Abstract
הטלומרים תפקוד לקוי-induced אובדן שלמות הגנום ואיתות הנזק ל- DNA הקשורים אליו ותגובות מחסום נהגים ותיקים שגורמים לניוון רקמה במהלך הזדקנות. סרטן, עם שיעורי היארעות להגדיל באופן משמעותי עם גיל, מאופיין באורכי הטלומרים קצרים ופעילות הטלומרז גבוהה. כדי לחקור את התפקידים של חוסר תפקוד הטלומרים והפעלה מחדש telomerase בהזדקנות וסרטן, הפרוטוקול מראה כיצד ליצור שתי הטלומרז מושרה עכברי נוק-באללים 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) -inducible טרט-קולטן אסטרוגן (ER-mTERT) ולקס -Stopper-לקס טרט (LSL-mTERT). הפרוטוקול מתאר את הנהלים כדי לגרום לתפקוד הלקוי של הטלומרים ולהפעיל מחדש את פעילות הטלומרז בעכברי mTERT-ER וLSL-mTERT in vivo. הנתונים מראים כי הנציג מחדש של פעילות הטלומרז יכול לשפר פנוטיפים ניוונית רקמה הנגרמים על ידי הפרעה בתפקוד הטלומרים. בORDאה כדי לקבוע את ההשפעה של הפעלה מחדש telomerase ביצירת גידולים, אנחנו שנוצרנו ערמונית PB-Cre4 G4 מודל גידול PTEN L / p53 L L / L LSL-mTERT L / L ומודל לימפומה T-cell הרתי G4 כספומט - / - mTERT ER / ER . הנתונים מראים כי הנציג מחדש telomerase ברקע של חוסר יציבות גנומית הנגרמת על ידי הפרעה בתפקוד הטלומרים יכול לשפר באופן משמעותי היווצרות גידול ב. הפרוטוקול מתאר גם את הנהלים המשמשים לבודד תאי גזע עצבי (NSCs) מmTERT-ER וLSL-mTERT עכברים ולהפעיל מחדש את פעילות הטלומרז בNSCs במבחנה. הנתונים מראים כי הנציג מחדש של הטלומרז יכול לשפר את יכולת התחדשות העצמית וneurogenesis במבחנה. לבסוף, הפרוטוקול מתאר את הנהלים לביצוע FISH הטלומרים (Fluorescence In Situ הכלאה) על שני FFPE העכבר (פורמלין קבוע וParafרקמות סנפיר Embedded) מוח וכרומוזומים metaphase של תאים בתרבית.
Introduction
הטלומרז הוא אנזים אחראי לשמירת הטלומרים. אלה הם רצפים חוזרים בקצוות של כרומוזומים שלהגן על היושרה שלהם. רכיבי הליבה של holoenzyme telomerase הם מקטע transcriptase ההפוך קטליטי (טרט) ומקטע RNA (TERC) המשמש כתבנית להוספת telomeric חוזר 1,2. בעוד מודחק בדרך כלל בתאים סומטיים מובחנים, הטלומרז מציג פעילות חזקה וממלא תפקידים חשובים בתאי נבט, תאי סרטן ותאי גזע.
עכברי נוקאאוט mTERC וmTERT לספק גדולים במערכות מודל vivo ללמוד את הפונקציות של הטלומרז בשני תאי גזע וסרטן. MTERC וmTERT מפסיד יוצא, עכברים (G1) לא הראו שום פנוטיפים ברורים בשל המילואים הארוכים של הטלומרים בעכברים 3. עם זאת, באופן סדרתי intercrossing עכברי נוקאאוט mTERC וmTERT לדור מאוחר (G5-G6) הביא לשחיקה הדרגתית של הטלומרים וסופו של הדבר עוררה ניוון חמור של רקמות שגשוג מאוד 4. דור המאוחר (G5-G6) mTERC - / - עכברים עקרים בשל השיעור הגבוה של אפופטוזיס בדלדול תא אשך וניבט. G5-G6 mTERC - / - עכברים גם תערוכת פנוטיפים ניוונית ברקמות השגשוג ביותר כוללים מח עצם, מעי ועור בשל שיעור גבוה של אפופטוזיס ויכולת התחדשות עצמית פגומה בגזע רקמות / תאי תא אב 4. תאי גזע hematopoietic במח העצם של