כאשר ערכי ה- CT נבחרו בין 30-40 עבור שני הריצות (איור 3G - H).

פלטפורמת מערך nanofluidics מספקת נתונים לmiRNAs 754 מכל מדגם בסרום / פלזמה נבדק, כפי שהוא מיוצג באיור 4 א זה חשוב לבחון עקומות הגברה אלה -. כפי שהוא עם כל qPCR - כדי להבטיח שהתוצאה מעידה על הגברה נכונה. כל אחד מsubarrays 48 (איור 1) מכיל גם assay לשלוש ncRNAs הפופולרי ביותר "משק הבית":. U6, RNU44 וRNU48 איור 4 ממחיש אשכולות טיפוסיים של U6 משכפל ממדגם יחיד. משכפל אלה להציג סטייה נמוכה סטנדרטית (SD <0.5) וכך גם מדד לאמינות. לחלופין, איור 4C מדגים את השונות מוגברות של משכפל U6 (SD> 0.5) במדגם שני. זה אינו שולל את תוקף of מבחני שנותרו, על אף שהוא עושה מחייב ביקורת מעמיקה יותר. U6, כמו עם רוב miRNAs "משק הבית" בנוזלים ביולוגיים, יכול להיות ביטוי משתנה. יש לציין כי אחת דוגמאות, שמתוארים באיור 4C, מציג פי 4 פחות תוכן U6 מכפי שהוצגו באיור 4. מאחר והרמה של U6 במדגם מוצג ב4C היא 75% פחות מלכתחילה מזו שהוצגה ב4B פנל, השתנות טכנית יותר צפויה בשל התפלגות פואסון של תמלילים, שהוחמרה על ידי קטן נפח תגובת 17.

כלי שימושי נוסף הוא תמונות בקרת איכות (QC), זמינות ליצוא ברגע שהשלימה הריצה. בחירה של אלה משתמשת בקרינה של רוקס, הצבע הפסיבי נמצא בתמהיל מגיב qPCR, כדי לוודא שכל-חור נטען (איור 5) בצורה נכונה. דרך חור, או אכן en subarray הצמיג, עשוי שלא להיטען בשל מספיק נפח דגימה, אידוי, בועות הנוכחיות בבארות של צלחת מדגם 384 גם, אי להסיר לחלוטין את חותם צלחת מדגם, או פגמים במערכת Accufill או העצות שלה. כל נפרקו דרך החורים חייבים להיות מזוהים, כדי למנוע miRNAs תיוג כ" בלתי ניתן לגילוי ", כאשר במציאות assay לא נטען מעולם. אם בעיה זו היא נתקלה, מאשר כי לפחות 5 μl של המדגם / mastermix הוא נטען לתוך היטב בכל צלחת מדגם 384-היטב, צלחת מדגם centrifuged כראוי לפני הטעינה, חותם נייר נמחק לחלוטין, וOpenArray הטעון השקופית אטומה ולהפעיל בתוך הזמן המוקצב לכל ריצות הרצופות. אם ייתקל בבעיות טעינה עדיין נמשכות, אלה עשויים להיות סביר יותר הנוגעים ליצוו ספציפיים או הרבה מערכים או מתכלה קשורים וסיוע נוסף יש לחפש דרך היצרן.

"Src =" / קבצים / ftp_upload / 52,586 / /> 52586fig1.jpg "
איור 1: פריסה של דגימות לעבודת מערך Nanofluidics: (א) כל צלחת מדגם 384 גם יכול להחזיק דגימות עד 8 ​​מערכי nanofluidics. (ב) בדילול מלא, cDNA הגברה מראש ממוקם לתוך 8 בארות (2 עמודות על ידי 4 שורות), עם בריכה וברכה ב 'בקבוצות 8 היטב סמוכות. כל עיגול מייצג גם אחד. היטב בכל צלחת המדגם (C) יהיה טעון לsubarray אחד של מערך nanofluidics. כל ריבוע קטן מייצג subarray אחד.

