Abstract
الناجم عن اختلال وظيفي التيلومير فقدان النزاهة الجينوم ولها إشارات الحمض النووي من التلف المرتبطة والاستجابات عند نقاط التفتيش هي السائقين الراسخة التي تسبب تدهور الأنسجة أثناء الشيخوخة. السرطان، مع معدلات الإصابة تزداد بشكل كبير مع التقدم في العمر، يتميز أطوال التيلومير قصيرة والنشاط التيلوميراز عالية. لدراسة أدوار ضعف التيلومير والتيلوميراز تنشيط في الشيخوخة والسرطان، ويبين بروتوكول كيفية توليد اثنين التيلوميراز محرض الفئران الضربة القاضية في الأليلات 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) -inducible ثالثي مستقبلات الاستروجين (mTERT-ER) والسلمون المدخن -Stopper-السلمون المدخن TERT (LSL-mTERT). يصف بروتوكول الإجراءات للحث على ضعف التيلومير وتنشيط النشاط التيلوميراز في mTERT-ER وLSL-mTERT الفئران في الجسم الحي. وتشير البيانات إلى أن تمثيلية تنشيط النشاط التيلوميراز يمكن أن يخفف من الظواهر التنكسية الأنسجة الناجمة عن اختلال وظيفي التيلومير. في ORDإيه لتحديد تأثير التيلوميراز تنشيط على تكون الأورام، ولدت لنا البروستاتا الورم نموذج G4 PB-Cre4 PTEN L / L البروتين p53 L / L LSL-mTERT L / L والتوتة تي خلية سرطان الغدد الليمفاوية نموذج G4 أجهزة الصراف الآلي - / - mTERT ER / ER . وتشير البيانات إلى أن تمثيلية تنشيط التيلوميراز في ظل عدم الاستقرار الجيني الناجم عن اختلال وظيفي التيلومير يمكن أن يعزز إلى حد كبير تكون الأورام. يصف البروتوكول أيضا الإجراءات المستخدمة لعزل الخلايا الجذعية العصبية (NSCs) من mTERT-ER وLSL-mTERT الفئران وتنشيط النشاط التيلوميراز في NSCs في المختبر. وتشير البيانات إلى أن تمثيلية تنشيط التيلوميراز يمكن أن تعزز قدرة التجديد الذاتي وتكوين الخلايا العصبية في المختبر. وأخيرا، يصف بروتوكول الإجراءات لأداء التيلومير FISH (الإسفار في الموقع التهجين) على كلا FFPE الماوس (الفورمالين الثابتة وParafزعنفة جزءا لا يتجزأ) أنسجة المخ والكروموسومات الطورية من الخلايا المستزرعة.
Introduction
التيلوميراز هو انزيم مسؤول عن الحفاظ على التيلوميرات. هذه هي متواليات المتكررة في نهايات الكروموسومات التي تحمي سلامتها. المكونات الأساسية من التيلوميراز عميم الإنزيم هي وحدة فرعية الناسخ العكسي الحفازة (TERT) وحدة فرعية RNA (TERC) التي هي بمثابة القالب لإضافة الكروموسومات يكرر 1،2. في حين قمعت بشكل عام في الخلايا الجسدية متباينة، التيلوميراز يسلك النشاط القوي ويلعب دورا هاما في الخلايا الجرثومية، والخلايا السرطانية والخلايا الجذعية.
mTERC وmTERT الفئران خروج المغلوب توفر كبيرة في نظم نموذج الجسم الحي لدراسة وظائف التيلوميراز في كل من الخلايا الجذعية والسرطان. وmTERC وmTERT خروج المغلوب لم الفئران (G1) لا تظهر أي الظواهر واضحة بسبب الاحتياطي طويل من التيلوميرات في الفئران 3. ومع ذلك، intercrossing متسلسل mTERC وmTERT الفئران خروج المغلوب إلى أواخر جيل (G5-G6) نتج عنهتآكل التدريجي للالتيلوميرات، وفي نهاية المطاف أثار تدهور حاد في الأنسجة التكاثري للغاية 4. جيل الراحل (G5-G6) mTERC - / - الفئران يعانون من العقم بسبب ارتفاع معدلات موت الخلايا المبرمج في الخصية والجرثومية نضوب الخلية. G5-G6 mTERC - / - الفئران أيضا يحمل الظواهر التنكسية في الأنسجة التكاثري للغاية بما في ذلك نخاع العظام والأمعاء والجلد بسبب ارتفاع معدلات موت الخلايا المبرمج والمعيبة قدرة التجديد الذاتي في الأنسجة الجذعية / مقصورات خلية سلفية 4. الخلايا الجذعية المكونة للدم في نخاع العظام