דור מאוחר mTERC - / - עכברי אובדן תערוכה של פוטנציאל שגשוג, יכולת התחדשות עצמית נפגעה, אפופטוזיס המוגבר וסופו של דבר תשישות תפקודית 5,6. בדומה לכך, גופים אפופטוטיים מוגברים בהדרגה במאורות מעי נצפו בכל דור של G1-G6 mTERC - / - עכברי 7,8. Tהוא השפעה מזיקה של הטלומרים לא מתפקדים לא נראה להיות מוגבל לרקמות תחלופה גבוהות שכן הן ההתפשטות של תאי גזע עצביים מבוגרים במבחנה וneurogenesis in vivo היו נפגעות קשה בדור מאוחר (G4-G5) mTERC - / - עכברים 9 . התפקיד של הטלומרז בתאי גזע נתמך גם על ידי הממצאים בcongenita נדיר אנושי הפרעה גנטית דיסקרטוזיס (DKC), אשר במובנים מסוימים דומה הזדקנות מוקדמת של 10,11. DKC נגרמים על ידי מוטציות בTERC, טרט, והגנים המקודדים dyskerin, מקטע הטלומרז ליבה, וdyskerin אחר חלבונים הקשורים 12. בממוצע, הטלומרים בחולי DKC הם קצרים יותר מאשר 99% בקבוצת ביקורת באותו גיל. התחלואה העיקרית של המחלה היא כתוצאה מאנמיה אפלסטית, אשר נגרמת על ידי תחזוקה לקויה של תאי גזע hematopoietic. היבטים אחרים של המחלה כגון leukoplakia האוראלי, מסמר ניוון, retardati הנפשיב, ניוון אשכים וסיבוכים ריאתי כל מציעים לקוי פונקציות של תאי רקמת גזע ותאי אב 10, ממצאים בהסכם קרוב עם אלה בדור המאוחר של עכברי נוקאאוט הטלומרז. חולי DKC נוטים תסמונת המיאלודיספלסטית ויש לי שכיחות מוגברת של שאתות ממאירות ברירית. כך, מחסור בהטלומרז בחולים אנושיים משחזר את הפגמים של פונקציות תאי גזע ונטיית גידול שנצפו בעכברי נוקאאוט הטלומרז דור מאוחר.
טלומרים קצרים ופעילות גבוהה הטלומרז הם מסימני היכר של הסרטן. כתאים נורמלים או טרום לחלק, תוצאות הפעילות הטלומרז נמוכות או חסרות בסופו של הדבר לשחיקת הטלומרים והפעלת מחסומים סלולריים דומים לאלה עוררו על ידי ה- DNA גדילים כפולים הפסקות (DSBs) 13. כמו DSBs הקלאסי, תפקוד לקוי של הטלומרים הוכח לגרום p53 וקשורים תגובות הסלולר, כגון הזדקנות ו / או apoptosiזה 14,15. על איון מוטאציות של p53, רכיבה על אופניים תא והישרדות תא משופרים בתאים עם תפקוד לקוי של הטלומרים, שמספק מנגנון המוטטורי פרו-מסרטנת המאופיין בטרנסלוקציות וamplifications האזורי ומחיקות 16,17. במקביל, המשיך תפקוד לקוי של הטלומרים וחוסר יציבות כרומוזומלית משתולל קשור (אפילו בתאי null p53) מופיע להגביל התקדמות ממארת מלאה של סרטן מסוג זה. לדוגמא, G4-G5 הדור מאוחר mTERC - / - Ink4a / ארף - / - עכברים הראו שכיחות לימפומה מופחתת באופן משמעותי בהשוואה לעכברי null Ink4a / ארף עקב התשה הטלומרים. במחקר אחר, נגעי adenomatous מתקדמים יותר בG4 mTERT - / - עכברי דקות APC דוכאו באופן משמעותי בהשוואה לעכברי דקות APC בשל מעצר צמיחה משמעותי ואפופטוזיס 18,19.תצפית שהטלומרים תפקוד לקוי-induced חוסר יציבות גנומית מעכבת התקדמות גידול מבקשת הספקולציות כי ההפעלה הטלומרז עשויה לאפשר התקדמות ממארת בחלקו על ידי דיכוי חוסר יציבות גנומית לרמה תואמת ליכולת קיום של תאי הסרטן ו / או p53 תלוי נטרול או מנגנוני מחסום -independent.