איור 2
איור 2: ניתוח Co-ביחס למשך 96 היטב פלטפורמות קונבנציונליות PCR: Co-יחס בין 20 μl ו -5 כרכי תגובת μl על TaqMan בזמן אמת qPCR באמצעות פלטפורמת צלחת 96-היטב סטנדרטית בערכי CT (39 מחזורים). אנחנו לעומת 4 מיקרו-רנ"א שונה (miR-375, miR-30c, miR-30D וmiR-7) ב 4 דגימות סרום ופלזמה אנושיות שונות. רק 11 נקודות נתונים הם זממו מאז אחרים היו בלתי ניתנות לגילוי. R 2 = 0.92, p = 0.0002.

איור 3
. איור 3: מחזור פרופיל מירנה באמצעות כרטיסי מערך מיקרופלואידיקה שימוש 2 כרטיסי מיקרופלואידיקה (כרטיס וכרטיס-B), פרופיל של 754 miRNAs נוצר (- B). כפי שניתן לראות כאן, השתמשנו מדגם זהה עבור 2 מערך מיקרופלואידיקה פועל כדי לבדוק שחזור של תוצאות כרטיס מיקרופלואידיקה. אנו הבחנו ביטוי דומה של miRNAs כולל, עם ערכי ה- CT בין 0-19.99 (C - D). יש מעט miRNAs (16 277) עם ערכי ה- CT בין 20-29.99 ומשמעותי הבדלים בין ריצות החוזרות (E - F). שמונים ותשע של 327מיקרו-רנ"א עם ערכי ה- CT גבוהים יותר (30-40) הציג הבדלים משמעותיים בין שני הריצות (G - H).   הנתונים נותחו באמצעות מבחן T לזווג. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4: פרופיל נציג של Curves PCR מוצרי ההגברה: האם דמות מייצגת של עקומות הגברה () בשילוב של כל מטרות מירנה למדגם פלזמה אנושי. Assay לU6 (שליטה משותפת ncRNA) ממוקם בכל subarray. המדגם ב( B) מדגים שונות נמוכות (SD <0.5) ואילו (C) מראה סטיית תקן גבוהה (SD> 0.5) בתוך U6 משכפל. שני הדוגמות טוטהRNA l מבודד מפלזמה אנושית. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5: ניתוח QC של מערכי Nanofluidics: בקרת איכות תמונות (QC) של מערך נטען כראוי nanofluidics (משמאל) ומערך nanofluidics נטען באופן שגוי (מימין). הצבע הפסיבי, רוקס (הנוכחי בתמהיל מגיב qPCR), מאיר כדי לציין-חור נטען כראוי. יש המערך מהימין כמה subarrays / דרך חורים שאינם עמוסים בתערובת מגיב qPCR ואלה צריכים להיות מזוהים כPCR תגובות שליליות-שגויות.

רכיבים נפח לכל 5 תגובת μl (μl) מאגר RT (10x) 0.5
dNTPs (100 מ"מ) 0.05
RNase מעכב 0.6
nuclease ללא מים 1.39
Transcriptase הפוך 0.33
נפח כולל 2.33

לוח 1 א: מרכיבי תערובת מגיב RT ב5 μl הכנת תגובת RT בזמן אמת TaqMan qPCR באמצעות פלטפורמת צלחת 96-היטב סטנדרטית.

רכיבים נפח לכל 5 תגובת μl (μl) נפח לכל 20 תגובת μl (μl)
mastermix המהיר PCR (2x) 2.5 10
assay TaqMan qPCR (20x) * 0.25 1
Nuclease ללאמים 1.45 5.8
נפח כולל: 4.2 16.8

* רכיב assay המבוסס על מירנה נבחרה נבדקה.

1B שולחן: רכיבי תערובת מגיב qPCR ב5 או 20 μl הכנת תגובת qPCR בזמן אמת TaqMan qPCR באמצעות פלטפורמת צלחת 96-היטב סטנדרטית.