من جيل أواخر mTERC - / - الفئران فقدان المعرض من إمكانات التكاثري، للخطر قدرة التجديد الذاتي، وتعزيز موت الخلايا المبرمج، وفي نهاية المطاف استنفاد الوظيفي 5،6. وبالمثل، لوحظت زيادة تدريجيا الهيئات أفكارك في أقبية المعوية في كل جيل من الأجيال المتعاقبة من G1-G6 mTERC - / - الفئران 7،8. تيكان تأثير ضار من التيلوميرات مختلة لا يبدو أن يقتصر على الأنسجة دوران عالية لأن كلا من انتشار الخلايا الجذعية العصبية الكبار في المختبر وتكوين الخلايا العصبية في الجسم الحي وضعف شديد في أواخر الجيل (G4-G5) mTERC - / - الفئران 9 . ويدعم دور التيلوميراز في الخلايا الجذعية مزيد من النتائج في النادر البشري عسر التقرن الخلقي اضطراب وراثي (DKC)، والتي في بعض وسائل يشبه الشيخوخة المبكرة 10،11. ويتسبب DKC بواسطة الطفرات في TERC، TERT، والجينات التي تكود dyskerin، والتيلوميراز فرعية الأساسية، وغيرها من البروتينات المرتبطة dyskerin 12. في المتوسط، التيلوميرات في المرضى الذين DKC هي أقصر من 99٪ من العمر كعينة ضابطة. ومن المقرر أن فقر الدم اللاتنسجي، والذي كان سببه الصيانة المعيبة من الخلايا الجذعية المكونة للدم الاعتلال الرئيسي لهذا المرض. جوانب أخرى للمرض مثل الطلاوة عن طريق الفم، ضمور الأظافر، retardati العقليةعلى، وضمور الخصيتين والمضاعفات الرئوية جميع أقترح ضعف وظائف الخلايا الجذعية والأنسجة الخلايا الاصلية 10، والنتائج في وثيقة الاتفاق مع تلك الموجودة في الجيل الراحل من الفئران التيلوميراز خروج المغلوب. المرضى DKC عرضة لمتلازمة خلل التنسج النقوي ويكون زيادة انتشار الأورام المخاطية الخبيثة. وهكذا، ونقص تيلوميراز في المرضى من البشر يلخص العيوب من وظائف الخلايا الجذعية والأورام الاستعداد التي لوحظت في أواخر الجيل الفئران التيلوميراز خروج المغلوب.
التيلوميرات قصيرة والنشاط التيلوميراز عالية هي السمات المميزة لمرض السرطان. كما الخلايا الطبيعية أو ما قبل سرطان تقسم، نتائج النشاط التيلوميراز منخفضة أو غائبة في تآكل في نهاية المطاف التيلوميرات وتفعيل نقاط التفتيش الخلوية مماثلة لتلك الناجمة عن الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل فواصل (DSBs) 13. مثل DSBs الكلاسيكية، وقد تبين ضعف التيلومير للحث على البروتين p53 وما يرتبط بها من الاستجابات الخلوية، مثل الشيخوخة و / أو apoptosiق 14،15. على تعطيل طفرية من البروتين p53، وتتعزز الدراجات الخلية وبقاء الخلية في الخلايا مع ضعف التيلومير، الذي يوفر آلية mutator الموالية للسرطان التي تتميز نقل المواقع والتكبير الإقليمية والحذف 16،17. في الوقت نفسه، واصلت ضعف التيلومير وما يرتبط بها من عدم الاستقرار الكروموسومات المستشري (حتى في خلايا فارغة البروتين p53) تظهر لتقييد تطور خبيث الكامل لهذه السرطانات. على سبيل المثال، جيل أواخر G4-G5 mTERC - أظهرت الفئران انخفاضا كبيرا حدوث سرطان الغدد الليمفاوية مقارنة مع Ink4a / المنتدى الاقليمى الفئران لاغيا بسبب التيلومير الاستنزاف - / - Ink4a / المنتدى الاقليمى - /. وفي دراسة أخرى، والآفات ورميغدي أكثر تقدما في G4 mTERT - / - APC دقيقة الفئران قمعت بشكل كبير بالمقارنة مع الفئران APC دقيقة بسبب اعتقال نموا كبيرا وموت الخلايا المبرمج 18،19. الالملاحظة أن التيلومير خلل الناجم عن عدم الاستقرار الجيني يمنع تطور الورم يطالب تكهنات بأن تفعيل التيلوميراز قد تمكن تطور خبيث في جزء من قمع عدم الاستقرار الجيني إلى مستوى متوافق مع بقاء الخلية السرطانية و / أو تحييد تعتمد على البروتين p53 أو آليات تفتيش مستقلة من.