כדי ללמוד אם הפעלה מחדש telomerase יכולה לעצור או אפילו להפוך הזדקנות של תאי גזע, ואם הפעלה מחדש telomerase יכולה לקדם את יצירת הגידולים על רקע חוסר היציבות גנומית, אנחנו שנוצרנו שני אללים הטלומרז עכבריים מושרה. הראשון הוא 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) היתוך -inducible טרט-קולטן אסטרוגן (ER-mTERT) לדפוק באלל. בהעדר 4-OHT, עכברים הומוזיגוטים לmTERT-ER (mTERT ER / ER המיועד) הן פעילות הטלומרז לקויה ולקיים אותו פנוטיפים ציטוגנטית וסלולריים כmTERT או מ 'קונבנציונלייםמודל נוקאאוט TERC. על 4-OHT טיפול, פעילות חלבון טרט-ER ניתן לשחזר לרמות דומות לחלבון האם של טרט 20, 21. אלל השני הוא לדפוק באלל המכיל קלטת LoxP-בלם-LoxP אינטרוניים (LSL- טרט מושרה רומן mTERT); על Cre בתיווך הכריתה של LSL, mTERT מחדש הביע תחת מנגנוני בקרת ביטוי אנדוגני 22.
Protocol
הערה: כל הצעדים בפרוטוקול זה אושרו על ידי UT מרכז סרטן MD Anderson.
1. דור של mTERT-ER אללו
- להציג לדפוק במיקוד וקטור המכיל את ERT2-LBD (יגנד כריכת Domain) במעלה הזרם ובמסגרת עם הרצף הגנומי mTERT (אקסון אינטרון 1 עד 2) ולקס - PGK - ניאו - בר לקס (איור 1 א) בתאי הגזע העובריים של עכבר עם electroporation.
- תרבות תאי הגזע העובריים בנאומיצין ל6-10 ימים. בחר שיבוטים נאומיצין עמיד ולהרחיב ב -48 צלחות גם. חלץ את הדנ"א הגנומי באמצעות ערכה מסחרית ולאשר את נוק-באלל על ידי כתם דרום.
- הזרק שני קווי ES עם karyotypes הנורמלי מעל 95% לC57BL / 6 blastocysts עם ערכת מיקרומניפולציה תחת מיקרוסקופ הפוכה. שתל blastocysts אל תוך הרחם של אמהות פונדקאיות 23. Mate תעתועים בדרגה גבוהה ממין זכר (70-90%) לC57BL / 6 Feזכרים.
- לאשר את genotyping של בעלי החיים mTERT-ERneo הטרוזיגוטיים על ידי כתם דרום.
- Mate בעלי החיים mTERT-ERneo הטרוזיגוטיים ובעלי החיים EIIa-Cre למחוק את קלטת NeoR. Mate בעלי החיים הטרוזיגוטיים לC57BL / 6 בעלי חיים ללפחות שלוש פעמים, ובעלי חיים mTERT-ER נוספים בין-גזע הטרוזיגוטיים ליצירת homozygosity.
2. דור של LSL-mTERT אללו
- להציג את נוק-במיקוד וקטור המכיל LoxP - בלם משולש - ניאו - בר LoxP והרצף הגנומי mTERT (בין אקסון אינטרון 1 ו2, איור 1) בתאי הגזע העובריים של עכבר עם electroporation 23.
- תרבות תאי הגזע העובריים בנאומיצין ל6-10 ימים. בחר שיבוטים נאומיצין עמיד ולהרחיב ב -48 צלחות גם. חלץ את הדנ"א הגנומי באמצעות ערכה מסחרית ולאשר את נוק-באלל על ידי כתם דרום 23.
- Injeקווי שני ES ct עם karyotypes הנורמלי מעל 95% לC57BL blastocysts / 6 עם ערכת מיקרומניפולציה תחת מיקרוסקופ הפוכה. שתל blastocysts אל תוך הרחם של אמהות פונדקאיות 23. Mate תעתועים בדרגה גבוהה ממין זכר (70-90%) לC57BL / 6 נקבות.
- לאשר את genotyping של בעלי החיים LSL-mTERT הטרוזיגוטיים על ידי כתם דרום.
- Mate בעלי החיים הטרוזיגוטיים לC57BL / 6 בעלי חיים ללפחות שלוש פעמים, ובעלי החיים LSL-mTERT בין-גזע נוסף הטרוזיגוטיים ליצירת homozygosity.
3. הפעלה מחדש של הטלומרז בmTERT-ER ועכברים LSL-mTERT בVivo
לmTERT-ER
- לעקר את כל הכלים כירורגיים לפני ההזרקה.
- להרדים את העכברים עם תא isoflurane (4% לזירוז, 2% לשמירה) ב 50% (V / V) חמצן / 50% (V / V) תערובת גז חד תחמוצת dinitrogen. או להרדים עכברים על ידי תערובת קטמין-xylazine (100 מ 'g / משקל גוף קילוגרם + 10 מ"ג / קילוגרם משקל גוף).
- לאחר שתושג הרדמה עמוקה, להסיר את החיה המורדמת מתא האינדוקציה, ולשמור על הראש שלהם בתוך הצינור המחובר לתא isoflurane (2%).
