Abstract
Telomer dysfunktion-induceret tab af genom integritet og dens tilhørende DNA-skader signalering og Checkpoint reaktioner er veletablerede drivere, der forårsager væv degeneration under ældning. Kræft, med incidensrater stærkt stigende med alderen, er præget af korte telomer længder og høj telomerase-aktivitet. For at undersøge roller telomer dysfunktion og telomerase reaktivering i aldring og kræft, protokollen viser, hvordan man kan generere to murine inducerbar telomerase knock-in alleler 4-hydroxytamoxifen (4-OHT) -inducerbare TERT-østrogen-receptor (mTERT-ER) og Lox -Stopper-Lox TERT (LSL-mTERT). Protokollen beskriver procedurerne for at inducere telomer dysfunktion og genaktivere telomeraseaktivitet i mTERT-ER og LSL-mTERT mus in vivo. De repræsentative data viser, at reaktivering af telomerase-aktivitet kan lindre væv degenerative fænotyper induceret af telomer dysfunktion. I ordER for at fastslå virkningen af telomerase reaktivering på tumorigenese, vi genereret prostata tumor model G4 PB-Cre4 PTEN L / L p53 L / L LSL-mTERT L / L og thymus T-celle lymfom model G4 Atm - / - mTERT ER / ER . De repræsentative data viser, at telomerase reaktivering i baggrund af genomisk ustabilitet induceret af telomer dysfunktion kan i høj grad øge tumorigenese. Protokollen beskriver også de procedurer, der anvendes til at isolere neurale stamceller (NSC) fra mTERT-ER og LSL-mTERT mus og genaktivere telomeraseaktivitet i NSC in vitro. De repræsentative data viser, at reaktivering af telomerase kan øge selvfornyelse kapacitet og neurogenese in vitro. Endelig protokollen beskriver procedurerne for udførelse af telomer FISH (fluorescens in situ hybridisering) på både mus FFPE (Formalin Faste og parafFIN indbygget) hjernevæv og metafasekromosomer af dyrkede celler.
Introduction
Telomerase er et enzym ansvarligt for opretholdelse af telomerer. Disse er repetitive sekvenser ved enderne af kromosomer, der beskytter deres integritet. De centrale komponenter af telomerase holoenzymet er en revers transkriptase-katalytiske underenhed (TERT) og en RNA-underenhed (tert), der tjener som template for tilsætning af telomere gentager 1,2. Mens generelt undertrykt i differentierede somatiske celler telomerase udviser robust aktivitet og spiller vigtige roller i kimceller, cancerceller og stamceller.
mTERC og mTERT knockout-mus giver stor in vivo modelsystemer til at studere funktioner telomerase i både stamceller og kræft. Den mTERC og mTERT knockout-mus (G1) viste ingen åbenlyse fænotyper grund af den lange reserve af telomerer i mus 3. Men serielt Krydsning mTERC og mTERT knockout-mus til sent generation (G5-G6) resulterede igradvis erosion af telomerer og til sidst provokeret svær degeneration af stærkt proliferative væv 4. Sen generation (G5-G6) mTERC - / - mus er infertile på grund af de høje apoptose i testikler og kim cellereduktion. G5-G6 mTERC - / - mus også udviser degenerative fænotyper i højt proliferative væv, herunder knoglemarv, tarm og hud på grund af høje apoptose og defekte selvfornyelse kapacitet i væv stamceller / progenitorcelle rum 4. Hæmatopoietiske stamceller i knoglemarven af sene generation mTERC - / - mus udviser tab af proliferativ potentiale, kompromitteret selvfornyelse kapacitet, forbedret apoptose og i sidste ende funktionel udmattelse 5,6. Tilsvarende blev gradvist øget apoptotiske organer i tarm krypter observeret i hver efterfølgende generation af G1-G6 mTERC - / - mus 7,8. THan skadelig virkning af dysfunktionelle telomerer synes ikke at være begrænset til høje omsætning væv da både spredning af voksne neurale stamceller in vitro og neurogenese in vivo blev alvorligt forringet i slutningen generation (G4-G5) mTERC - / - mus 