من أجل دراسة ما إذا كانت التيلوميراز تنشيط يمكن أن تتوقف أو حتى عكس الشيخوخة للخلايا الجذعية، وعما إذا كان التيلوميراز تنشيط يمكن أن تعزز تكون الأورام على خلفية عدم الاستقرار الجيني، فإننا ولدت اثنين محرض الأليلات التيلوميراز الفئران. أول واحد هو 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) -inducible ثالثي مستقبلات الاستروجين (mTERT-ER) الانصهار الضربة القاضية في أليل. في غياب 4-OHT والفئران متماثلة اللواقح بالنسبة mTERT-ER (المعين mTERT ER / ER) هي النشاط التيلوميراز ناقصة والمحافظة على نفس الظواهر الوراثية الخلوية والخلوية كما mTERT التقليدية أو مTERC نموذج خروج المغلوب. على 4 OHT العلاج، يمكن استعادة TERT-ER نشاط البروتين إلى مستويات مماثلة لالبروتين TERT الأصلي 20، 21، وأليل الثاني هو رواية TERT محرض الضربة القاضية في أليل تحتوي على intronic LoxP-سدادة-LoxP كاسيت (LSL- mTERT)؛ على استئصال LSL لجنة المساواة العرقية بوساطة، وإعادة اعرب mTERT تحت آليات الرقابة التعبير الذاتية 22.
Protocol
ملاحظة: تم الموافقة على جميع الخطوات في هذا البروتوكول من قبل UT مركز أندرسون للسرطان.
1. توليد mTERT-ER أليل
- أعرض الضربة القاضية في استهداف ناقلات تحتوي على ERT2-الائتلاف الحزبي (يجند ملزم المجال) المنبع وفي الإطار مع التسلسل الجيني mTERT (اكسون من 1 إلى إنترون 2) والسلمون المدخن - PGK - الجدد - السلمون المدخن جزء (الشكل 1A) في الماوس خلايا ES مع Electroporation لل.
- ثقافة الخلايا ES في النيوميسين عن 6-10 أيام. اختيار الحيوانات المستنسخة مقاومة للالنيوميسين وتوسيع في 48 لوحات جيدة. استخراج الحمض النووي الجيني باستخدام طقم التجارية والتأكد من الضربة القاضية في أليل لطخة الجنوبية.
- حقن اثنين ES خطوط مع أكثر من 95٪ [كروتب الطبيعية إلى C57BL / 6 الكيسات الأريمية مع مجموعة المجهرية تحت مجهر مقلوب. زرع الكيسات الأريمية في رحم الأمهات البديلات 23. تتزاوج في chimaeras الذكور عالية الجودة (70-90٪) لC57BL / 6 الحديدالذكور.
- تأكيد التنميط الجيني لمتخالف الحيوانات mTERT-ERneo لطخة الجنوبية.
- تتزاوج ومتخالف الحيوانات mTERT-ERneo والحيوانات EIIa-لجنة المساواة العرقية لحذف كاسيت NeoR. تزاوج الحيوانات متخالف لC57BL / 6 الحيوانات لمدة ثلاث مرات على الأقل، وأخرى بين سلالة متخالف الحيوانات mTERT-ER لتوليد متماثلة الألائل.
2. جيل من LSL-mTERT أليل
- إدخال الضربة القاضية في استهداف ناقلات تحتوي على LoxP - سدادة ثلاثية - الجدد - جزء LoxP والتسلسل الجينومي mTERT (بين اكسون 1 و 2 إنترون، الشكل 1B) في الماوس خلايا ES مع Electroporation لل23.
- ثقافة الخلايا ES في النيوميسين عن 6-10 أيام. اختيار الحيوانات المستنسخة مقاومة للالنيوميسين وتوسيع في 48 لوحات جيدة. استخراج الحمض النووي الجيني باستخدام طقم التجارية والتأكد من الضربة القاضية في أليل من جنوب لطخة 23.
- Injeط م اثنين ES خطوط مع أكثر من 95٪ [كروتب الطبيعية إلى C57BL / 6 الكيسات الأريمية مع مجموعة المجهرية تحت مجهر مقلوب. زرع الكيسات الأريمية في رحم الأمهات البديلات 23. تتزاوج في chimaeras الذكور عالية الجودة (70-90٪) لC57BL / 6 إناث.
- تأكيد التنميط الجيني لمتخالف الحيوانات LSL-mTERT لطخة الجنوبية.
- تزاوج الحيوانات متخالف لC57BL / 6 الحيوانات لمدة ثلاث مرات على الأقل، وأخرى بين سلالة متخالف الحيوانات LSL-mTERT لتوليد متماثلة الألائل.
3. إعادة تنشيط التيلوميراز في mTERT-ER والفئران LSL-mTERT في فيفو
لmTERT-ER
- تعقيم جميع الأدوات الجراحية قبل الحقن.
- تخدير الفئران مع غرفة الأيزوفلورين (4٪ لتحريض، 2٪ للحفاظ على) في 50٪ (ت / ت) الأوكسجين / 50٪ (ت / ت) خليط الغاز ثنائي النيتروجين وأول أكسيد. أو تخدير الفئران عن طريق خليط-الكيتامين زيلازين (100 مز / كغم من وزن الجسم + 10 ملغم / كغم من وزن الجسم).