- לצבוט את כריות כף הרגל של העכברים כדי להבטיח את החיה מורדמת עמוקה. למרוח משחה על שני העיניים כדי למנוע את העיניים מהתייבשות. נגב את החלק האחורי של העכברים עם פתרון povidone- יוד.
- הזרק את גלולה 4-OHT איטי שחרור עם trochar דיוק (10 G) מתחת לעור של הגב ולדחוף את הכדור כל הדרך אל קו האמצע בין שתי כתפיים.
- לאטום את החתך עם applier קליפ הפצע ולפקח על העכברים להתאוששות מן ההרדמה. הסר את הסרטונים 10 ימים לאחר מכן. חום נוסף אינו הכרחי משום שההליך יסתיים בקרוב.
- תקופת טיפול עם גלולה 4-OHT צריך להיות מותאמת לפי צורך המחקר.
לLSL-mTERT
<ol>4. בידוד של תאי גזע עצביים והפעלה מחדש של הטלומרז במבחנה
- עכברים מורדמים עם פחמן דו חמצני והמוח יוסרו. בצע את הפרוטוקול של ערכת ניתוק רקמה עצבית זמינה מסחרי כמו לכל יצרן.
- Resuspend אבקת lyophilized בבקבוקון שכותרתו 4 פתרון עם 1 מיליליטר של מדיום תרבית תאים לפתרון 4. האם לא מערבולת. פתרון זה אמור להיות aliquoted ומאוחסן ב -20 ° C לשימוש מאוחר יותר.
- Pre-חום התערובת על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות לפני השימוש.
- הפוך אנזים Mix 1: פתרון 1 (50 μl) ופתרון 2 (1,900 μl). הפוך אנזים Mix 2: פתרון 3 (20 μl) ופתרון 4 (10 μl).
- הכן תערובת אנזים 1,950 μl 1 עד 400 רקמות ומערבולת מ"ג. טרום לחמם את התערובת על 37 מעלות צלזיוס במשך15 דקות לפני השימוש.
- קח את מוח עכבר 1 היום, ולשמור forebrains על ידי הסרת נורות חוש הריח והמוח הקטן. שמור את רקמות המוח הקדמי ב 1 מיליליטר של מדיום תרבות הקר מאז פינוי וחנות ב 4 מעלות צלזיוס. הקפד לעבד את הרקמה העצבית בתוך שעה 1.
- לקבוע את המשקל של רקמה לוודא את מגבלת 400 מ"ג לעיכול אין חריגה. מניחים את המוח על המכסה של צלחת פטרי בקוטר 35 מ"מ, ולרסק את המוח באמצעות אזמל.
- באמצעות קצה פיפטה 1 מיליליטר, להוסיף 1 מיליליטר של HBSS (w / o Ca / Mg) והחלקים בחזרה לתוך צינור 15 מיליליטר פיפטה. לשטוף עם HBSS (w / o Ca / Mg). צנטריפוגה ב× גרם 300 למשך 2 דקות בטמפרטורת חדר ולשאוב supernatant בזהירות.
- להוסיף 1,950 μl של תערובת אנזים שחומם מראש 1 (פתרונות 1 ו -2) לרקמת מ"ג עד 400. דגירה בצינור 15 מיליליטר במשך 15 דקות על 37 מעלות צלזיוס, ערבוב על ידי היפוך או טלטול הצינור כל 5 דקות.
- הכן תערובת אנזים 30 μl 2 לדגימה רקמה על ידי הוספת 20 & #956; l של פתרון 3-10 μl של פתרון 4. לאחר מכן להוסיף למדגם. היפוך בעדינות לתערובת. לא מערבולת.
- לנתק את הרקמה באופן מכאני באמצעות פיפטה פסטר רחבה שקצהו, אש המלוטשת על ידי pipetting למעלה ולמטה 10 פעמים לאט. הימנע מיצירת בועות אוויר.
- לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, צינור היפוך כל 3 דקות.
- חזור על השלב 4.11 וצעד 4.12 אם הרקמות גדולות יותר מ -200 מ"ג.
- החל ההשעיה התא למסננת תא 70 מיקרומטר, שהונחה על שפופרת 50 מיליליטר. החל 10 מיליליטר של PBS דרך מסננת תא. בטל מסננת תא והשעית תא צנטריפוגות ב 300 גרם במשך 20 דקות בטמפרטורת חדר. לשאוב supernatant לחלוטין.
- Resuspend תאים עם תאי גזע בינוני עד הנפח הנדרש עבור יישומים נוספים.