9 . Rolle telomerase i stamceller understøttes yderligere af resultaterne i en sjælden menneskelig genetisk sygdom dyskeratosis congenita (DKC), som på nogle måder ligner tidlig ældning 10,11. DKC er forårsaget af mutationer i tert, TERT, og gener, der koder dyskerin, en kerne telomerase-underenhed og andre dyskerin associerede proteiner 12. I gennemsnit telomerer i DKC patienter er kortere end 99% af aldersmatchede kontroller. Den største sygdommens morbiditet skyldes aplastisk anæmi, som er forårsaget af en defekt ved opretholdelse af hæmatopoietiske stamceller. Andre aspekter af sygdommen, såsom oral leukoplakia, negle dystrofi, psykiske retardatipå, testiklerne atrofi og pulmonale komplikationer alle foreslår forringet funktioner af væv stamceller og stamceller 10, fund i tæt overensstemmelse med dem i slutningen generation af telomerase knockout-mus. DKC patienter er tilbøjelige til myelodysplastisk syndrom og har en øget forekomst af maligne slimhinder neoplasmer. Således mangel af telomerase i humane patienter rekapitulerer manglerne i stamceller funktioner og tumor disposition, som observeres i slutningen generation telomerase knockout-mus.
Korte telomerer og høj telomeraseaktivitet er kendetegnende for kræft. Som normale eller præmaligne celler deler de lave eller fraværende telomerase aktivitet resulterer i eventuel erosion af telomerer og aktivering af cellulære checkpoints ligner dem fremkaldt af DNA dobbeltstrengede-pauser (DSBs) 13. Ligesom klassiske DSBs har telomer dysfunktion blevet vist at inducere p53 og tilhørende cellulære responser, såsom ældning og / eller apoptosis 14,15. Ved mutations inaktivering af p53, er celle cykling og celleoverlevelse forbedret i celler med telomer dysfunktion, som giver en pro-kræftfremkaldende mutator mekanisme præget af translokationer og regionale forstærkninger og sletninger 16,17. Samtidig fortsatte telomer dysfunktion og tilhørende omsiggribende kromosomale ustabilitet (selv i p53 nulceller) synes at begrænse fuld malign progression af sådanne cancerformer. For eksempel sen generation G4-G5 mTERC - / - INK4a / ARF - / - mus viste signifikant reduceret lymfom incidens sammenlignet med INK4a / ARF null mus på grund af telomer nedslidning. I en anden undersøgelse mere avancerede adenomatøs læsioner i G4 mTERT - / - APC min mus blev stærkt undertrykt i sammenligning med APC min mus på grund af en betydelig vækst og apoptose 18,19. Deniagttagelse, at telomer dysfunktion induceret genomisk ustabilitet hæmmer tumorudvikling prompter spekulationer om, at aktivering af telomerase kan muliggøre malign progression delvist ved undertrykke genomisk ustabilitet til et niveau foreneligt med levedygtighed cancercelle og / eller neutraliserende p53-afhængige eller -uafhængige checkpoint mekanismer.
For at undersøge, om telomerase reaktivering kan stoppe eller endog vende aldring af stamceller, og hvorvidt telomerase reaktivering kan fremme tumorigenesis på baggrund af genomisk ustabilitet, vi genererede to inducerbare murine telomerase alleler. Den første er 4-hydroxytamoxifen (4-OHT) -inducerbare TERT-østrogen-receptor (mTERT-ER) fusion knock-in allel. I mangel af 4-OHT, mus homozygote for mTERT-ER (betegnet mTERT ER / ER) er telomeraseaktivitet mangelfuld og opretholde samme cytogenetiske og cellulære fænotyper som konventionel mTERT eller mTert knockout model. Ved 4-OHT behandling, kan TERT-ER proteinaktivitet gendannes til et niveau svarende til det native TERT protein 20, 21. Den anden allel er en roman inducerbart TERT knock-in allel indeholdende en intronisk LoxP-Prop-LoxP kassette (LSL- mTERT); upon Cre-medieret udskæring af LSL, mTERT er re-udtrykkes under endogene udtryk kontrolmekanismer 22.