- بعد يتم التوصل التخدير العميق، وإزالة تخدير الحيوان من غرفة الاستقراء، والحفاظ على رؤوسهم داخل الأنبوب متصلا غرفة الأيزوفلورين (2٪).
- قرصة منصات القدم من الفئران لضمان إفقاد إحساس الحيوان بعمق. وضع مرهم على كلتا العينين من أجل منع العينين من الجفاف. يمسح الجزء الخلفي من الفئران مع حل بوفيدون اليود.
- حقن بطيئة الافراج-4-OHT بيليه مع trochar الدقة (10 G) تحت جلد الظهر ودفع بيليه على طول الطريق إلى خط الوسط بين الكتفين.
- ختم شق الجرح مع مقطع مطبق ورصد الفئران للتعافي من التخدير. إزالة لقطات في وقت لاحق 10 يوما. الحرارة تكميلية ليست ضرورية لأن الانتهاء من إجراء في وقت قريب.
- ينبغي أن يكون الأمثل فترة العلاج مع 4-OHT بيليه وفقا للغرض من الدراسة.
لLSL-mTERT
<رأ>4. عزل الخلايا الجذعية العصبية وإعادة تنشيط التيلوميراز في المختبر
- يصرح باستخدامها الفئران مع ثاني أكسيد الكربون وتتم إزالة العقول. اتبع بروتوكول المتاحة تجاريا العصبية عدة التفكك الأنسجة حسب الشركة المصنعة.
- Resuspend ومسحوق مجفف بالتجميد في قارورة وصفت الحل 4 مع 1 مل من مستنبت الخلية لحلول 4. لا الدوامة. وينبغي بعد ذلك aliquoted هذا الحل وتخزينها في -20 ° C لاستخدامها لاحقا.
- قبل حرارة الخليط عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة قبل الاستخدام.
- جعل أنزيم ميكس 1: الحل 1 (50 ميكرولتر) والحل 2 (1،900 ميكرولتر). جعل أنزيم ميكس 2: الحل 3 (20 ميكرولتر) والحل 4 (10 ميكرولتر).
- إعداد 1،950 ميكرولتر انزيم مزيج 1 لمدة تصل إلى 400 ملغ الأنسجة ودوامة. وقبل حرارة الخليط عند 37 درجة مئوية لمدة15 دقيقة قبل الاستخدام.
- إخراج أدمغة فئران 1-يوم، والحفاظ على forebrains عن طريق إزالة بصيلات الشم والمخيخ. الحفاظ على أنسجة الدماغ الأمامي في 1 مل من البرد مستنبت منذ إزالة وتخزينها في 4 درجات مئوية. تأكد لمعالجة الأنسجة العصبية في حدود 1 ساعة.
- تحديد وزن الأنسجة للتأكد من عدم تجاوز حد 400 ملغ لكل الهضم. وضع الدماغ على غطاء 35 مم طبق بتري، وسحق الدماغ باستخدام مشرط.
- باستخدام ماصة طرف 1 مل، إضافة 1 مل من HBSS (ث / س كا / ملغ) وقطع ماصة مرة أخرى إلى أنبوب 15 مل. شطف مع HBSS (ث / س كا / ملغ). الطرد المركزي في 300 × ز لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ونضح طاف بعناية.
- إضافة 1،950 ميكرولتر من مزيج انزيم قبل ساخنة 1 (حلول 1 و 2) في ما يصل الى 400 ملغ الأنسجة. احتضان في أنبوب 15 مل لمدة 15 دقيقة عند 37 ° C، والخلط التي كتبها قلب أو يهتز أنبوب كل 5 دقائق.
- إعداد 30 ميكرولتر مزيج انزيم 2 في عينة الأنسجة بإضافة 20 & #956؛ ل من الحل 3 إلى 10 ميكرولتر من الحل 4. ثم تضيف إلى العينة. عكس بلطف لمزج. لا الدوامة.
- فصل الأنسجة ميكانيكيا باستخدام اسعة ذات الرؤوس، مصقول النار ماصة باستير قبل pipetting صعودا وهبوطا 10 مرات ببطء. تجنب تشكيل فقاعات الهواء.
- احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، قلب الأنبوب كل 3 دقائق.
- كرر الخطوة 4.11 وخطوة 4.12 إذا الأنسجة هي أكبر من 200 ملغ.
- تطبيق تعليق خلية لمصفاة الخلية 70 ميكرومتر، وضعت على أنبوب 50 مل. تطبيق 10 مل من برنامج تلفزيوني من خلال مصفاة الخلية. تجاهل مصفاة الخلية وأجهزة الطرد المركزي تعليق خلية في 300 غ لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. نضح طاف تماما.