רכיבים נפח לכל תגובה (μl)
Primers Megaplex RT (10x) 0.8
dNTPs עם dTTp (100 מ"מ) 0.2
Multiscribe ההפוך transcriptase (50 U / μl) 1.5
10X RT מאגר 0.8
MgCl 2 (25 מ"מ) 0.9
RNase מונעי & # 160; (20 U / μl) 0.1
Nuclease ללא מים 0.2
סה"כ 4.5

לוח 2 א: מרכיבי תערובת מגיב RT ב5 μl הכנת תגובת RT לפנל TLDA מירנה.

רכיבים נפח לכל תגובה (μl)
TaqMan קדם המגבר mastermix (2x) 12.5
Primers Megaplex קדם המגבר (10x) 2.5
nuclease ללא מים 7.5
סה"כ 22.5

שולחן 2B: רכיבי תערובת מגיב קדם מגבר בהכנת תגובת 25 μl מראש amplication לפנל TLDA מירנה.

"Cellspacing =" 0 "> רכיבים נפח לכל תגובה (μl) Primers Megaplex RT (10x) 0.75 dNTPs עם dTTp (100 מ"מ) 0.15 Multiscribe ההפוך transcriptase (50 U / μl) 1.5 10X RT מאגר 0.75 MgCl 2 (25 מ"מ) 0.9 RNase אינהיביטור (20 U / μl) 0.09 Nuclease ללא מים 0.35 סה"כ 4.5

לוח 3 א: מרכיבי תערובת מגיב RT ב5 μl הכנת תגובת RT לפנל מירנה nanofluidics מבוסס בדיקה.

רכיבs נפח לכל תגובה (μl)
TaqMan קדם המגבר mastermix (2x) 12.5
Primers Megaplex קדם המגבר (10x) 2.5
nuclease ללא מים 7.5
סה"כ 22.5

שולחן 3B:. מרכיבי תערובת מגיב קדם מגבר בהכנת תגובת 25 μl מראש amplication לפנל מירנה nanofluidics מבוסס בדיקה הערה: המשלים האינטראקטיבי להצטיין גיליונות אלקטרוניים הניתנים לשלוש פלטפורמות, כבר מהווה תוספת של 5% כדי לפצות על pipetting שגיאה.

לדוגמא לדוגמא חוזרת
15.535 16.156
15.471 15.652
15.623 16.063
15.963 15.889
14.006 13.993
14.502 14.623
14.907 14.384
13.732 14.946

לוח 4: מחזור פרופיל U6 מירנה באמצעות כרטיס מערך מיקרופלואידיקה. שימוש בשני כרטיסי מערך מיקרופלואידיקה (A ו- B). CT-ערכים של מירנה שליטת U6 מדוגמה (סה"כ = 8). שפע מירנה שליטת U6 עקבי נצפה בין הריצות.

Discussion

השלבים הקריטיים בפרוטוקולי qPCR מבוסס הבדיקה כדי לקבל תוצאות מדויקות ושחזור הם לעשות 1 בטוח) את אותו הנפח והריכוז של RT-מוצר טעון בכל תגובת qPCR, 2) היחסים ונפחים הנכונים של הרכיבים דרושים ל תגובת qPCR מוכנה ומעורבת היטב, 3) הכרכים הנכונים ועקביים מתווספים לכל תגובת qPCR, ו -4) העריכה ולטעינה של כל דגימה ותגובת תמהיל הושלמה בזמן הקצר ביותר אפשרי, ועדיין מודעים ל השלבים הקריטיים מעל שהוזכרו קודם לכן.

כרטיסי מערך מיקרופלואידיקה צריכים צנטריפוגות המתאימה ודליים ספציפיים. כל אחד מהסלים יכולים להכיל עד 3 כרטיסים (עמוסים / ריק). תמיד לוודא שכל 3 החריצים של דלי עסוקים והדלי הוא מאוזנת על ידי הצבת דלי דומה (הדלי הזה צריך להכיל גם 3 כרטיסים, ריקים או מלאים) בחריץ השני של צנטריפוגות. תוך שימת הכרטיס בbuckeבעל t, לוודא כי המאגרים 8 להקרין כלפי מעלה ובארות תגובת הפנים לקיר החיצוני של צנטריפוגות. ספין הכרטיסים ב331 XG 1 דקות בטמפרטורת חדר. אחרי הספין ראשון, לפתוח את צנטריפוגות וחזותית להבטיח את תערובת התגובה כבר חילקה באמצעות 384 הבארות. חזור על הספין באותן הגדרות עבור 1 יותר זמן. הסר את הכרטיס מהדלי ולהבטיח כי רמת תערובת תגובה בכל אחד מהמאגרים 8 היא אחידה. כל חוסר עקביות בנפחי הנוזל שנותרו במאגרים להפוך את הכרטיס לשימוש בלתי הולם נוסף.