Protocol
BEMÆRK: Alle trinene i denne protokol er blevet godkendt af UT MD Anderson Cancer Center.
1. Generering af mTERT-ER Allel
- Indfører knock-in targeting vektor indeholdende ERT2-LBD (ligandbindingsdomæne) opstrøms og i ramme med mTERT genomiske sekvens (exon 1 gennem intron 2) og en Lox - PGK - Neo - Lox fragment (figur 1A) i muse-ES-celler med elektroporering.
- Kultur ES-cellerne i neomycin i 6-10 dage. Pick neomycin-resistente kloner og ekspandere i 48 brønds plader. Uddrag det genomiske DNA ved hjælp af et kommercielt kit og bekræfte knock-i allel ved Southern blot.
- Indsprøjtes to ES linjer med over 95% normalt karyotyper i C57BL / 6 blastocyster med mikromanipulering kit under et omvendt mikroskop. Implantere blastocyster i uterus af rugemødre 23. Mate high-grade mandlige kimærer (70-90%) til C57BL / 6 fehanner.
- Bekræft genotypning af heterozygote mTERT-ERneo dyr ved Southern blot.
- Mate de heterozygote mTERT-ERneo dyr og EIIA-Cre dyr at slette NeoR kassette. Mate de heterozygote dyr til C57BL / 6 dyr i mindst tre gange, og yderligere inter-race heterozygote mTERT-ER dyr at generere homozygositet.
2. generation af LSL-mTERT Allele
- Indføre den knock-in targeting vektor indeholdende en LoxP - tredobbelt Prop - Neo - LoxP fragment og mTERT genomiske sekvens (mellem exon 1 og intron 2, figur 1 B) i muse ES-celler med elektroporation 23.
- Kultur ES-cellerne i neomycin i 6-10 dage. Pick neomycin-resistente kloner og ekspandere i 48 brønds plader. Uddrag det genomiske DNA ved hjælp af et kommercielt kit og bekræfte knock-i allel ved Southern blot 23.
- Inject to ES linjer med over 95% normalt karyotyper i C57BL / 6 blastocyster med mikromanipulering kit under et omvendt mikroskop. Implantere blastocyster i uterus af rugemødre 23. Mate high-grade mandlige kimærer (70-90%) til C57BL / 6 hunner.
- Bekræft genotypning af heterozygote LSL-mTERT dyr ved Southern blot.
- Parre heterozygote dyr C57BL / 6 dyr i mindst tre gange, og yderligere mellem racer heterozygote LSL-mTERT dyr at generere homozygocitet.
3. Reaktivering af Telomerase i mTERT-ER og LSL-mTERT mus in vivo
For mTERT-ER
- Steriliser alle de kirurgiske redskaber før injektionen.
- Bedøve musene med isofluran kammer (4% til induktion, 2% til opretholdelse) i 50% (v / v) oxygen / 50% (v / v) dinitrogen monoxide gasblanding. Eller bedøver mus ved en ketamin-xylazin-blanding (100 mg / kg legemsvægt + 10 mg / kg legemsvægt).
- Efter dyb anæstesi er nået, skal du fjerne den bedøvede dyr fra induktion kammeret, og holde hovedet inde i røret er forbundet til isofluran kammer (2%).
- Klem klæbepuderne af mus for at sikre, at dyret er dybt bedøvet. Sæt salve på begge øjne for at forhindre øjnene mod udtørring. Tør bagsiden af mus med povidon-iod-opløsning.