- الخلايا resuspend مع المتوسطة الخلايا الجذعية إلى الحجم المطلوب لمزيد من التطبيقات.
- لتفعيل التيلوميراز في LSL-mTERT NSCs، وعلاج الخلايا مع 100 ميكرومتر 4-OHT لمدة يومين. لتفعيل التيلوميراز في mTERT-ER NSCs، والحفاظ على الخلايا في مستنبت مع 100 ميكرومتر 4-OHT.
5. التيلومير FISH
- إعداد الكروموسومات الطورية من الخلايا المستزرعة.
- لFFPE (الفورمالين الثابتة والبارافين جزءا لا يتجزأ) أقسام الأنسجة، deparaffinize في الزيلين وترطيب في سلسلة الإيثانول لمدة 5 دقائق كل (100٪، 90٪، 70٪، 50٪ من الإيثانول) وبرنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق.
- ما بعد الإصلاح في الميثانول: حمض الخليك (3: 1) لمدة 1-2 ساعة. يذوى في سلسلة الايثانول الباردة لمدة 5 دقائق لكل منهما (70٪، 90٪، 100٪ من الإيثانول) والهواء الجاف. يغسل في برنامج تلفزيوني 1X عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- تفسد الكروموسومات في 4٪ فورمالدهايد عند 37 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة. يذوى في سلسلة الإيثانول الباردة 5 دقائق كل (70٪، 90٪، 100٪ من الإيثانول) والهواء الجاف.
- تطبيق 12-25 ميكرولتر من الخليط التهجين السلطة الوطنية الفلسطينية إلى كل شريحة. (التهجين مزيج: 70٪ الفورماميد، 0.06x SSC، 0.2٪ BSA، و 0.5 نانوغرام / ميكرولتر الحمض الريبي النووي النقال، 0.5 نانوغرام / ميكرولتر التيلومير أو السنترومير تحقيقات)
- اغلاق الغطاء زلة مع الاسمنت والمطاط. محضرات الكروموسومات بعد بدل طبيعة وأقسام الأنسجة عند 80 درجة مئوية لمدة 4 مفي. هجن في درجة حرارة الغرفة أو 37 درجة مئوية لمدة 2-4 ساعة في غرفة رطبة.
- يغسل في درجة حرارة الغرفة مع غسل العازلة 2 × 15 دقيقة. (غسل عازلة: 70٪ الفورماميد، 0.06x SSC، ودرجة الحموضة 7.2). يغسل في درجة حرارة الغرفة 3 × 5 دقائق مع PBST. الشرائح مكافحة وصمة عار مع دابي أو مضان الحمراء بعيدة عن الفحص المجهري.
Representative Results
استراتيجيات لتوليد الفئران mTERT-ER وLSL-mTERT الضربة القاضية في الأليلات وصفت في الشكل 1A و 1B. على وجه التحديد، وLoxP - سدادة ثلاثية - الجدد - تم إدراج جزء LoxP بين اكسون 1 و 2 من اكسون mTERT موضع لتوليد LSL-mTERT أليل. لتوليد mTERT-ER أليل، تم إدراج مجال ERT2-الائتلاف الحزبي في الإطار مع الجين mTERT إلى N-محطة من اكسون 1. لقد أظهرنا أنه عندما تم تنشيط التيلوميراز عابر في الفئران ضعف التيلومير من خلال معاملتهم مع الكريات 4-OHT لمدة 4 أسابيع، يمكن التخفيف من حدتها النمط الظاهري التنكسية في أجهزة متعددة مثل الدماغ (الشكل 2A) والخصيتين (الشكل 2B). من أجل تحديد أثر التيلوميراز تنشيط على الخلايا المستزرعة في المختبر، ونحن عزل الخلايا الجذعية العصبية (NSCs) من جيل أواخر G4 LSL-mTERT وG4 mTERTالفئران -ER. أظهرنا أنه عندما تم تنشيط التيلوميراز في التيلومير NSCs مختلة، والقدرة على التجديد الذاتي من NSCs تم زيادة كبيرة (الشكل 3A)، وتكوين الخلايا العصبية في المختبر وأيضا تعزز إلى حد كبير (الشكل 3B). من أجل تحديد أثر التيلوميراز تنشيط على تكون الأورام في سياق ضعف التيلومير، ولدت لنا PB-Cre4 PTEN L / L البروتين p53 L / L LSL-mTERT L / L (نموذج ورم البروستاتا) وأجهزة الصراف الآلي - / - mTERT ER / ER (التوتة تي خلية سرطان الغدد الليمفاوية نموذج) الأفواج جيل في وقت متأخر. عندما تم تنشيط التيلوميراز عن طريق العلاج تاموكسيفين في هذه الفئران مع الحقن (الشكل 4A) أو الكريات 4-OHT لمدة 8 أسابيع (الشكل 4B)، تم تعزيز تكون الأورام بشكل كبير في كل من البروستاتا نموذج الورم (الشكل 4A) والتوتة نموذج سرطان الغدد الليمفاوية T-خلية (
الشكل (1): (A) mTERT-ER الضربة القاضية في الاستراتيجية. TV، واستهداف ناقلات. WT، النوع البري أليل. KI، الضربة القاضية في أليل. LA، الذراع الأيسر. RA، الذراع الأيمن. E1، اكسون 1؛ E2، اكسون 2. الجدد، PGK المروج يحركها الجين المقاوم بالنيوميسين. ER أو تعديل مستقبلات هرمون الاستروجين (ERT2) يجند مجال ملزمة. DT، dyphteria الجين السم. (B) LSL-mTERT استراتيجية الضربة القاضية في. TV، واستهداف ناقلات. WT، النوع البري أليل. KI، الضربة القاضية في أليل. LA، الذراع الأيسر. RA، الذراع الأيمن. E1، اكسون 1؛ E2، اكسون 2. الجدد، PGK المروج يحركها الجين المقاوم بالنيوميسين. سدادة، ثلاث متواليات توقف النسخي المتكررة. DT، dyphteria الجين السم.