- כדי להפעיל הטלומרז בLSL-mTERT NSCs, טיפול בתאים עם 100 מיקרומטר 4-OHT במשך יומיים. כדי להפעיל הטלומרז בmTERT-ER NSCs, לשמור על התאים במדיום תרבות עם 100 מיקרומטר 4-OHT.
5. FISH הטלומרים
- הכן את הכרומוזומים metaphase מהתאים בתרבית.
- לFFPE (פורמלין קבוע ופרפין Embedded) סעיפי רקמות, deparaffinize בקסילן ורעננות סדרת אתנול במשך 5 דקות כל אחד (100%, 90%, 70%, 50% אתנול) וPBS במשך 5 דקות ב.
- פוסט לתקן במתנול: חומצה אצטית (3: 1) במשך 1-2 שעות. מייבשים בסדרת אתנול קר למשך 5 דקות כל אחד (70%, 90%, 100% אתנול) ואוויר יבש. לשטוף ב1x PBS על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
- לפגל כרומוזומים בפורמלין 4% על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות. מייבשים בסדרת אתנול קר 5 דקות כל אחד (70%, 90%, 100% אתנול) ואוויר יבש.
- החל 12 עד 25 μl של תערובת הכלאת PNA לכל שקופית. (תערובת הכלאה: פוראמיד 70%, SSC 0.06x, BSA 0.2%, בדיקות / μl tRNA, 0.5 ng / הטלומרים או centromere μl 0.5 ng)
- לאטום את תלוש לכסות בבטון גומי. preps פוסט-לפגל כרומוזומליות וחתכים רקמה על 80 מעלות צלזיוס למשך 4 מ 'ב. להכליא בטמפרטורת חדר או 37 מעלות צלזיוס במשך 2-4 שעות בתא לח.
- לשטוף בטמפרטורת חדר עם חיץ כביסה דקות 2 x 15. (חיץ לשטוף: פוראמיד 70%, SSC 0.06x, pH 7.2). לשטוף בטמפרטורת חדר 3 x 5 דקות עם PBST. שקופיות Counter-כתם עם DAPI או הקרינה מרחיקות אדומה לבדיקה מיקרוסקופית.
Representative Results
האסטרטגיות ליצירת mTERT-ER העכברי וLSL-mTERT לדפוק באללים תוארו באיור 1 א ו -1 B. באופן ספציפי, LoxP - בלם משולש - ניאו - בר LoxP הוכנס בין אקסון 1 ואקסון 2 של מוקד mTERT ליצור אלל LSL-mTERT. כדי ליצור אלל mTERT-ER, תחום ERT2-LBD במסגרת עם גן mTERT היה מוכנס לתוך N-הסופי של אקסון 1. הראינו כי כאשר הטלומרז היה מחדש זמני בעכברי תפקוד לקוי של הטלומרים תוך התייחסות אליהם עם כדורי 4-OHT במשך 4 שבועות, פנוטיפ ניוונית יכולים להשתפר באיברים רבים כגון המוח (איור 2 א) ואשכים (איור 2). על מנת לקבוע את ההשפעה של הפעלה מחדש telomerase על תאים בתרבית במבחנה, אנחנו מבודדים תאי גזע עצביים (NSCs) מG4 הדור מאוחר LSL-mTERT וG4 mTERTעכברי -er. אנחנו הראיתי שכאשר הטלומרז היה מחדש בNSCs מתפקד הטלומרים, יכולת ההתחדשות העצמית של NSCs גדלה במידה רבה (איור 3 א), ובneurogenesis המבחנה גם היה משופרת באופן משמעותי (איור 3). על מנת לקבוע את ההשפעה של הפעלה מחדש telomerase ביצירת גידולים בהקשר של חוסר תפקוד הטלומרים, שנוצרנו PB-Cre4 PTEN L LSL-mTERT / L (מודל ערמונית גידול) / p53 L L / L L והכספומט - / - mTERT ER / ER (מודל הרתי T-cell lymphoma) קבוצות דור מאוחר. כאשר הטלומרז היה מחדש על ידי הטיפול בטמוקסיפן בעכברים אלה עם הזרקה (איור 4 א) או כדורי 4-OHT במשך 8 שבועות (איור 4), יצירת הגידולים היו מאוד משופר בשני מודל הגידול בערמונית (איור 4 א) ודגם T-cell lymphoma הרתי (
איור 1: (א) mTERT-ER לדפוק באסטרטגיה. טלוויזיה, מיקוד וקטור; WT, אלל סוג בר; KI, לדפוק באלל; LA, זרועו השמאלית; RA, יד ימין; E1, אקסון 1; E2, אקסון 2; ניאו, PGK אמרגן מונע גן עמיד נאומיצין; ER, קולטן אסטרוגן שונה יגנד (ERT2) מחייב תחום; DT, dyphteria גן רעלן. אסטרטגית LSL-mTERT (B) לדפוק ב. טלוויזיה, מיקוד וקטור; WT, אלל סוג בר; KI, לדפוק באלל; LA, זרועו השמאלית; RA, יד ימין; E1, אקסון 1; E2, אקסון 2; ניאו, PGK אמרגן מונע גן עמיד נאומיצין; פקק, שלושה רצפי תחנת תעתיק חוזרים ונשנים; DT, dyphteria גן רעלן.