- Injicer langsomt frigiver 4-OHT pellet med præcision trokar (10 G) under huden på ryggen og skubbe pillen hele vejen til midterlinjen mellem to skuldre.
- Forsegl snittet med sår klemmeapplikator og overvåge mus til nyttiggørelse fra anæstesi. Fjern den 10 dage senere. Supplerende varme er ikke nødvendig, fordi proceduren er afsluttet inden længe.
- Periode af behandling med 4-OHT pellet bør optimeres i overensstemmelse med formålet med undersøgelsen.
For LSL-mTERT
<ol>4. Isolering af neurale stamceller og genaktivering af Telomerase in vitro
- Mus aflives med kuldioxid, og hjernerne fjernes. Følg protokollen af kommercielt tilgængelige nervevæv dissociation kit per producent.
- Resuspender det frysetørrede pulver i hætteglasset mærket Løsning 4 med 1 ml cellekultur medium for Solution 4. Undlad at slynge. Denne opløsning bør derefter i portioner og opbevaret ved -20 ° C til senere brug.
- Pre-Opvarm blandingen ved 37 ° C i 15 minutter før brug.
- Gør Enzyme Mix 1: Opløsning 1 (50 pi) og Opløsning 2 (1.900 pi). Gør Enzyme Mix 2: Løsning 3 (20 pi) og Løsning 4 (10 pi).
- Forbered 1.950 pi enzym mix 1 for op til 400 mg væv og vortex. Pre-opvarm blandingen ved 37 ° C i15 minutter før brug.
- Tag de 1-dags mus hjerner, og holde forebrains ved at fjerne de olfaktoriske pærer og lillehjernen. Hold forhjernen væv i 1 ml kold dyrkningsmedium da fjernelse og butik i 4 ° C. Sørg for at behandle neurale væv inden for 1 time.
- Bestem vægten af væv for at sikre 400 mg grænse pr fordøjelse det ikke overskrides. Placer hjernen på låget af en 35 mm diameter petriskål, og knuse hjernen ved hjælp af en skalpel.
- Ved hjælp af en 1 ml pipettespids, tilsættes 1 ml HBSS (w / o Ca / Mg) og pipettespidser stykker tilbage i et 15 ml rør. Skyl med HBSS (w / o Ca / Mg). Der centrifugeres ved 300 x g i 2 minutter ved stuetemperatur og aspireres supernatanten omhyggeligt.
- Tilføj 1.950 pi forvarmet enzymblanding 1 (opløsninger 1 og 2) pr op til 400 mg væv. Der inkuberes i 15 ml rør i 15 minutter ved 37 ° C, blanding ved at vende eller ryste røret hver 5 min.
- Forbered 30 pi enzymblanding 2 pr vævsprøve ved tilsætning af 20 & #956; l opløsning 3 til 10 pi opløsning 4. Tilsæt derefter til prøven. Vend forsigtigt for at blande. Undlad at slynge.
- Dissociér væv mekanisk ved hjælp af en bred spids, flammepoleret Pasteur-pipette ved pipettering op og ned 10 gange langsomt. Undgå dannelse af luftbobler.
- Der inkuberes ved 37 ° C i 10 minutter, vende røret hver 3 min.
- Gentag trin 4.11 og trin 4.12 hvis væv er større end 200 mg.
- Påfør cellesuspensionen til en 70 um cellefilter, placeret på en 50 ml rør. Påfør 10 ml PBS gennem cellefilter. Kassér cellefilter og centrifugeres cellesuspensionen ved 300 g i 20 minutter ved stuetemperatur. Aspirer supernatanten fuldstændig.
- Resuspender celler med stamcelle medium til det nødvendige volumen for yderligere ansøgninger.
- For at aktivere telomerase i LSL-mTERT NSC, behandle cellerne med 100 uM 4-OHT i to dage. For at aktivere telomerase i mTERT-ER NSC, holde cellerne i dyrkningsmedium med 100 uM 4-OHT.