الطبقة = "jove_content" FO: المحافظة على together.within صفحة = "دائما"> 
الشكل 2: البيانات التمثيلية لاظهار التيلوميراز تنشيط إلى التقليل من الظواهر التنكسية أجهزة صور الممثل من العقول (يسار). والخصيتين (يمين) من G0 وG4 mTERT-ER الفئران التي عولجت بالدواء الوهمي أو 4 OHT لمدة 4 أسابيع. الحانات النطاق تشير 50 ميكرومتر. إعادة طبع بإذن من 20. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 3: البيانات التمثيلية لاظهار التيلوميراز تنشيط يعزز تجديد الذات وتكوين الخلايا العصبية من الخلايا الجذعية العصبية في المختبر (A) صور الممثل من الخلايا الجذعية العصبيةق معزولة عن G4 LSL-mTERT (اللوحة العليا) وG4 mTERT-ER (اللوحة السفلى) نموا في المتوسط الخلايا الجذعية تعامل مع السيارة أو 4 OHT. (B) صور الممثل من الخلايا العصبية في المختبر (Tuj1 +) من الخلايا الجذعية العصبية معزولة عن G4 mTERT-ER مثقف في التمايز المتوسطة (مع 1٪ FBS) تعامل مع السيارة أو 4 OHT. الحانات النطاق تشير إلى 100 ميكرون.
الرقم 4: البيانات التمثيلية لإظهار التيلوميراز تنشيط يعزز تكون الأورام على خلفية عدم الاستقرار الجيني (A) صور الممثل للأورام البروستاتا تشريح من G0 PB-Cre4 PTEN L / L البروتين p53 L / L LSL-mTERT +/-، G4 PB- Cre4 PTEN L / L البروتين p53 L / L LSL-mTERT- / -، وG4 PB-Cre4 PTEN L / L البروتين p53 L / L LSL-mTERT L / L تعامل مع تاموكسيفين. إعادة طباعة بإذن من 22. (B) صور الممثل الغدة الصعترية الأورام اللمفاوية T-خلية تشريح من G0 أجهزة الصراف الآلي - / - mTERT + / ER، G4 أجهزة الصراف الآلي - / - mTERT ER / ER تعامل مع السيارة، وG4 أجهزة الصراف الآلي - / - mTERT ER / ER تعامل مع 4- OHT لمدة 8 أسابيع. الحانات النطاق تشير إلى 1 سم.
الشكل 5: صور الممثل من الكروموسومات وFISH القسيم المركزي على FFPE الماوس أنسجة المخ والطورية (الشكل). الأحمر يشير DNA والأخضر يشير التيلومير تلطيخ، ويشير السماوي مntromere تلطيخ. الحانات النطاق تشير 1 مم.
Discussion
هنا، ونحن التقرير الجيل اثنين محرض الأليلات التيلوميراز الفئران وكيفية تنشيط التيلوميراز في المجراة في المختبر. في خطوة حاسمة لإعادة تنشيط النشاط mTERT-ER هو الحفاظ على التركيز المستمر للتاموكسيفين، لذلك اخترنا لاستخدام 4-OHT الكريات الوقت الإفراج المصنعة من قبل البحوث المبتكرة الأمريكية. الكريات الحفاظ على الإفراج عن 4OHT على مستوى ثابت الدم حالة من 1 نانوغرام / مل لمدة تصل إلى 60 يوما. في دراسة سابقة، أظهرنا أن تفعيل النشاط التيلوميراز مع هذه الاستراتيجية كان قادرا على التخفيف من الظواهر التنكسية مثل استنفاد الخلايا الجذعية، وضعف الردود إصابة الأنسجة وفشل الجهاز في الأجهزة المتعددة التي تم الناجمة عن اختلال وظيفي التيلومير في G4 mTERT ER / ER الفئران 20.