class = "jove_content" fo: לשמור-together.within-page = "תמיד"> 
איור 2: נציגי נתונים כדי להראות מחדש telomerase קילה פנוטיפים ניווניות של איברי נציג תמונות של מוח (משמאל). ואשכים (מימין) של עכברי G0 וG4 mTERT-ER שטופלו בפלצבו או 4-OHT במשך 4 שבועות. ברים בקנה מידה מצביעים על 50 מיקרומטר. Re-ההדפסה באישור 20. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3:. נציגי נתונים כדי להראות מחדש telomerase משפר התחדשות עצמית וneurogenesis של תאי גזע עצביים במבחנה () נציג תמונות של תאי גזע עצבייםs מבודדת מG4 LSL-mTERT (פנל עליון) וG4 mTERT-ER (פנל תחתון) גדל במדיום בתאי גזע שטופל ברכב או 4-OHT. (ב) נציג תמונות של במבחנה neurogenesis (Tuj1 +) של תאי גזע עצביים המבודדים מG4 mTERT-ER תרבית בינוני בידול (עם 1% FBS) שטופלה ברכב או 4-OHT. ברים בקנה מידה מצביעים על 100 מיקרומטר.
איור 4:. נציגי נתונים כדי להראות מחדש telomerase משפר יצירת גידולים על רקע חוסר היציבות גנומית () נציג תמונות של גידולי ערמונית גזורים מG0 PB-Cre4 PTEN L / p53 L L / L LSL-mTERT +/-, G4 PB- Cre4 PTEN L L p53 / L / L LSL-mTERT- / -, ו- L / p53 L G4 PB-Cre4 PTEN L טופל LSL-mTERT L / L / L בטמוקסיפן. להדפיס מחדש באישור 22. (ב) נציג תמונות של לימפומות T-cell הרתי גזור מG0 כספומט - / - mTERT + / ER, G4 כספומט - / - mTERT ER / ER טופל ברכב, וG4 כספומט - / - mTERT ER / ER טופל ב4- OHT במשך 8 שבועות. ברים בקנה מידה מצביעים על 1 סנטימטר.
איור 5: נציג תמונות של telomeric וFISH centromeric על רקמת עכבר FFPE המוח וmetaphase (הבלעה). אדום מציין DNA, ירוק מציין מכתים הטלומרים, וציאן מציין ceצביעת ntromere. ברים בקנה מידה מצביעים על 1 מ"מ.
Discussion
כאן, אנו מדווחים על הדור של שני אללים הטלומרז עכברי מושרה וכיצד להפעיל מחדש telomerase in vivo ובמבחנה. הצעד הקריטי להפעלה מחודשת של פעילות mTERT-ER הוא לשמור ריכוז מתמשך של טיפול בטמוקסיפן, ולכן אנחנו בוחרים להשתמש כדורים בזמן שחרור 4-OHT מיוצרים על ידי מחקר חדשני של אמריקה. כדורים לשמור שחרור 4OHT ברמת מצב יציבה דם של 1 ng / ml עד 60 ימים. במחקר קודם, שהראינו כי ההפעלה מחדש פעילות הטלומרז עם אסטרטגיה זו הצליחה לשפר פנוטיפים ניווניות כגון תשישות תאי גזע, ירידת ערך של תגובות פגיעה ברקמות וכשל איברים באיברים רבים שנגרמים על ידי הפרעה בתפקוד הטלומרים בG4 mTERT ER / ER עכברים 20.