5. telomer FISH
- Forbered metafasekromosomer fra dyrkede celler.
- For FFPE (fikseret i formalin og indlejret i paraffin) vævssnit, afparaffiniser i xylen og rehydrere i ethanol serie i 5 minutter hver (100%, 90%, 70%, 50% ethanol) og PBS i 5 min.
- Post-fix i methanol: eddikesyre (3: 1) for 1-2 timer. Dehydrer i kold ethanol serie for 5 minutter hver (70%, 90%, 100% ethanol) og lufttørre. Vask i 1x PBS ved 37 ° C i 5 minutter.
- Denaturer kromosomer i 4% formaldehyd ved 37 ° C i 2 min. Dehydrer i kold ethanol serie 5 min hver (70%, 90%, 100% ethanol) og lufttørre.
- Anvend 12 til 25 pi af PNA-hybridisering blandingen til hvert objektglas. (Hybridiseringsblanding: 70% formamid, 0.06x SSC, 0,2% BSA, 0,5 ng / pl tRNA, 0,5 ng / pl telomer eller centromerfusioner sonder)
- Forsegl dækglasset med gummi cement. Post-denaturere kromosomale preps og vævssnit ved 80 ° C i 4 mi. Hybridiser ved stuetemperatur eller 37 ° C i 2-4 timer i fugtigt kammer.
- Vask ved stuetemperatur med vaskepuffer 2 x 15 min. (Wash buffer: 70% formamid, 0.06x SSC, pH 7,2). Vask ved stuetemperatur 3 x 5 min med PBST. Counter-plet lysbilleder med DAPI eller langt-rød fluorescens til mikroskopisk undersøgelse.
Representative Results
De strategier til at generere murine mTERT-ER og LSL-mTERT knock-in alleler blev beskrevet i figur 1A og 1B. Specifikt en LoxP - tredobbelt Prop - Neo - LoxP fragment blev indsat mellem exon 1 og exon 2 af mTERT locus for at generere LSL-mTERT allel. For at generere mTERT-ER-allel blev ERT2-LBD domæne i ramme med mTERT-genet indsat i den N-terminale ende af exon 1. Vi viste, at når telomerase blev transient reaktiveret i telomer dysfunktion mus ved at behandle dem med 4-OHT pellets til 4 uger, kunne degenerative fænotype lindres i flere organer, såsom hjernen (figur 2A) og testikler (figur 2B). For at fastslå virkningen af telomerase reaktivering på celler dyrket in vitro, vi isolerede neurale stamceller (NSC) fra sen generation G4 LSL-mTERT og G4 mTERT-er Mus. Vi viste, at når telomerase blev reaktiveret i telomer dysfunktionelle NSC blev selvfornyelse evne NSC stærkt forøget (figur 3A), og in vitro neurogenese blev også væsentligt forbedret (figur 3B). For at fastslå virkningen af telomerase reaktivering på tumorigenese i forbindelse med telomer dysfunktion, vi genererede PB-Cre4 PTEN L / L p53 L / L LSL-mTERT L / L (prostata tumor model) og ATM - / - mTERT ER / ER (thymus T-celle lymfekræft model) sent generation kohorter. Når telomerase reaktiveret ved tamoxifen behandling i disse mus med injektion (figur 4A) eller 4-OHT pellets i 8 uger (figur 4B), blev tumorigenese stærkt forøget i både prostata tumor model (figur 4A) og thymus T-celle lymfom modellen (
Figur 1: (A) mTERT-ER knock-strategi. TV, targeting vektor; WT, vildtype allel; KI, knock-i-alleler LA, venstre arm; RA, højre arm; E1, exon 1; E2, exon 2; neo, PGK-promotor-drevet neomycin-resistent gen; ER, modificeret østrogenreceptor (ERT2) ligandbindingsdomæne; DT, dyphteria toksingen. (B) LSL-mTERT knock-strategi. TV, targeting vektor; WT, vildtype allel; KI, knock-i-alleler LA, venstre arm; RA, højre arm; E1, exon 1; E2, exon 2; neo, PGK-promotor-drevet neomycin-resistent gen; STOPPER, tre repetitive transkriptionelle stop-sekvenser; DT, dyphteria toksingen.