البعض من دراسة وظيفة التيلوميراز في الشيخوخة، وهذين الأليلات التيلوميراز محرض يمكن أن تستخدم أيضا لدراسة السرطان. أخذت الدراسات السابقةالاستفادة من هذه الأليلات لاستكشاف دور الاستنزاف التيلومير والتيلوميراز تنشيط في تشكيل الجينوم والتي تؤثر بيولوجيا الخلايا T-سرطان الغدد الليمفاوية الغدة الصعترية 21 وسرطان البروستاتا 22. وأظهرت هذه الدراسات أن اثنين من اختلال وظيفي التيلومير في جيل أواخر G4 أجهزة الصراف الآلي - / - mTERT ER / ER وG4 PB-Cre4 PTEN L / L البروتين p53 L / L LSL-mTERT L يوفر / L الفئران آلية تأجيج اكتساب الأحداث مطفرة مبكرة ل بدء الورم، ولكن منع تطور الأورام الخبيثة بشكل كامل. عندما تم تنشيط التيلوميراز في سياق الناجم عن خلل وظيفي-التيلومير عدم الاستقرار الجيني، ونقاط التفتيش الحمض النووي من التلف وتفشي عدم الاستقرار الكروموسومات قمعت، والذي سمح للتطور الكامل للأورام الخبيثة مع الخصائص البيولوجية الجديدة مثل الانبثاث العظام سرطان البروستاتا 21 وتسلل دماغ التوتةج سرطان الغدد الليمفاوية 21. وقد لوحظت ظواهر مماثلة أيضا في أنواع السرطان الأخرى بما في ذلك سرطان القولون وسرطان البنكرياس (الاتصالات الشخصية مع الدكاترة. Haoqiang يينغ، آدم Boutin ورونالد DePinho).
لأن البروتين TERT-ER يمكن ان يكون مثبت بسهولة بين داخل وخارج الدول اعتمادا على ما إذا تعامل الحيوانات مع تاموكسيفين أو مركبة، ونماذج ورم الناتجة عن mTERT-ER أليل يمكن استخدامها لاختبار العلاج المضاد للالتيلوميراز. في دراسة سابقة، والأورام ولدت في G4 أجهزة الصراف الآلي - / - أطلق سراح mTERT ER الحيوانات / ER من 4 OHT. على استنزاف التيلوميراز، تقلصت الأورام في نهاية المطاف بسبب إعادة التيلومير التي يسببها خلل نقاط التفتيش 21. ومع ذلك، فإن بعض الأورام المكتسبة المقاومة ردا على التيلوميراز الانقراض من خلال تفعيل لتطويل البديل من التيلوميرات (ALT) آلية. أظهر المزيد من توصيف هذه الأورام ALT + مقاومة أن ريا لها النسخ الشاذة من الجينات المسؤولة في علم الأحياء الميتوكوندريا والدفاع الأكسدة بما في ذلك منظم سيد الميتوكوندريا التوليف والاكسدة الدفاع PGC-1β. ضربة قاضية من PGC-1β أو SOD2 (منظم آخر للدفاع الأكسدة) يلغي بشكل كبير ALT + ورم خلايا بينما تبقي تبقى التيلوميراز + ورم خلايا سليمة نسبيا 21.
القيد واحد من هذين الضربة القاضية في الأليلات هو أنها يمكن أن تحمل فقط تنشيط التيلوميراز على مستوى الذاتية لأنهم في موضع الأصلي للجين التيلوميراز. في معظم السرطانات البشرية، هى overexpressed التيلوميراز في الواقع على مستوى أعلى من ذلك بكثير. من أجل تعزيز مستوى التيلوميراز، وتعديل واحد يمكن أن نعتبر هو لإدراج بناء mTERT-ER مع المروج أقوى مثل PGK (فسفوغليسرات كيناز) المروج في Rosa26 مكان.