מלבד לימוד הפונקציה של הטלומרז בהזדקנות, יכולים לשמש גם שני אללים הטלומרז מושרה אלה ללמוד סרטן. מחקרים קודמים לקחויתרון של אללים אלה כדי לחקור את תפקידו של התשה הטלומרים והפעלה מחדש telomerase בעיצוב הגנום ומשפיע על הביולוגיה של לימפומה הרתי T-cell 21 וסרטן הערמונית 22. שני מחקרים אלה הראו כי תפקוד לקוי של הטלומרים בדור מאוחר G4 כספומט - / - mTERT ER / ER וG4 PB-Cre4 PTEN L / p53 L L / L LSL-mTERT L / עכברי L מספק מנגנון תדלוק רכישת אירועי mutagenic המוקדמים ל התחלה של גידול, עדיין מונע התפתחות של גידולים ממאירים באופן מלא. כאשר הטלומרז היה מחדש בהקשר של חוסר יציבות הנוצר על-תפקוד לקוי של הטלומרים הגנומי, מחסומי נזק ל- DNA וחוסר יציבות כרומוזומלית משתולל דוכאו, שאיפשר את ההתקדמות המלאה של גידולים ממאירים עם מאפיינים ביולוגיים חדשים כגון גרורות בעצמות של סרטן הערמונית 21 וחדירת המוח של thymiלימפומה ג 21. תופעות דומות נצפו גם בסוגי הסרטן אחרים, כוללים סרטן מעי גס וסרטן לבלב (תקשורת אישית עם בני הזוג. Haoqiang יינג, האדם Boutin ורונלד DePinho).
כי חלבון טרט-ER ניתן מתג בקלות בין לסירוגין מדינות תלויים אם מטופלים בעלי החיים בטמוקסיפן או כלי רכב, ניתן יהיו לנצל את המודלים של הגידול שנוצרו על ידי אלל mTERT-ER לבדוק טיפול אנטי-הטלומרז. במחקר קודם, גידולים שנוצרו בG4 כספומט - / - בעלי חיים / ER mTERT ER שוחררו מ4-OHT; על דלדול הטלומרז, גידולים התכווצו סופו של דבר בשל החזרת מחסומים הנגרם הפרעה בתפקוד הטלומרים 21. עם זאת, חלק מהגידולים רכשו התנגדות בתגובה להטלומרז הכחדה על ידי הפעלת התארכות אלטרנטיבית של הטלומרים מנגנון (ALT). אפיון נוסף של גידולי ALT + עמיד אלה הראה כי tהיי יש שעתוק חריג של גני המעורבים בביולוגיה של המיטוכונדריה והגנה חמצוני כוללים רגולטור ראשי של הגנת סינתזה וחמצוני המיטוכונדריה PGC-1β. מציאה של PGC-1β או SOD2 (רגולטור נוסף של הגנת חמצוני) מבטלת באופן משמעותי תאי ALT + גידול בזמן לשמור על תאים הטלומרז + גידול להישאר יחסית ללא פגע 21.
מגבלה אחת של שני אללים לדפוק באלה היא שהם יכולים להרשות לעצמם רק הפעלה מחדש של הטלומרז ברמת אנדוגני כי הם נמצאים במוקד יליד הגן הטלומרז. ברוב סוגי הסרטן אנושיים, הטלומרז הוא למעשה ביטוי יתר ברמה הרבה יותר גבוהה. על מנת לשפר את רמת הטלומרז, שינוי אחד אנחנו יכולים לשקול הוא להכניס את מבנה mTERT-ER עם אמרגן חזק כגון PGK אמרגן (kinase phosphoglycerate) למוקד Rosa26.
לסיכום, שני אללים אלה הרומן מושרה עכבריים הטלומרז לספק ז'נה חסרת תקדיםכלים ic ללמוד את הפונקציות של הטלומרז בהזדקנות והומאוסטזיס רקמה, כמו גם את התקדמות הגידול, במיוחד תחת הרקע של חוסר יציבות הנוצר על-תפקוד לקוי של הטלומרים רכש מראש הגנומי. גם אלל mTERT-ER יכול לשמש כדי ללמוד טיפול אנטי-הטלומרז על ידי חצייה לתוך מודלים עכבר גידול מועד אחרים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leica AM6000 Micromanipulation Kit | Leica | Per quote | |
| Leica DMI6000 B inverted microscope | Leica | Per quote | |
| Neomycin | Life technologies | 21810031 | |
| isoflurane vaporizer | Veterinary Anesthesia Systems | 911103 | |
| isoflurane | Henry Schein | 1005796 | |
| ketamine-xylazine mixture | Sigma-Aldrich | K113-10ML | |
| 4-OHT powder | Sigma-Aldrich | H7904-5MG | |
| Tamoxfien | Sigma-Aldrich | T5648-1G | |
| 4-OHT pellet | Innovative Research of America | Custermized | |
| Precision Trochar (10 Gauge) | Innovative Research of America | MP-182 | |
| wound clip applier | Fischer Scientific | 01-804 | |
| clip | Fischer Scientific | 01-804-5 | |
| Neural Tissue Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
| HBSS | Life technologies | 14025092 | |
| PBS | Life technologies | 10010023 | |
| xylene | Fischer Scientific | X3P-1GAL | |
| methanol | Fischer Scientific | A-433S4 | |
| acetic acid | Fischer Scientific | A38-500 | |
| ethanol | Fischer Scientific | 22-032-104 | |
| formamide | Fischer Scientific | F84-1 | |
| PNA telomere probe | Panagene | F1001-5 | |
| PNA centromere probe | Panagene | F3003-5 | |
| 20X SSC | Fischer Scientific | BP1325-4 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2153-10G | |
| tRNA | Sigma-Aldrich | R5636-1ML | |
| Tween 20 | Fischer Scientific | BP337-100 | |
| rubber cement | Walmart | Elmer's | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 |
References
- Bass, A. J., et al. Genomic sequencing of colorectal adenocarcinomas identifies a recurrent VTI1A-TCF7L2 fusion. Nat Genet. 43, 964-968 (2011).