כדי לקבל את אותו הריכוז של RT-המוצר, אותו ריכוז קלט של רנ"א הוסיף לכל תגובת RT. סך הכל ריכוז RNA נמדד באמצעות מיקרו-volumespectrophotometer. היחס נצפה 260/280 יכול להיות נמוך כמו 1.3 לRNA מבודד מפלזמה / סרום; זה לא נראה שיש להם השפעה על תהליך הקשור לqPCR במורד הזרם או נתונים שנוצרו 30. כמו כן, יחס 260/280 שלדגימות RNA נבדקו במסמך זה היו בין 1.3-1.7 ללא תופעות חריגות בqPCR נצפו.

בעת שימוש בדגימות נמוכות RNA תוכן, כמו אלה מbiofluids, זה עלול להיות קשה לכמת RNA לפני העיבוד. אנו ממליצים על השימוש בספייק-בסינטטי בבידוד RNA, כמו גם את שלבי שעתוק לאחור. מניסיוננו, מועמדי ארבידופסיס thaliana מירנה (ATH-miR-159a וATH-miR-172a) עדיפים על miRNAs elegans Caenorhabditis (כגון cel-miR-39 או cel-miR-54), אשר בניסיון שלנו עשוי להיות גבוה יותר הומולוגיה מאלה מא thaliana. השימוש בספייק-בשלב ספציפי כזה יכול להסביר את הנורמליזציה של נתונים מירנה פני דגימות מרובות assayed בזמנים שונים. שימוש קבוע קלט נפח של RNA לתגובת סינתזת cDNA מומלץ גם 32,33.

שלושה הפרוטוקולים מבוססים-הבדיקה לכימות מירנה שתוארו כאן דורשים כמויות משתנותשל קלט RNA הכולל, זרימות עבודה ועלויות שונות. כל אחד מתהליכי העבודה נועד לספק תפוקה שונה המבוססת על מספר מטרות מירנה ומספר הדגימות להיות מנותחים. עם הגדלת תפוקה (96 rxn rxn 3072 384 rxn), העלות לכל תגובה יורדת עם עלייה בכמות של נתונים המתקבלים על יחידת זמן. מאז כל פלטפורמות אלה לנצל כימיה TaqMan, ניתן לצפות באיכות של נתונים המתקבלים להיות דומה. TaqMan qPCR הוא שיטה מבוססת היטב לזיהוי השפע של miRNAs בדגימות סרום / פלזמה 9,11,27. למרות ששלוש הפלטפורמות שנדונו כאן חולקות את אותה הכימיה, ירידה בנפח התגובה מובילה לירידה בטווח דינמי של גילוי תמליל (פאר RJ et al., נתונים שלא פורסמו). פלטפורמת qPCR 96-גם היא תפוקה נמוכה יותר, אבל פלטפורמת רגישות גבוהה ולדעתנו, "תקן הזהב" לכל פלטפורמות PCR (או דיי מבוסס) המבוסס על הבדיקה. עם זאת, ייתכן שזהלא תהיה הפלטפורמה החסכונית או יעילה ביותר אם כמה מאה או אלפי דגימות שמתבצעת assayed ולמייקרו-רנ"א מרובה. מיקרופלואידיקה (TLDA) וnanofluidics פלטפורמות (OA) הן פלטפורמות תפוקה גבוהה / תוכן שנועדו לאפשר רכישה של נתונים גדולים יותר בזמן קצר יותר. למרות הבדלים אצווה נצפו בכרטיסי TLDA, זה יכול להיות ממוזער על ידי בקשת כרטיסי TLDA מאותה אצווה. אנו צופים כי פלטפורמת TLDA (איור 3) הראתה וריאציה משמעותית בכ -17% מאמצע - miRNAs שפע נמוך כאשר נבדק באמצעות המדגם זהה בקבוצות שונות של כרטיסי TLDA. לפיכך, אנו ממליצים על שימוש באותו מספרים אצווה לניתוח באמצעות כרטיסי TLDA. גם וריאציה זו יכולה להיות בגלל ההשתנות הטכניות לרבות כל שגיאות טעינה וpipetting פוטנציאליות. עם זאת, אנו ממליצים הזמנה / מבקש את אותו אצווה של כרטיסי TLDA. אין וריאציה אצווה משמעותית נצפתה על פלטפורמת OA. למרות זאת, TaqMan experimen מבוססטל qPCR גישות הצעת קלות למדוד את השפע של miRNAs בדגימות פלזמה / סרום. גישות התפוקה נמוכה, בינוניות וגבוהות שנדונו כאן מציעות את הגמישות כדי לנתח מגוון של דוגמאות וmiRNAs באמצעות כימיה יעילה ביותר, לשחזור ונקיה (רעש רקע נמוך).