وفي الختام، توفر هذين جديدة محرض الأليلات التيلوميراز الفئران جينيه لم يسبق له مثيلأدوات جيم لدراسة وظائف التيلوميراز في الشيخوخة وتوازن الأنسجة وكذلك تطور الورم، خصوصا في ظل خلفية من الحصول عليها قبل التيلومير التي يسببها خلل عدم الاستقرار الجيني. ويمكن أيضا أن أليل mTERT-ER أن تستخدم لدراسة العلاج المضاد للالتيلوميراز عن طريق عبور إلى أخرى نماذج الماوس عرضة للورم.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leica AM6000 Micromanipulation Kit | Leica | Per quote | |
| Leica DMI6000 B inverted microscope | Leica | Per quote | |
| Neomycin | Life technologies | 21810031 | |
| isoflurane vaporizer | Veterinary Anesthesia Systems | 911103 | |
| isoflurane | Henry Schein | 1005796 | |
| ketamine-xylazine mixture | Sigma-Aldrich | K113-10ML | |
| 4-OHT powder | Sigma-Aldrich | H7904-5MG | |
| Tamoxfien | Sigma-Aldrich | T5648-1G | |
| 4-OHT pellet | Innovative Research of America | Custermized | |
| Precision Trochar (10 Gauge) | Innovative Research of America | MP-182 | |
| wound clip applier | Fischer Scientific | 01-804 | |
| clip | Fischer Scientific | 01-804-5 | |
| Neural Tissue Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
| HBSS | Life technologies | 14025092 | |
| PBS | Life technologies | 10010023 | |
| xylene | Fischer Scientific | X3P-1GAL | |
| methanol | Fischer Scientific | A-433S4 | |
| acetic acid | Fischer Scientific | A38-500 | |
| ethanol | Fischer Scientific | 22-032-104 | |
| formamide | Fischer Scientific | F84-1 | |
| PNA telomere probe | Panagene | F1001-5 | |
| PNA centromere probe | Panagene | F3003-5 | |
| 20X SSC | Fischer Scientific | BP1325-4 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2153-10G | |
| tRNA | Sigma-Aldrich | R5636-1ML | |
| Tween 20 | Fischer Scientific | BP337-100 | |
| rubber cement | Walmart | Elmer's | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 |
References
- Bass, A. J., et al. Genomic sequencing of colorectal adenocarcinomas identifies a recurrent VTI1A-TCF7L2 fusion. Nat Genet. 43, 964-968 (2011).
- Beroukhim, R., et al. The landscape of somatic copy-number alteration across human cancers. Nature. 463, 899-905 (2010).
- Blasco, M. A., et al. Telomere shortening and tumor formation by mouse cells lacking telomerase RNA. Cell. 91, 25-34 (1997).
- Lee, H. W., et al. Essential role of mouse telomerase in highly proliferative organs. Nature. 392, 569-574 (1998).
- Rossi, D. J., et al. Deficiencies in DNA damage repair limit the function of haematopoietic stem cells with age. Nature. 447, 725-729 (2007).
- Wong, K. K., et al. Telomere dysfunction and Atm deficiency compromises organ homeostasis and accelerates ageing. Nature. 421, 643-648 (2003).
- Rudolph, K. L., et al. Longevity, stress response, and cancer in aging telomerase-deficient mice. Cell. 96, 701-712 (1999).
- Wong, K. K., et al. Telomere dysfunction impairs DNA repair and enhances sensitivity to ionizing radiation. Nat Genet. 26, 85-88 (2000).
- Ferron, S., et al. Telomere shortening and chromosomal instability abrogates proliferation of adult but not embryonic neural stem cells. Development. 131, 4059-4070 (2004).
- Savage, S. A., Alter, B. P.
- Armanios, M.
- Vulliamy, T., et al. The RNA component of telomerase is mutated in autosomal dominant dyskeratosis congenita. Nature. 413, 432-435 (2001).
- Harley, C. B., Harley, S. W.
- Karlseder, J., Broccoli, D., Dai, Y., Hardy, S., de Lange, T. p53- and ATM-dependent apoptosis induced by telomeres lacking TRF2. Science (New York, N.Y.). 283, 1321-1325 (1999).
- Steensel, B., Smogorzewska, A., de Lange, T. TRF2 protects human telomeres from end-to-end fusions. Cell. 92, 401-413 (1998).
- Chin, L., et al. p53 deficiency rescues the adverse effects of telomere loss and cooperates with telomere dysfunction to accelerate carcinogenesis. Cell. 97, 527-538 (1999).
- Artandi, S. E., et al. Telomere dysfunction promotes non-reciprocal translocations and epithelial cancers in mice. Nature. 406, 641-645 (2000).
- Rudolph, K. L., Millard, M., Bosenberg, M. W., DePinho, R. A. Telomere dysfunction and evolution of intestinal carcinoma in mice and humans. Nat Genet. 28, 155-159 (2001).
- Greenberg, R. A., et al. Short dysfunctional telomeres impair tumorigenesis in the INK4a(delta2/3) cancer-prone mouse. Cell. 97, 515-525 (1999).
- Jaskelioff, M., et al. Telomerase reactivation reverses tissue degeneration in aged telomerase-deficient mice. Nature. 469, 102-106 (2011).
- Hu, J., et al. Antitelomerase therapy provokes ALT and mitochondrial adaptive mechanisms in cancer. Cell. 148, 651-663 (2012).
- Ding, Z., et al. Telomerase reactivation following telomere dysfunction yields murine prostate tumors with bone metastases. Cell. 148, 896-907 (2012).
- Nagy, A. Manipulating the mouse embryo : a laboratory manual. , 3rd Edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2003).