- Beroukhim, R., et al. The landscape of somatic copy-number alteration across human cancers. Nature. 463, 899-905 (2010).
- Blasco, M. A., et al. Telomere shortening and tumor formation by mouse cells lacking telomerase RNA. Cell. 91, 25-34 (1997).
- Lee, H. W., et al. Essential role of mouse telomerase in highly proliferative organs. Nature. 392, 569-574 (1998).
- Rossi, D. J., et al. Deficiencies in DNA damage repair limit the function of haematopoietic stem cells with age. Nature. 447, 725-729 (2007).
- Wong, K. K., et al. Telomere dysfunction and Atm deficiency compromises organ homeostasis and accelerates ageing. Nature. 421, 643-648 (2003).
- Rudolph, K. L., et al. Longevity, stress response, and cancer in aging telomerase-deficient mice. Cell. 96, 701-712 (1999).
- Wong, K. K., et al. Telomere dysfunction impairs DNA repair and enhances sensitivity to ionizing radiation. Nat Genet. 26, 85-88 (2000).
- Ferron, S., et al. Telomere shortening and chromosomal instability abrogates proliferation of adult but not embryonic neural stem cells. Development. 131, 4059-4070 (2004).
- Savage, S. A., Alter, B. P. Dyskeratosis congenita. Hematol Oncol Clin North Am. 23, 215-231 (2009).
- Armanios, M. Syndromes of telomere shortening. Annu Rev Genomics Hum Genet. 10, 45-61 (2009).
- Vulliamy, T., et al. The RNA component of telomerase is mutated in autosomal dominant dyskeratosis congenita. Nature. 413, 432-435 (2001).
- Harley, C. B., Harley, S. W. Telomerase, checkpoints and cancer. Cancer surveys. 29, 263-284 (1997).
- Karlseder, J., Broccoli, D., Dai, Y., Hardy, S., de Lange, T. p53- and ATM-dependent apoptosis induced by telomeres lacking TRF2. Science (New York, N.Y.). 283, 1321-1325 (1999).
- Steensel, B., Smogorzewska, A., de Lange, T. TRF2 protects human telomeres from end-to-end fusions. Cell. 92, 401-413 (1998).
- Chin, L., et al. p53 deficiency rescues the adverse effects of telomere loss and cooperates with telomere dysfunction to accelerate carcinogenesis. Cell. 97, 527-538 (1999).
- Artandi, S. E., et al. Telomere dysfunction promotes non-reciprocal translocations and epithelial cancers in mice. Nature. 406, 641-645 (2000).
- Rudolph, K. L., Millard, M., Bosenberg, M. W., DePinho, R. A. Telomere dysfunction and evolution of intestinal carcinoma in mice and humans. Nat Genet. 28, 155-159 (2001).
- Greenberg, R. A., et al. Short dysfunctional telomeres impair tumorigenesis in the INK4a(delta2/3) cancer-prone mouse. Cell. 97, 515-525 (1999).
- Jaskelioff, M., et al. Telomerase reactivation reverses tissue degeneration in aged telomerase-deficient mice. Nature. 469, 102-106 (2011).
- Hu, J., et al. Antitelomerase therapy provokes ALT and mitochondrial adaptive mechanisms in cancer. Cell. 148, 651-663 (2012).
- Ding, Z., et al. Telomerase reactivation following telomere dysfunction yields murine prostate tumors with bone metastases. Cell. 148, 896-907 (2012).
- Nagy, A. Manipulating the mouse embryo : a laboratory manual. , 3rd Edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2003).