Figur 2: Repræsentative data til at vise telomerase reaktivering mildner degenerative fænotyper af organer Repræsentative billeder af hjerner (til venstre). og testikler (til højre) for G0 og G4 mTERT-er mus behandlet med placebo eller 4-OHT i 4 uger. Scale søjler angiver 50 pm. Re-print med tilladelse fra 20. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 3:. Repræsentative data til at vise telomerase reaktivering øger selv-fornyelse og neurogenese af neurale stamceller in vitro (A) Repræsentative billeder af neurale stamcellers isoleret fra G4 LSL-mTERT (øverste panel) og G4 mTERT-ER (nederste del) vokser i stamceller medium behandlet med vehikel eller 4-OHT. (B) Repræsentative billeder af in vitro neurogenese (TUJ1 +) af neurale stamceller isoleret fra G4 mTERT-ER dyrket i differentiering medium (med 1% FBS) behandlet med vehikel eller 4-OHT. Scale søjler angiver 100 um.
Figur 4:. Repræsentative data til at vise telomerase reaktivering øger tumorigenesis på baggrund af genomisk instabilitet (A) Repræsentative billeder af prostata tumorer dissekeret fra G0 PB-Cre4 PTEN L / L p53 L / L LSL-mTERT +/-, G4 PB- Cre4 PTEN L / L p53 L / L LSL-mTERT- / -, Og G4 PB-Cre4 PTEN L / L p53 L / L LSL-mTERT L / L behandlet med tamoxifen. Re-print med tilladelse fra 22. (B) Repræsentative billeder af thymiske T-celle lymfomer dissekeret fra G0 Atm - / - mTERT + / ER, G4 Atm - / - mTERT ER / ER behandlet med vehikel, og G4 Atm - / - mTERT ER / ER behandlet med 4- OHT i 8 uger. Scale søjler angiver 1 cm.
Figur 5: Repræsentative billeder af telomert og centromere Fisk på FFPE mus hjernevæv og metafase (indsat). Rød indikerer DNA, grøn indikerer telomer farvning, og cyan indikerer centromere farvning. Scale søjler angiver 1 mm.
Discussion
Her rapporterer vi genereringen af to inducerbare murine telomerase alleler, og hvordan at genaktivere telomerase in vivo og in vitro. Den kritiske trin for reaktivering mTERT-ER-aktivitet er at holde en konstant koncentration af tamoxifen, så vi vælger at bruge 4-OHT tid-frigivelse pellets fremstillet af Innovative Research of America. Pelleterne holde frigive 4OHT ved en steady state blodniveau af 1 ng / ml i op til 60 dage. I en tidligere undersøgelse, viste vi, at reaktivering telomeraseaktivitet med denne strategi var i stand til forbedring af degenerative fænotyper såsom stamceller udmattelse, svækkelse af væv skade reaktioner og organsvigt i flere organer, som blev fremkaldt af telomer dysfunktion i G4 mTERT ER / ER mus 20.
Andre end at studere funktionen af telomerase i aldring, kan disse to inducerbare telomerase alleler også anvendes til at studere cancer. Tidligere undersøgelser togfordel af disse alleler at udforske den rolle, telomer nedslidning og telomerase reaktivering i udformningen genomer og påvirker biologi T-celle thymus lymfom 21 og prostatakræft 22. Disse to undersøgelser viste, at telomer dysfunktion i slutningen generation G4 Atm - / - mTERT ER / ER og G4 PB-Cre4 PTEN L / L p53 L / L LSL-mTERT L / L-mus giver en mekanisme næring erhvervelsen af tidlige mutagene begivenheder for tumor initiering, men forhindre progression af fuldt maligne tumorer. Når telomerase reaktiveret i forbindelse med telomer dysfunktion induceret genomisk ustabilitet, DNA damage checkpoints og omsiggribende kromosomale ustabilitet blev undertrykt, hvilket tillod fuldstændig progression af maligne tumorer med nye biologiske egenskaber, såsom knoglemetastaser af prostatacancer 21 og hjerne infiltration af Thymic lymfom 21. Lignende fænomener blev også observeret i andre kræfttyper, herunder tyktarmskræft og kræft i bugspytkirtlen (personlig kommunikation med Drs. Haoqiang Ying, Adam Boutin og Ronald DePinho).