Disclosures

עלויות עיבוד / פרסום מאמר היו מכוסות על ידי Life Technologies, הבא קבלה של כתב היד הזה לפרסום.

Acknowledgments

כל המחברים מודים תמיכת התשתית מNHMRC CTC, אוניברסיטת סידני, קרן המחקר לסוכרת נעורים (JDRF), אוסטרליה וקרן קופר רבקה, אוסטרליה. מחקר זה מומן באמצעות מענקים מהמועצה האוסטרלית למחקר (FT110100254) וJDRF, אוסטרליה (CRN201314) לאהה WW, RJF וMVJ ביצע את כל הניסויים המעבדה הרטובים, ASJ ביצע ניתוח נתונים. WW כתב את הטיוטה הראשונה. אהה מתוכנן המחקר וניתח את הנתונים. כל המחברים לקרוא והסכימו על הנוסח הסופי של כתב היד, דמויות וגיליונות העבודה שהוגשו לפרסום.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96 well-platform
For Reverse transcription
TaqMan MicroRNA Assays INV SM  Applied Biosystems
 
4427975 https://www.lifetechnologies.com/au/en/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-pcr-assays/mirna-ncrna-taqman-assays/single-tube-mirna-taqman-assays.html?ICID=search-4427975
The assays comes as a pack of RT primers and PCR primer.
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit Applied Biosystems
 
4366597 or 4366596 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366597?ICID=search-4366597 or http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366596?ICID=search-4366596
The TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit is the same kit used for reverse transcription in all the threeTaqMan platform- 96-well platform, TLDA and OpenArray.
For qPCR run on a 96-well platform
2x TaqMan Fast Universal PCR Master Mix, no AmpErase UNG  Applied Biosystems
 
4367846 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4367846?ICID=search-4367846
The 2X TaqMan Fast Universal PCR Master Mix is used for qPCR on  the two TaqMan platforms-96-well platform and TLDA.
MicroAmp Optical Adhesive Film Applied Biosystems 4311971 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4311971?ICID=search-product
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 ml  Applied Biosystems 4346907 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4346907?ICID=search-product
Microfluidics platform (TLDA)
For Reverse transcription
Refer to 96-well platform TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit kit (4366597 or 4366596) (as shown above).
Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1 Applied Biosystems
 
4399966 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399966?ICID=search-4399966
The Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1 is used for RT on  the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.
Megaplex RT Primers, Human Pool B v3.0 Applied Biosystems
 
4444281 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444281?ICID=search-4444281
The Megaplex RT Primers, Human Pool B v3.0 is used for RT on  the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.
OR OR
Megaplex Primer Pools, Human Pools Set v3.0 Applied Biosystems
 
4444750 http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444750?ICID=search-4444750
The Megaplex Primer Pools, Human Pools Set v3.0 is used for RT on  the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.
For Pre-amplification
TaqMan PreAmp Master Mix Applied Biosystems
 