Fordi TERT-ER-protein let kan skiftes mellem tændt og slukket tilstande afhængig af, om dyrene behandlet med tamoxifen eller et køretøj, kan tumormodeller genereret af mTERT-ER allel udnyttes til at teste anti-telomerase terapi. I tidligere undersøgelse, tumorer genereres i G4 Atm - / - mTERT ER / ER dyr blev frigivet fra 4-OHT; på telomerase udtynding, tumorer til sidst faldt på grund af genindsættelse af telomer dysfunktion-induceret checkpoints 21. Men nogle af tumorerne erhvervede resistens i respons på telomerase-udslettelse ved at aktivere et alternativt forlængelse af Telomerer (ALT) mekanisme. Yderligere karakterisering af disse ALT + tumorer viste, at they har afvigende transskription af gener involveret i mitokondrie biologi og oxidativ forsvar, herunder en master regulator af mitokondrie syntese og oxidativ forsvar PGC-1β. Knockdown af PGC-1β eller SOD2 (en anden regulator af oxidativ forsvar) signifikant fjerner ALT + tumorceller, mens holde telomerase + tumorceller forbliver relativt intakt 21.
En begrænsning af disse to knock-in alleler er, at de kun kan tillade reaktivering af telomerase på endogent niveau, fordi de er i det native locus af telomerase-genet. I de fleste humane kræftformer, er telomerase faktisk overudtrykt på et langt højere niveau. For at øge niveauet af telomerase, en modifikation kan vi overveje, er at indsætte mTERT-ER-konstruktion med en stærkere promotor, såsom PGK (phosphoglyceratkinase) -promotor i Rosa26 locus.
Afslutningsvis disse to hidtil ukendte inducerbare murine telomerase alleler giver hidtil uset Genetic værktøjer til at studere funktioner telomerase i aldring og vævshomeostase samt tumorprogression, især under baggrund af præ-erhvervet telomer dysfunktion induceret genomisk ustabilitet. Den mTERT-ER allel kan også anvendes til at studere anti-telomerase behandling ved passage i andre tumor-tilbøjelige musemodeller.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leica AM6000 Micromanipulation Kit | Leica | Per quote | |
| Leica DMI6000 B inverted microscope | Leica | Per quote | |
| Neomycin | Life technologies | 21810031 | |
| isoflurane vaporizer | Veterinary Anesthesia Systems | 911103 | |
| isoflurane | Henry Schein | 1005796 | |
| ketamine-xylazine mixture | Sigma-Aldrich | K113-10ML | |
| 4-OHT powder | Sigma-Aldrich | H7904-5MG | |
| Tamoxfien | Sigma-Aldrich | T5648-1G | |
| 4-OHT pellet | Innovative Research of America | Custermized | |
| Precision Trochar (10 Gauge) | Innovative Research of America | MP-182 | |
| wound clip applier | Fischer Scientific | 01-804 | |
| clip | Fischer Scientific | 01-804-5 | |
| Neural Tissue Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
| HBSS | Life technologies | 14025092 | |
| PBS | Life technologies | 10010023 | |
| xylene | Fischer Scientific | X3P-1GAL | |
| methanol | Fischer Scientific | A-433S4 | |
| acetic acid | Fischer Scientific | A38-500 | |
| ethanol | Fischer Scientific | 22-032-104 | |
| formamide | Fischer Scientific | F84-1 | |
| PNA telomere probe | Panagene | F1001-5 | |
| PNA centromere probe | Panagene | F3003-5 | |
| 20X SSC | Fischer Scientific | BP1325-4 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2153-10G | |
| tRNA | Sigma-Aldrich | R5636-1ML | |
| Tween 20 | Fischer Scientific | BP337-100 | |
| rubber cement | Walmart | Elmer's | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 |
References
- Bass, A. J., et al. Genomic sequencing of colorectal adenocarcinomas identifies a recurrent VTI1A-TCF7L2 fusion. Nat Genet. 43, 964-968 (2011).
- Beroukhim, R., et al. The landscape of somatic copy-number alteration across human cancers. Nature. 463, 899-905 (2010).
- Blasco, M. A., et al. Telomere shortening and tumor formation by mouse cells lacking telomerase RNA. Cell. 91, 25-34 (1997).
- Lee, H. W., et al. Essential role of mouse telomerase in highly proliferative organs. Nature. 392, 569-574 (1998).
- Rossi, D. J., et al. Deficiencies in DNA damage repair limit the function of haematopoietic stem cells with age. Nature. 447, 725-729 (2007).
- Wong, K. K., et al. Telomere dysfunction and Atm deficiency compromises organ homeostasis and accelerates ageing. Nature. 421, 643-648 (2003).
- Rudolph, K. L., et al. Longevity, stress response, and cancer in aging telomerase-deficient mice. Cell. 96, 701-712 (1999).
- Wong, K. K., et al. Telomere dysfunction impairs DNA repair and enhances sensitivity to ionizing radiation. Nat Genet. 26, 85-88 (2000).
- Ferron, S., et al. Telomere shortening and chromosomal instability abrogates proliferation of adult but not embryonic neural stem cells. Development. 131, 4059-4070 (2004).
- Savage, S. A., Alter, B. P.
- Armanios, M.
- Vulliamy, T., et al. The RNA component of telomerase is mutated in autosomal dominant dyskeratosis congenita. Nature. 413, 432-435 (2001).
- Harley, C. B., Harley, S. W.
- Karlseder, J., Broccoli, D., Dai, Y., Hardy, S., de Lange, T. p53- and ATM-dependent apoptosis induced by telomeres lacking TRF2. Science (New York, N.Y.). 283, 1321-1325 (1999).
- Steensel, B., Smogorzewska, A., de Lange, T. TRF2 protects human telomeres from end-to-end fusions. Cell. 92, 401-413 (1998).
- Chin, L., et al. p53 deficiency rescues the adverse effects of telomere loss and cooperates with telomere dysfunction to accelerate carcinogenesis. Cell. 97, 527-538 (1999).
- Artandi, S. E., et al. Telomere dysfunction promotes non-reciprocal translocations and epithelial cancers in mice. Nature. 406, 641-645 (2000).
- Rudolph, K. L., Millard, M., Bosenberg, M. W., DePinho, R. A. Telomere dysfunction and evolution of intestinal carcinoma in mice and humans. Nat Genet. 28, 155-159 (2001).
- Greenberg, R. A., et al. Short dysfunctional telomeres impair tumorigenesis in the INK4a(delta2/3) cancer-prone mouse. Cell. 97, 515-525 (1999).
- Jaskelioff, M., et al. Telomerase reactivation reverses tissue degeneration in aged telomerase-deficient mice. Nature. 469, 102-106 (2011).
- Hu, J., et al. Antitelomerase therapy provokes ALT and mitochondrial adaptive mechanisms in cancer. Cell. 148, 651-663 (2012).
- Ding, Z., et al. Telomerase reactivation following telomere dysfunction yields murine prostate tumors with bone metastases. Cell. 148, 896-907 (2012).
- Nagy, A. Manipulating the mouse embryo : a laboratory manual. , 3rd Edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2003).