4391128 or 4488593 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4391128?ICID=search-4391128 or http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4488593
The TaqMan PreAmp Master Mix is used for pre-amplification of qPCR on  the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.
Megaplex PreAmp Primers, Human Pool B v3.0  Applied Biosystems
 
4444303 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444303?ICID=search-4444303
The Megaplex PreAmp Primers, Human Pool B v3.0 is used for pre-amplification of qPCR on  the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.
Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1 Applied Biosystems
 
4399233 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399233?ICID=search-4399233
The Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1 is used for pre-amplification of qPCR on  the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.
1x TE Buffer (100 ml) Invitrogen 12090-015 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/12090015?ICID=search-product
The 1x TE Buffer is used for pre-amplification of qPCR on  the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.
To load and run the 384 well microfluidics (TLDA) card
TaqMan Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0  Applied Biosystems 4444913 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444913
Nanofluidics platform (OpenArray)
For Reverse transcription
Refer to 96-well platform TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit kit (4366597 or 4366596) (as shown above).
For Pre-amplification
Refer to TLDA pre-amplification reagents (as shown above)
To load and run the slides
TaqMan OpenArray Human MicroRNA Panel, QuantStudio 12K Flex (1 panel) Applied Biosystems
 
4470187 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4470187?ICID=search-4470187
QuantStudio 12K Flex OpenArray Accessories Kit  Applied Biosystems
 
4469576 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4469576?ICID=search-4469576
OpenArray 384-well Sample Plates   Applied Biosystems
 
4406947 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4406947?ICID=search-4406947
TaqMan OpenArray Real-Time PCR Master Mix Applied Biosystems
 
4462159 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4462159?ICID=search-4462159
OpenArray AccuFill System Tips  Applied Biosystems
 
4457246 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4457246?ICID=search-4457246
Others
Nuclease-Free Water Qiagen 129117 http://www.qiagen.com/products/catalog/lab-essentials-and-accessories/nuclease-free-water

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ambros, V. The functions of animal microRNAs. Nature. 431, 350-355 (2004).
  2. Alvarez-Garcia, I., Miska, E. A. MicroRNA functions in animal development and human disease. Development. 132, 4653-4662 (2005).
  3. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-297 (2004).
  4. Joglekar, M. V., Wei, C., Hardikar, A. A. Quantitative estimation of multiple miRNAs and mRNAs from a single cell. Cold Spring Harb Protoc. 2010, pdb prot5478 (2010).
  5. Joglekar, M. V., Parekh, V. S., Hardikar, A. A. Islet-specific microRNAs in pancreas development, regeneration and diabetes. Indian J Exp Biol. 49, 401-408 (2011).
  6. Farr, R. J., Joglekar, M. V., Taylor, C. J., Hardikar, A. A. Circulating non-coding RNAs as biomarkers of beta cell death in diabetes. Pediatr Endocrinol Rev. 11, 14-20 (2013).
  7. Joglekar, M. V., Joglekar, V. M., Hardikar, A. A. Expression of islet-specific microRNAs during human pancreatic development. Gene Expr Patterns. 9, 109-113 (2009).
  8. Iorio, M. V., Croce, C. M. MicroRNA profiling in ovarian cancer. Methods Mol Biol. 1049, 187-197 (2013).
  9. Mitchell, P. S., et al. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection. P Natl Acad Sci USA. 105, 10513-10518 (2008).
  10. Mattie, M. D., et al. Optimized high-throughput microRNA expression profiling provides novel biomarker assessment of clinical prostate and breast cancer biopsies. Mol Cancer. 5, 24 (2006).
  11. Zhu, W., Qin, W., Atasoy, U., Sauter, E. R. Circulating microRNAs in breast cancer and healthy subjects. BMC Res Notes. 2, 89 (2009).
  12. Zhu, H. T., et al. Identification of suitable reference genes for qRT-PCR analysis of circulating microRNAs in hepatitis B virus-infected patients. Mol Biotechnol. 50, 49-56 (2012).
  13. Yamada, H., Itoh, M., Hiratsuka, I., Hashimoto, S. Circulating microRNAs in autoimmune thyroid diseases. Clin Endocrinol (Oxf). (2014).
  14. Liu, R., et al. Serum MicroRNA Expression Profile as a Biomarker in the Diagnosis and Prognosis of Pancreatic Cancer. Clinical Chemistry. 58, 610-618 (2012).
  15. Gilad, S., et al. Serum microRNAs are promising novel biomarkers. PLoS One. 3, e3148 (2008).
  16. Joglekar, M. V., Parekh, V. S., Mehta, S., Bhonde, R. R., Hardikar, A. A. MicroRNA profiling of developing and regenerating pancreas reveal post-transcriptional regulation of neurogenin3. Dev Biol. 311, 603-612 (2007).
  17. Hardikar, A. A., Farr, R. J., Joglekar, M. V. Circulating microRNAs: understanding the limits for quantitative measurement by real-time PCR. J Am Heart Assoc. 3, e000792 (2014).
  18. Wu, C., et al. Diagnostic and Prognostic Implications of a Serum miRNA Panel in Oesophageal Squamous Cell Carcinoma. PLoS One. 9, e92292 (2014).
  19. McDonald, M. K., Capasso, K. E., Ajit, S. K. Purification and microRNA profiling of exosomes derived from blood and culture media. J Vis Exp. e50294 (2013).
  20. Joglekar, M. V., et al. The miR-30 family microRNAs confer epithelial phenotype to human pancreatic cells. Islets. 1, 137-147 (2009).
  21. Genda, Y., et al. microRNA changes in the dorsal horn of the spinal cord of rats with chronic constriction injury: A TaqMan(R) Low Density Array study. Int J Mol Med. 31, 129-137 (2013).
  22. Wang, B., et al. Systematic evaluation of three microRNA profiling platforms: microarray, beads array, and quantitative real-time PCR array. PLoS One. 6, e17167 (2011).
  23. Cuk, K., et al. Circulating microRNAs in plasma as early detection markers for breast cancer. Int J Cancer. 132, 1602-1612 (2013).
  24. Morrison, T., et al. Nanoliter high throughput quantitative PCR. Nucleic Acids Res. 34, e123 (2006).
  25. Git, A., et al. Systematic comparison of microarray profiling, real-time PCR, and next-generation sequencing technologies for measuring differential microRNA expression. RNA. 16, 991-1006 (2010).
  26. Benes, V., Castoldi, M. Expression profiling of microRNA using real-time quantitative PCR, how to use it and what is available. Methods. 50, 244-249 (2010).
  27. Chen, C., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 33, e179 (2005).
  28. Schmittgen, T. D., et al. Real-time PCR quantification of precursor and mature microRNA. Methods. 44, 31-38 (2008).
  29. Kodani, M., et al. Application of TaqMan low-density arrays for simultaneous detection of multiple respiratory pathogens. J Clin Microbiol. 49, 2175-2182 (2011).
  30. Taylor, C. J., Satoor, S. N., Ranjan, A. K., Pereirae Cotta,, V, M., Joglekar, M. V. A protocol for measurement of noncoding RNA in human serum. Exp Diabetes Res. 2012, 168368 (2012).
  31. TPF & SPF File Download Options [Internet]. Available from: http://www.appliedbiosystems.com/absite/us/en/home/products/tpf-spf-download.html (2014).
  32. Turchinovich, A., Weiz, L., Langheinz, A., Burwinkel, B. Characterization of extracellular circulating microRNA. Nucleic Acids Res. 39, 7223-7233 (2011).
  33. Li, Y., Kowdley, K. V. Method for microRNA isolation from clinical serum samples. Anal Biochem. 431, 69-75 (2012).
בזמן אמת המבוסס על הבדיקה PCR גישות למדידת כמותית של מיקרו-רנ&quot;א
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wong, W., Farr, R., Joglekar, M., Januszewski, A., Hardikar, A. Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs. J. Vis. Exp. (98), e52586, doi:10.3791/52586 (2015).More

Wong, W., Farr, R., Joglekar, M., Januszewski, A., Hardikar, A. Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs. J. Vis. Exp. (98), e52586, doi:10.3791/52586 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter