Abstract
דלקת כבד כתגובה לפציעה היא תהליך דינמי מאוד מעורב החדירה של סוגים נבדלים של לויקוציטים כוללים מונוציטים, נויטרופילים, תת תא T, תאי B, רוצח טבעי (NK) ותאי NKT. מיקרוסקופיה Intravital של הכבד לניטור נדידת תאים חיסוני היא מאתגרת במיוחד בשל הדרישות גבוהות לגבי הכנת מדגם וקיבעון, רזולוציה אופטית והישרדות של בעלי חיים לטווח ארוך. עם זאת, הדינמיקה של תהליכים דלקתיים כמו גם מחקרי אינטראקציה סלולריים יכולה לספק מידע קריטי להבין ייזום, ההתקדמות ונסיגה של מחלת כבד דלקתית טוב יותר. לכן, שיטה רגישה והאמינה ביותר הוקמה כדי ללמוד הגירה ותא-תא-אינטראקציות של תאי חיסון שונים בכבד עכבר על פני תקופות ארוכות (כ -6 שעות) על ידי מיקרוסקופ שני הפוטונים intravital סריקת לייזר (TPLSM) בשילוב עם טיפול נמרץ ניטור.
אף אוזן גרון "> השיטה סיפקה כוללת הכנה עדינה וקיבוע יציב של הכבד עם ההפרעות מינימליות של האיבר; הדמיה intravital ארוכת טווח באמצעות מיקרוסקופ multiphoton ססגוניות עם כמעט ללא photobleaching או תופעות phototoxic על פני תקופה של עד 6 שעות זמן, המאפשרת מעקב של תת ספציפיים לויקוציטים; ותנאי הדמיה יציבים בשל ניטור המקיף של פרמטרים חיוניים עכבר וייצוב של זרימה, טמפרטורה וחילוף גזים.לחקור הגירת הלימפוציטים על דלקת כבד CXCR6.gfp לדפוק בעכברים היו נתונים להדמית כבד intravital בתנאי מחקר ולאחר פגיעה בכבד אקוטית וכרונית הנגרמת על ידי הזרקת intraperitoneal (ים) של פחמן טטרא (4 CCL).
CXCR6 הוא קולט chemokine הביע בלימפוציטים, בעיקר על הטבעי Killer T (NKT) -, רוצח טבעי (NK) - associ רירית ותת קבוצות של לימפוציטים מסוג T כגון תאי CD4 T, אלא גםשמורת ated תאים (MAIT) T 1. בעקבות הדפוס נודד ומיצוב של CXCR6.gfp + תאי חיסון אפשר תובנה מפורטת להתנהגותם המשתנית שלהם על פגיעה בכבד, ולכן מעורבות הפוטנציאל שלהם בהתקדמות מחלה.
Introduction
ההדמיה של תאים ותפקודים תאיים בכל איברים או אפילו כל יצורים הייתה עניין רב במשך יותר מ -50 שנים, הכוללת כמעט את כל חלקי הגוף 2. לכן, חלק מהמחקרים המוקדמים כבר בהדמית intravital של הכבד 3,4. עם זאת, יש מספר מגבלות קיימות מעודכנים לגבי הדמיה ברזולוציה גבוהה יציבה לטווח הארוך של רקמת כבד.
בשל המיקום האנטומי של הכבד בקשר הדוק עם הסרעפת ומערכת עיכול 5, הבעיה הנפוצה ביותר להדמיה מיקרוסקופית intravital היא תנועה בשל נשימה ו, ובמידה פחותה, נפיחה של המעי 6. בהשוואה לאיברים מוצקים אחרים, ניתוח בכבד הוא מאתגר במיוחד. בשל מבנה כלי הדם הצפוף, מניפולציה כירורגית יכולה להוביל לנגעים מדממים מסיביים, זרימת דם לקוי 7 וגם הפעלה של תושב iתאי mmune כגון תאי Kupffer 8. לכן, קיבעון מכאני של הרקמה כפי שפורסם במקום אחר 6,9 עלול להפריע להדמיה מיקרוסקופית intravital.
בכבד בריא, 10-15% מכלל נפח הדם שוכנים בתוך כלי הדם בכבד, והאיבר מקבל כ -25% מתפוקת הלב הכוללת של 10, טיוח האיבר רגיש מאוד לשינויים במחזור הדם (למשל, תנודות בלחץ הדם ). לכן, שיבושים בזרימת דם בכבד עקב למשל, מאמץ גזירה, עקירה, פגיעה על ידי טיפול ברקמה מוגזם או מחזור מרכזי יובילו לשינויים מלאכותיים בהתנהגות נדידה לויקוציטים, חמצון כבד פגום ונזק כבד ולכן עוד יותר, המשפיעים על תגובה חיסונית בכבד, כמו גם כשימור איברים וזמן חיים כולל של בעלי החיים.
מחקרים מיקרוסקופיים מוקדמים התבססו על מיל epifluorescence intravitalcroscopy, אבל כמה אילוצים טכניים כגון הלבנת תמונה ועומק חדירה נמוכה להגביל את השימוש בטכניקה זו להדמיה כבד לטווח ארוך 4,11,12. עם התפתחותה של מיקרוסקופיה multiphoton בשנת 1990, את המגבלות של הלבנת תמונה או עומק חדירה נפתרו בעיקר, כשיטת חדשה זו הייתה מבחינה טכנית מסוגלת לבצע בדיקות הדמיה כמעט בכל האיברים תחת מצבים בחיים אמיתיים 13-15. עם זאת, האתגרים העיקריים שנותרו פתוחים בנוגע להדמית כבד היו: תנועות נשימה, autofluorescence של רקמת כבד, הבטחת זרימת דם ללא שינוי בsinusoids הכבד, והדמיה יציבה במיוחד לתקופות ארוכות יותר של מספר שעות 16.
למרות שמספר מחקרים התייחסו לפונקציה וההגירה של לויקוציטים השונים בכבד 17, למשל, NKT-תאים 18-20, תאי T 21,22, מקרופאגים כבד 23,24 או נויטרופילים 25, מ 'multiphoton לטווח ארוךההדמיה icroscopy עדיין לא נוצרה בהצלחה, משימה מאתגרת יותר אפילו בבעלי חיים עם מחלת כבד אקוטית או כרונית עקב הנזק הקיים ורגישות גבוהה יותר ולכן לפגיעה נוספת 26. עם זאת, ניטור התנהגות נדידה ותפקוד תאי של לויקוציטים בכבד בזמן אמת מאפשר תובנות רומן בתפקיד המסוים שלהם בהומאוסטזיס כבד ומחלות 27.
CXCR6 קולט chemokine באה לידי ביטוי בכמה תת-רכיבי הלימפוציטים, כוללים רוצח טבעי (NK) תאים, תאי NKT וכמה אוכלוסיות תאי T 18,28. מחקרים קודמים בעכברים הראו כי CXCR6 וCXCL16 יגנד המקור שלה יכולים לשלוט הסיורים של תאי NKT על sinusoids הכבד במהלך הומאוסטזיס. כתוצאה מכך, השימוש בעכברי CXCR6.gfp (ביצוע נוק-בחלבון פלואורסצנטי ירוק [GFP] של במוקד CXCR6) תוארו לחקור את ההגירה של לימפוציטים באיברים שונים כגון מוח 29וגם כבד 18,20, מראה עליית חדירה של תאי CXCR6.gfp על דלקת.
בשיטה שנקבעה במחקר זה ניתן היה לעקוב אחר תהליכים אלה על פני תקופה ארוכה של זמן בתנאים התייצבו. הליך multiphoton intravital מבוסס אפשר הדמיה שהייתה מאוד לשחזור עם ההפרעות מינימליות של בעלי החיים והאיברים; מותאם להישרדות של בעלי חיים לטווח ארוך על ידי ניטור נרחב אחריו שליטה הדוקה של נשימה ומחזור דם; וגמישים וקלים מאוד לאמץ גם לאיברי parenchymal אחרים כגון כליות או טחול.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: הניסויים בוצעו בהתאם לחקיקה המסדירה הגרמנית מחקרים בבעלי החיים הבאים "המדריך לטיפול ושימוש בחי מעבדה" (NIH פרסום, מהדורת 8, 2011) וההוראה 2010/63 / האיחוד האירופי על ההגנה על בעלי החיים משמש למטרות מדעיות (כתב עת הרשמית של האיחוד האירופי, 2010). אישור רשמי ניתנה ממשרד הטיפול בבעלי החיים ושימוש הממשלתי (LANUV Nordrhein-Westfalen, רקלינגהאוזן, גרמניה).
הערה: צעדים שניתן להשמיט הדמיה לטווח קצר (למשל יריות הצמד, ערימות 3-D או גם מיקרוסקופיה זמן לשגות זמן קצר) מסומנות בכוכבית (*) כדי לקצר את זמן הכנה ולפשט את הפרוטוקול כירורגית. הדמיה יכולה גם להתבצע ללא בקרת ניטור ומחזור נרחבת במידת צורך, עם זאת, זמן הישרדות יופחת במידה ניכרת.
1. הגדרת מיקרוסקופ וטרום ניתוח הכנה (5-10 ק"מn)
- מערכת מתג (מיקרוסקופ, מעבדה כוח, לייזר, כרית חימום, תא האקלים, מצלמת אינטרנט, מכשיר משאבת מזרק, הנשמה).
- חבר O 2 אספקה לIsoflurane החמקן ורמת Isoflurane מוגדרת 1.5% כרך (V / V), להתחבר למכונת הנשמה חיה קטנה.
- הדמיה לטווח קצרה, לשמור על ההרדמה באמצעות isoflurane רק לאחר האינדוקציה ההרדמה ip הראשונית (ראה שלב 2.2). לאחר מכן, השתמש 2% כרך (V / V) Isoflurane, ולשמור על זמן ההדמיה מתחת ל -2 שעות כדי להבטיח זרימת דם בכבד יציבה.
- הגדר נשימה ל120-140 מחזורי נשימה / min בהיקף של 150-200 μl.
- הגדר את שלב agarose העכבר. הכן של 3% (w / v) agarose 100 מיליליטר, לשפוך אותו לתוך צלחת (כ 10 סנטימטרים x 15 סנטימטרים בסיס) בזווית של 40 מעלות.
- הגדר את אזור ניתוח עבודת איסוף המכשור הנדרש. כדי למנוע זיהום חיידקים, חיטוי מכשירים באמצעות פתרון 1% מSekusept Forte S (9.9% w / v), Glutaral 9.8% w / v, פורמלדהיד ל5 דקות לפני הניסוי (איור 1 א).
- להשיג רכיבים שנותרו: חיטוי עור (לדוגמא, תמיסת יוד povidone 10%), שלב כבד (ערימות וגשר), פתרון agarose (3% (w / v) בPBS), משאבת מזרק עם 5% (w v /) פתרון גלוקוז (G-5), משאבת מזרק עם חומר הרדמה ש( מ"ג קטמין 0.1 / מיליליטר, מ"ג Xylazine 0.5 / מיליליטר, 5 מיקרוגרם / מיליליטר פנטניל), צמר גפן, n-בוטיל-2-Cyanoacrylat, ו1x PBS. שים צלחת שלב agarose לתוך תא דגירה לחימום מוקדם.
2. קנה (10-15 דקות)
- השתמש C57BL / 6 עכברים ברביית בית במשקל 25-28 גרם. בית העכברים בתנאי הפתוגן ללא ספציפיים בהתאם להנחיות FELASA, לטמפרטורת סביבה ולחות מבוקרת עם hr אור 12 / מחזור כהה 12 שעות. לאפשר גישה חופשית לבעלי חיים תזונה סטנדרטית עכברים (דיאט מכרסם רגיל לרחרח) וכרצונך מים.
- להרדים את העכבר על ידי initintraperitoneal ial הזרקה (IP) של 250 μl של ההרדמה II (קטמין 0.1 מ"ג / מיליליטר, מ"ג Xylazine 1 / מיליליטר, עצירות 10 מיקרוגרם / מיליליטר).
- * לתחזוקה במהלך ההדמיה intravital, ברציפות לנהל הרדמה אני בזריקת ip רציפה (מ"ג קטמין 0.1 / מיליליטר, מ"ג Xylazine 0.5 / מיליליטר, פנטניל 5 מיקרוגרם / מיליליטר) באמצעות מכשיר משאבת מזרק עם קצב זרימה של 0.2 מיליליטר / שעה ב שילוב עם% כרך inhalative isoflurane 0.5 (V / V).
- בדוק את הרפלקסים לאחר 5 דקות (לדוגמא כרית כף רגל קמצוץ עם מלקחיים), לחטא את העור לtracheotomy, להתחיל הכנה אם עכבר נמצא במצב הרדמה כירורגית סובלני.
- החל קרם עיני מגן (לדוגמא, Dexpanthenol 50 מ"ג / g) כדי למנוע קרנית מפני התייבשות (איור 1).
- לקבע עכבר על שולחן הכנה חושף צד הגחוני באמצעות נייר דבק לגפיים; בעדינות להתמתח יתר על מידת צוואר, לקבע בתנוחה זו, למשל., על ידי שימוש בגומיית מכור to החותכות.
- לחטא את עור ופרווה באמצעות תמיסת יוד povidone, על ידי יישום חומר חיטוי עם מקלון צמר גפן.
- לבצע חתך בעור ראשוני (סנטימטר אורך 0.5-1) ישירות מתחת לסנטר (איור 1 ג)
- בזהירות לנתח רקמות חיבור בין בלוטות רוק (1D איור).
- לקרוע זהירות קנה הנשימה צינור המקיף את שרירים פתוחים (איור 1E, F).
- מניחים חוט כירורגי מתחת לקנה הנשימה לקיבוע צינור האוורור מאוחר יותר (איור 1G).
- קנה נשימה פתוחה עם מיקרו מספריים בין טבעות סחוס ביצוע חתך בצורת T (איור 1H)
- מניחים צינור אוורור לקנה נשימה דרך החתך (~ 0.5 סנטימטרים). לדחוף את הצינור קדימה, לתפוס סוף הזנב עם מלקחיים אנטומיים קטנים ובעדינות לקדם את הצינור לתוך קנה הנשימה (איור 1 ט)
- לקבע צינור עם חוט כירורגית (לדוגמא (איור 1J, K).
- לחתוך חותם עם דבק רקמות (למשל, n-בוטיל-2-Cyanoacrylat) (איור 1 ליטר).
- לקבע צינור בראש באמצעות סרט דבק.
3. Laparatomy (15-20 דקות)
- הנח את העכבר על כרית חימום כדי למנוע היפותרמיה. לגלח את הבטן, להסיר בזהירות את שיער מהעור. לחטא את עור ופרווה מגולחים באמצעות תמיסת יוד povidone.
- בצע עור קטן לחתוך מתחת לעצם החזה באמצעות מספריים כירורגית (איור 2 א). להאריך את הקיצוץ רוחבי מתחת לצלעות לשני הצדדים, צריבה כל כלי הדם הגלויים כדי למנוע דימום.
- לבצע בזהירות חתך קטן בalba linea מתחת לעצם החזה, פתיחת הצפק (איור 2). להאריך את החתך לשני הצדדים באמצעות cauterization כדי למנוע דימום (איור 2 ג, ד).
- הנח את העכבר לתוך צלחת שלב agarose (איור 2E). מניחים ערימות של גובה מתאים בשני הצדדים של העכבר (בדרך כלל 12-14 כיסוי התלושים) (איור 2F).
- הנח חיישן הדק נשימה מתחת גב עליון לסנכרן מיקרוסקופ עם הנשימה. הפעל יחידת הדק (איור 2G).
- מניחים חוט כירורגי (5-0) דרך עצם החזה לחזור צלעות (איור ט 2).
- לחתוך בזהירות רצועת חיבור כבד וסרעפת (רצועת falciform), כמו גם בדרכי עיכול וכבדות באמצעות מספריים כירורגיות מעוקלים. חותך את רצועות falciform אל אב העורקים (איור י 2).
4. הגדרת דוגמא (10-15 דקות)
- מניחים את העכבר בצד ימין עם זווית של 45 מעלות לגישה קלה לאונת כבד גדולה.
- להוסיף גשר בימוי מתחת לצלעות, המכסה את הבטןחלל. ייצור גשר באמצעות להחליק את מכסה סטנדרטי עם ציפוי נייר דבק כדי לכסות קצוות חדים (איור 2K).
- הנח אונת כבד גדולה על במה. להחליק בזהירות בדיקה עט כדור הכפול או מרית מרופדת מתחת לכבד והחזק את החלק העליון של האיבר באמצעות מקלון צמר גפן רטוב או רקמה רטובה. הרם אונה לשקופית ולהחיל גרירה עדינה. אונה יכולה להיות כפופה או מקופלת. לספק טיפול נוסף כדי רק מניפולציה עדינה של הכבד (איור 2L).
- מניחים הימור צדדי תומך, למשל, ערימות של פתקים קטנים כיסוי (20 מ"מ x 20 מ"מ), בסך של כ באותו הגובה של אונת הכבד לצד זה כדי לתמוך בתלוש לכסות.
- מניחים פתק גדול כיסוי (24 מ"מ x 50 מ"מ) באונת הכבד. ודא שכיסוי להחליק מכוון כאופקי ככל האפשר (איור 2M).
הערה: להחליק את המכסה צריך להיות במגע עם הרקמה בלי לסחוט אותו. לבדוק סימנים נראים לעין של זרימת דם לקויה (רקמה לבנה). אם microcirculation מופר, להוסיף תמיכה בהימור נוספת. - * מקום שני צנתרים intraperitoneal עצמאיים (איור 2N) להרדמה לטווח ארוך ויישום G-5. התקן צנתרים רוחבי בבטן התחתונה בסמוך לגפיים האחורי.
הערה: הצנתרים intraperitoneal יכולים להיות על ידי חיבור 27 מחטי G עם צינורות גמישים סיליקון (איור 3) מתוצרת עצמית. - * מחט לקבע עם לולאה של חוט 5-0 כירורגית לעור, כדי למנוע תזוזה מקרית.
- * צרף משאבת מזרק עם פתרון הרדמה אני לקטטר 1, קצב זרימה מוגדר 0.2 מיליליטר / שעה; לצרף משאבת מזרק עם G-5 לקטטר 2, קצב זרימה מוגדר 0.1 מיליליטר / שעה.
5. ניטור עכבר
- * אלקטרודות א.ק.ג. מקום לחזית וגפיים אחוריות (איור 4 א).
- * צרף צינורות תפוגה ל- CO 2 חיישן רמה.
- להוסיף חיישן טמפרטורה חיצוני המחובר למשטח חום (איור 4C).
6. הטבעה וקיבוע רקמות (5-10 דקות)
- הכן של 3% (w / v) agarose ב1X PBS 100 מיליליטר. להטביע כבד, כאשר הטמפרטורה היא 41 מעלות צלזיוס באמצעות מזרק 5 מיליליטר ומחט 18 G (איור 5 א).
- יוצקים agarose שנותר על coverslip וסביב העכבר (איור 5 ב, ג). חכה עד agarose gelatinized באופן מלא.
- הסר agarose העודף באמצעות מרית היידמן, הכנת viewfield גדולה מספיק כדי לסרוק את אונת הכבד מוכנה (איור 5D, E).
7. הדמיה
- העבר את העכבר לתא אקלים מיקרוסקופ.
- להוסיף 50-100 מיליליטר של 1x PBS (שחומם מראש על 37 מעלות צלזיוס).
- כיסוי צלחת מדגם כדי למנוע אידוי (איור 5F).
- * ירידת isoflurane inhalative 0.5 כרך% (v / v).
- * התחל תוכנת ניטור, הקלטת א.ק.ג., קצב לב וCO 2 הנשיפה.
- התחל הדמיה: לפתוח להתריסי ser, לזהות שדות ראייה של עניין, להגדיר גבול עליון ותחתון לZ-ערימות, ולהתחיל בהקלטת הזמן לשגות. להתקין מחדש Z-ערימות אם יש צורך לתקן את Z-הסחיפה (למשל. כתוצאה משינויים בלחץ דם או תנודות טמפרטורה, איור (5G).
הערה: לאחר סיום תקופת ההדמיה או אם במחזור או ההרדמה של בעלי החיים הופך לבלתי יציב, להקריב את העכברים על ידי נקע בצוואר הרחם (בלי התעוררות מההרדמה).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי לאמת את גישת TPLSM intravital שלנו, אנו חשופים GFP / + עכברי CXCR6 להדמית TPLSM intravital. עכברים שלא טופלו או הושארו כפקדים בסיסיים או נתון להזרקת intraperitoneal אחת של פחמן טטרא (CCL 4) כדי לגרום לנזק בכבד חריף 20.
רצפי וידאו נלקחו על פני תקופה של 2-5 שעות זמן, ותאים אותרו לאורך זמן בשל הקרינה הירוקה שלהם. כדי להציג תנועתיות סלולרית כללית, כל המסלולים שהתגלו במהלך ההליך היו זממו כתמונה על גבי (איור 6 א). בעוד תאים בתנאים בסיסיים הראו הגירה למרחקים ארוכה לאורך sinusoids הכבד כלפי הווריד המרכזי, 18 שעות לאחר טיפול CCl 4 התאים + / GFP CXCR6 הראו דפוסי תנועה כבר לקויים באופן חלקי. למרות שחלק מתאים זזו מהר היו עדיין קיימים בsinusoids הכבד, כמה תחומים מרכזיים היו גלויים עם תאים שהשתנה מהגירה אקראית לסריקה מקומית, מה שמעיד על תגובת chemotactic גיוס התאים לאזור פגיעה. ההשפעה הייתה בולטת עוד יותר לאחר 36 שעות, מראה מעצר כמעט מוחלט של CXCR6 + תאים עם כמעט ללא הגירה פעילה. בעוד בתנאים בסיסיים ביותר היו תאים נודדים מהירויות הגירה משתנים עם שינויים כיוונית אקראיים, CCl 4 חיות שטופלו הראו תאים שזוחלים באיטיות, כמו גם כמה תאי ניעתי בחופשיות סיירו sinusoids לאחר 18 שעות, אך לא לאחר 36 שעות. שימוש במסלולי הגירה מסומן בצבע, מהירות תא יכולה להיות דמיין ישירות להעריך את ההשפעה של טיפול CCl 4. ההגירה לקויה הייתה גם גלויה בתרשים המסלול המנורמל (איור 6), שהראתה כי 18 שעות לאחר 4 CCl הסכום של מרחקים ארוכים עוקב, כמו גם את אורך המסלול הממוצע הופחת במידה ניכרת, ואילו לאחר 36 שעות לא תאי ניעתי היו גילוי כל יותר. בקו wה- i ממצאים אלה, העקירה הסלולרית, המתארת את יכולתו של תא לפטרל בכלי הדם באופן חופשי, ירדה לאורך זמן, מה שמעיד על לכידה של התאים 36 שעות לאחר CCl 4 טיפול באתר של נזק hepatocellular (איור 6 ג).
לעקוב התנהגות הנדידה של תאי CXCR6 + / GFP בכבד בפירוט רב יותר, מהירות ההגירה של תאים בודדים נציג הייתה להתוות כדי לחזות ברמתם של תנועתיות לאורך זמן. אנחנו ואחרים שתוארו קודם לכן כמה דפוסי תנועה שונה של תאים + / GFP CXCR6: זחילה אקראית פעילה עם דבק מתגלגל דפוס, מראה שלבים של תנועתיות סלולרית ומדינות שקטות זמניות; בימוי גיוס סלולארי עם תאי סריקת שטח של עניין, אבל עדיין מסוגל זחילה פעילה; מעצר סלולארי כולל מלווה ב18,20 הפעלת תא חיסונית. בעוד עכברים ללא טיפול בעיקר הראו תאים שהיו מוטי באופן חופשיle עם מהירויות של עד 15 מיקרומטר / sec, תאי CXCR6 + / GFP בעכברים שטופלו עם 4 CCl מוצגים ניכר מופחתים מהירות נדידת תאים ומעצר חלקי כבר לאחר 18 שעות ומעצר נודד מלא לאחר 36 שעות (איור 7 א). בקנה אחד עם ניתוח התא הבודד, הנתונים הסטטיסטיים של כל התאים בתוך רצף חשפו ירידת מהירות העברה כוללת לאחר CCl 4 טיפול (איור 7), שגם הוא היה דומה במהירויות מסלול ממוצעת (איור 7 ג) ולעקוב אחר מהירויות הגירה המרביות (איור 7D), מראה כי הגישה הייתה מתאימה כדי לתאר את ההבדלים בנדידת תאים ומיצוב בפיתוח מחלת כבד.
ציוד כירורגי tracheotomy של העכבר () המשמש להכנה: איור 1.. להג סטנדרטי 1xn מלקחיים, מלקחיים 1x Semken, מלקחיים 1x דומון No.7, מלקחיים גרפו (משוננים, 2x מעוקלים ישר / 1x), מפשקי 2x בלייר (4 פינים (להקהות)), בדיקה עט כדור הכפול (לדוגמא, תערובת burnisher 3PL), היידמן מרית HD2, בעל מחט (Mathieu או האלסי), מספריים 1x קטנים כירורגית (, ישר חדים / בוטה, 1xcurved 1x), מיקרו מספריים (לדוגמא, אביב המספריים Vannas), Cauter 1x הקטן של בעלי החיים, צמר גפן, משחה מגן עיניים, כירורגים החוט, n-בוטיל-2-Cyanoacrylatglue. עיניים (B) מוגנות באמצעות משחה מגן העין. חתך בעור ראשוני להכנת קנה הנשימה (C). Dissection (D) של רקמת חיבור בין בלוטות רוק submaxillary. תערוכה (E) של קנה הנשימה. (F) Dissection של רקמת השריר המקיפה את קנה הנשימה. מיקום (G) של חוט כירורגית מתחת קנה הנשימה לקיבוע של צינור. Trache (H)חתך אל באמצעות microscissors בין טבעות סחוס העליונות. קלטי (I) של צינור אוורור לקנה נשימה. (J) מיקום של חוט כירורגית גולגולת כדי לתקן צינור לעור. קיבעון זוגי של הצינור (K). (I) איטום חתך ניתוחי באמצעות n-בוטיל-2-Cyanoacrylat. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2:. הכנת Laparatomy וכבד חתך בעור ראשוני (A), כלי דם היו צרובים כדי למנוע דימום יתר. פתיחה (B) של הצפק מתחת לעצם החזה. Extension (C) של קיצוץ הצפק באמצעות יחידת כויה. איטום (D) של כלי רום בטן. (
איור 3 "src =" "/> / קבצים / ftp_upload / 52,607 / 52607fig3.jpg
איור 3:. קטטר Intraperitoneal 27 מחטי G מחוברות עם צינורות סיליקון גמישים.
איור 4: ניטור של העכבר. (א) מיקום של אלקטרודות ECG (ירוקים, כבלים אדומים, כחולים). מחטים לגילוי ECG ממוקמות מתחת לעור, כפי שמוצגים. ניטור (B) של ECG (אדום), הנשיפה CO 2 (כחולה) וקצב לב (אדום) מראה התקדמות לטווח ארוכה (משמאל) ומדידה בפועל (מימין). (C) טמפרטורה מבוקרת יחידת כוח לשליטת כרית חום. טמפרטורה מוגדרת 36 ° C. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5: הטבעה כבד והדמיה. הטבעה (א) לאונת כבד. agarose 3% בPBS מוזרק ב 41 מעלות צלזיוס מתחת להחליק את המכסה באמצעות מזרק 2 מיליליטר עם מחט 18G. אונה (B) כבד מוטבע באופן מלא בagarose כדי למזער חפצי תנועה. איטום (C) של הצפק עם הנותר agarose על מנת למנוע התייבשות. להסרת (D) של שדה מיקרוסקופ כיסוי agarose מבט לאחר gelatinization מלא. הכנה (E) של viewfield. התאמת F של רמה-Z והערכה של מדגם זרימת דם באמצעות מיקרוסקופ אור. צלחת Cover (D) על מנת למנוע אידוי מוגזם. הכיסוי הרים בתמונה להראות התקנה. אנא לחץ כאן לצפייה גדולה יותרגרסה של נתון זה.
איור 6:. מעקב של ה- GFP תאים / + CXCR6 בפגיעה בכבד כרונית לאחר CCl 4 הזרקת עכברים הוזרקו ip עם 0.6 מיליליטר / קילוגרם 4 CCl מומס בשעת חמניות שמן 18 או 36 שעות לפני ההדמיה. ביום של הניסוי, עכברים היו נתונים לTPLSM intravital כפי שתוארו. (א) ובכל זאת תמונות של מעקב תא. שירים מכל נקודות הזמן שגבי להראות תנועתיות ועקירה סלולריות. תמונות צולמו באמצעות קרן אחת טיטאן Saphire לייזר ב840 ננומטר ומיקרוסקופ TPLSM. אזורים נסרקו לוקחים 3-5 Z- ערימות עם עומק חדירה של 70μm עם קצב דגימה של כ 30 שניות לכל מחזור סריקה. מסלולים היו בצבעים שונים כדי להראות מהירות הגירה (תכלת: זז לאט או תאים נייחים; סגולים: תאי ניעתי). ברים בקנה מידה: 100 μ; מ '. (ב) XY-דיאגרמות של נתיבים מנורמלים למוצא שלהם מראה יווני מסלול ואורך מסלול (מיקרומטר). (ג) עקירה כוללת של תאים מהמקור שלהם. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 7: סטטיסטיקת הגירה של ה- GFP תאים / + CXCR6 אחרי TPLSM intravital ברקמת כבד בתחילת מחקר וCCl 4 עכברים שטופלו בתאים נותחו למהירות הגירתם סיירה בכבד.. (א) מהירות נציג של תאים בודדים אחרי לאורך זמן. מהירות נמדדה בכל נקודת זמן וזממה עבור כל מסגרת בנפרד. קווים מייצגים תאים בודדים. Y-צירים הם מדורגים לפי מהירות מרבי הגירה. (ב) Stניתוח atistical של מהירויות ספציפיות Frame א 'מכל התאים קובצו ונותח בתחילת המחקר וCCl 4 עכברים שטופלו. (ג) מהירות מסלול ממוצעת חושבה לכל מסלול ונתונים מכל המסלולים קובצו לניתוח. מהירות (D) המרבית של כל מסלול הייתה להתוות ונותחה. כל הניסויים בוצעו בקבוצות של 3 בעלי חיים ותוצאות אושרו בשני ניסויים בלתי תלויים. *** P <0.001 (שני זנב מבחן t מזווג סטודנטים). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מטרת המחקר שלנו הייתה לפתח שיטה סטנדרטית מאוד, יציבה ושחזור ההדמיה TPLSM intravital של הכבד. ההדמיה Intravital בכלל נתנה תובנות רבות ערך להתנהגות סלולרית בתנאי חיים אמיתיים הבאים ביות ואינטראקציה של אוכלוסיות לויקוציטים שונות בפיתוח, הומאוסטזיס ומחלה. עם זאת, העמדה המאתגרת מעט האנטומי של הכבד, עקב אשר בדרכי הנשימה ותנועת מעיים peristaltic ישירות מועברים אל הכבד, כמו גם גבוהות השבריריות שלהם בהשוואה לאיברים מוצקים אחרים המוטלת כמה אתגרים להדמית intravital ארוך טווח יציב. בשנים האחרונות, רבים מחקרי ניסויים בעכברים חשפו את האופי דינמי מאוד של חדירת תאים חיסונית בכבד פגוע 28, עם תרומות גדולות מהתושב או מסתננים מונוציטים / מקרופאגים 30-32, נויטרופילים 33 או תת הלימפוציטים שונים 34,35. עם זאת, מ 'ost של נתונים אלה נגזרים מניתוח נקודת סיום (לדוגמא, ססגוניות cytometry זרימה לאחר הקרבת בעלי החיים). עד עכשיו רק מעט מחקרים קיימים המתארים את הדינמיקה של תנועה סלולרית בעת דלקת כבד באמצעות ההדמיה intravital ססגוניות. שימוש במיקרוסקופים הפוכים עוקף את הצורך בקיבוע ולחות של הכבד עקב ההידבקות האיתנה של הרקמה לזכוכית 24 תחתון. עם זאת, מאז מיקרוסקופי multiphoton רבים בנויים כמערכות הדמיה זקופות, יש צורך בשיטות הכנה וקיבוע משוכללות יותר כדי לייצב את הרקמות בפעם של הדמיה. בדרך כלל, מערכות אחסון זמני בהתאמה אישית תוארו לקיבוע רקמה 6, 36,37, אולם עם אלה הוא חיוני כדי לאמת את זרימת הדם בכבד, שכן לחץ מינימאלי על הרקמה משפיע על זרימת דם סינוסי עם אף לוואי חמור יותר על כבד חולה 38 .
לכן, את הנקודות הבאות היו מודעהלבושים בהתקנה של שיטה זו כדי לייעל את התוצאות שהתקבלו על ידי in vivo הדמיה TPLSM: שיפור האיכות של התכשיר על ידי ההפרעות ממוזערות מדגם ושיבוש זרימת הדם עקב טיפול בסוגיות וגדלו הישרדות של בעלי חיים; ניטור טיפול נמרץ וההתאמה הבאה של הרדמה, הנשמה וייצוב של הישרדות בעלי החיים במחזור משופרת נוסף וממצאים פיסיולוגיים ממוזערים, למשל, שנגרמו על ידי חוסר איזון ברמת חומציות בדם. נשימה מבוקרת בשילוב עם הדמיה מאולצת הייתה חיונית כדי למנוע חפצי תנועה בשל סנכרון של מיקרוסקופ עם מחזורי הנשימה. ההטבעה של האיבר בagarose המכיל ריכוזי מלח פיסיולוגיים הייתה מועילה לקבע בעדינות את האיבר לאחר ההכנה ללא כל מניפולציה מכאנית נוספת ומנעה גם התייבשות של המדגם. רוב הפרוטוקולים המשמשים למיקרוסקופיה כבד לספק שיטות רק מספקות לsta הרדמה ble, לטווח ארוך. עם זאת, ההישרדות של בעלי החיים יכולה להיות משופרת באופן משמעותי עם פרוטוקול ההרדמה הניתן כאן ובשילוב עם הניטור הייתה מספיק כדי להבטיח את ההישרדות של עד 8 שעות. שיטות אלטרנטיביות הן בדרך כלל מתאימות כדי לחזות תהליכים בתוך תקופה של עד 3 שעות זמן כגון פלישת נויטרופילים 39, אבל חוסר האפשרות לתמונה עוד תהליכים שנמשכים כמו מונוציטים או הלימפוציטים פלישת 22 או אפילו תא התפשטות 6. הבנה של הדינמיקה של גיוס, חדירה ואינטראקציה סלולרית בעת דלקת כבד אקוטית וכרונית יכולה לספק תובנה מפורטת יותר להתפתחות וההתקדמות של מחלת כבד. באמצעות הבנה משופרת זו של immunopathology ניתן יהיה לעצב טיפולים הרבה יותר מעודן במונחים של טיפול בתאי המטרה של עניין ולא באמצעות גישות לדיכוי המערכת החיסונית למשל הלא סלקטיבי.
ove_content "> כדי לטפל במיצוב, הגלגול ואינטראקציה של לויקוציטים, תמונות באיכות גבוהות יש צורך במעקב 4D מדויק של התאים בתוך רקמת כלי הדם בכבד וכבד 18,20,40.השיטה שאנו מספקים כאן יכול להיות מיושמת באמצעות ריאגנטים מעבדה נפוצים וציוד, מה שהופך את שניהם קל לטפל ועלות יעילה עם ההפרעות מינימליות של המדגם. כדי לשמור על התנאים הפיסיולוגיים של העכבר לזמן רב ככל האפשר, יש צורך עדין להתאים את ההיקף ותדירות הנשימה לשלוט CO חמצון והדם 2 רמות. למרות שבשל העירוי המתמשך של נוזלים לתוך הצפק יש לפחות אספקה מהוססת לייצב את מדידות זרימה, א.ק.ג. ותדירות לב רק לאפשר שליטה חלקית לגבי התייצבות במחזור. על ידי יישום בקרת לחץ דם ישיר ויישום נוזלי ורידים מרכזיים סביר להניח כי paramet החיוניers ניתן התייצב אף יותר, מה שמוביל לשיפור נוסף של יציבות והישרדות.
גם בתנאים מבוקרים מאוד, הדמיה של בעלי חיים שנחשפו למודלים לנזק בכבד בשימוש בעכברים נפוצים כגון נזק כבד נגרם פרצטמול, CCl 4 נזק כבד נגרם או מחלת כבד שומני מושרה תזונתית נותרת מאתגרת. בשל הפונקציה חיונית של הכבד בשליטת מדינת חילוף חומרים והמיקום המרכזי שלה במחזור הדם, שינויים של פונקציונליות הכבד או זרימת הדם משפיע באופן ישיר הישרדות לטווח הארוך של בעלי החיים, ולכן מגבילה את האפשרות להשיג וידאו-רצפי TPLSM ארוכים של כבדות איברים שנפגעו, למשל עם דימומים חמורים או microvasculature נהרסה. כמו כן, בmicroanatomy הכבד שינה קשה כמו בדגמים עם נימקים נרחבים, זה עדיין קשה ללמוד תאי תאים-אינטראקציות ומידור מקומי של אגרגטים תא דלקתיים, כי אף סטןdardized "נגד כתמים" למבנים אנטומיים (כגון hematoxylin מכתימה במיקרוסקופיה הקונבנציונלית או מכתים DAPI בimmunofluorescence) זמינים לאיכות TPLSM.The intravital של נתונים המתקבלים על ידי תהליך ההדמיה נוספת תלוי בעוצמת התיוג של התאים ו ההתקנה המיקרוסקופית.
כמה גישות קיימות לדמיין תאים + GFP בכבד. הקרינה הגבוהה ביותר עם הקרינה רקע נמוכה מאוד מתקבלת על בין 900 ל 920 ננומטר גל עירור. ההפסד של הקרינה רקע כבד כמעט המוחלט אינו מאפשר לחקור את המיצוב של התאים בתוך הכבד, כאשר לא משתמש בכלי עוקבים אחר נוסף כגון Dextran או קטינים. לכן, החלטנו תמונת leukocytes הנודדות באורך גל של 840 ננומטר, נותן היחס הטוב ביותר בין אות ה- GFP וקרינת רקע כבד מפורטת אך לא בהירה מדי.
יחדיו, מילת הקריאהמערכת ההדמיה אביטל TPLSM הציגה במחקר זה יכול להיות מיושמת על מגוון רחב של שאלות מיקרוסקופיה כבד ספציפיות intravital. עם גישה זו, ההדמיה TPLSM באיברים מוצקים אחרים כגון כליות, כבד, שלפוחית השתן, מעי או לבלב אינה ריאלי עם שינויים קלים בלבד של הניתוחים ובימוי רקמות, ולכן מתן גישה גמישה מאוד לחקור תהליכי נדידה ארוך טווח של תאים ב vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthetics | |||
| Buprenorphine | Essex Pharma | 997.00.00 | Analgeticum, 0.1 mg/kg |
| Fentanyl | Rotex Medica | charge: 30819 | |
| Fluovac anesthesia system | Harvard Apparatus | 34-1030 | |
| Glucose 5% | Braun | ||
| ISOFLO (Isoflurane Vapor) vaporiser | Eickemeyer | 4802885 | |
| Isoflurane | Forene Abbott | B 506 | |
| Isotonic (0.9%) NaCl solution | DeltaSelect GmbH | PZN 00765145 | |
| Ketamin 10% | ceva | Charge: 36217/09 | |
| Xylazin 2% | medistar | Charge: 04-03-9338/23 | |
| Consumable supplies | |||
| 20 ml Syringe | BD Plastipak | ||
| 250 ml Erlenmeyer flask | Schott Duran | 21 226 36 | |
| 25 ml Beaker 2x | Schott Duran | 50-1150 | |
| 2 ml syringe | BD Plastipak | ||
| 4-0 Vicryl suture | Ethicon | V7980 | |
| Agarose | commercially available | ||
| Bepanthen Eye and Nose ointment | Bayer Vital GmbH | 6029009.00.00 | |
| Change-A-Tip Deluxe High-Temp Cautery Kit | Fine Science Tools Inc. | 18010-00 | |
| Cotton Gauze swabs | Fuhrmann GmbH | 32014 | |
| Cover Slip 24x50 mm | ROTH | 1871 | |
| Durapore silk tape | 3M | 1538-1 | |
| Feather disposable scalpel | Feather | 02.001.30.011 | |
| Fine Bore Polythene Tubing 0.58 mm ID | Smiths medical | 800/100/200 | |
| Histoacryl | Braun | 1050052 | 5x 0.5 ml |
| Leukoplast | BSN Medical Inc. | ||
| Microscope Slides | ROTH | 1879 | |
| Poly-Alcohol Haut…farblos Antisepticum | Antiseptica GmbH | 72PAH200 | |
| Sterican needle 18 G x 1 | B. Braun | 304622 | |
| Sterican needle 27 3/4 G x 1 | B. Braun | 4657705 | |
| Tissue paper | commercially available | ||
| Surgical Instruments | |||
| Amalgam burnisher 3PL | Gatz | 0110? | |
| Blair retractors (4 pronged (blunt)) x2 | Storz&Klein | S-01134 | |
| Dumont No.7 forceps | Fine Science Tools Inc. | 91197-00 | |
| Graefe forceps curved x1 | Fine Science Tools Inc. | 11151-10 | |
| Graefe forceps straight x2 | Fine Science Tools Inc. | 11050-10 | |
| Heidemann spatula HD2 | Stoma | 2030.00 | |
| Needle holder Mathieu | Fine Science Tools Inc. | 12010-14 | |
| Scissor | Fine Science Tools Inc. | 14074-11 | |
| Semken forceps | Fine Science Tools Inc. | 11008-13 | |
| Small surgical scissors curved | Fine Science Tools Inc. | 14029-10 | |
| Small surgical scissors straight | Fine Science Tools Inc. | 14028-10 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools Inc. | 11000-12 | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools Inc. | 15000-08 | |
| Equipment | |||
| ECG Trigger Unit | Rapid Biomedical | 3000003686 | |
| MICROCAPSTAR End-Tidal Carbon Dioxide Analyzer | AD Instruments | ||
| Minivent Typ 845 | Harvard Apparatus | 73-0043 | |
| Multiphoton microscope Trimscope I | LaVision | ||
| Perfusor Compact | B. Braun | ||
| PowerLab 8/30 8 channel recorder | AD Instruments | PL3508 | |
| Temperature controlled heating pad | Sygonix | 26857617 | |
| Temperature sensor | comercially available | ||
| Temperature controlled System for Microscopes -Cube&Box | Life Imaging Services |
References
- Dusseaux, M., et al. Human MAIT cells are xenobiotic-resistant, tissue-targeted, CD161hi IL-17-secreting T cells. Blood. 117 (4), 1250-1259 (2011).
- Reese, A. J. The effect of hypoxia on liver secretion studied by intravital fluorescence microscopy. Br J Exp Pathol. 41, 527-535 (1960).
- Bhathal, P. S., Christie, G. S. Intravital fluorescence microscopy study of bile ductule proliferation in guinea pigs. Gut. 10 (11), 955 (1969).
- Stefenelli, N. Terminal vascular system and microcirculation of the rat liver in intravital microscopy. Wien Klin Wochenschr. 82 (33), 575-578 (1970).
- Hori, T., et al. Simple and sure methodology for massive hepatectomy in the mouse. Ann Gastroenterol. 24 (4), 307-318 (2011).
- Tanaka, K., et al. Intravital dual-colored visualization of colorectal liver metastasis in living mice using two photon laser scanning microscopy. Microsc Res Tech. 75 (3), 307-315 (2011).
- Schemmer, P., Bunzendahl, H., Klar, E., Thurman, R. G. Reperfusion injury is dramatically increased by gentle liver manipulation during harvest. Transpl Int. 13, Suppl 1. S525-S527 (2000).
- Schemmer, P., et al. Activated Kupffer cells cause a hypermetabolic state after gentle in situ manipulation of liver in rats. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 280 (6), G1076-G1082 (2001).
- Toiyama, Y., et al. Intravital imaging of DSS-induced cecal mucosal damage in GFP-transgenic mice using two-photon microscopy. J Gastroenterol. 45 (5), 544-553 (2010).
- Zimmon, D. S. The hepatic vasculature and its response to hepatic injury: a working hypothesis. Yale J Biol Med. 50 (5), 497-506 (1977).
- Wong, J., et al. A minimal role for selectins in the recruitment of leukocytes into the inflamed liver microvasculature. J Clin Invest. 99 (11), 2782-2790 (1997).
- Bonder, C. S., et al. Essential role for neutrophil recruitment to the liver in concanavalin A-induced hepatitis. J Immunol. 172 (1), 45-53 (2004).
- Xu, C., Zipfel, W., Shear, J. B., Williams, R. M., Webb, W. W. Multiphoton fluorescence excitation: new spectral windows for biological nonlinear microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (20), 10763-10768 (1996).
- Centonze, V. E., White, J. G. Multiphoton excitation provides optical sections from deeper within scattering specimens than confocal imaging. Biophys J. 75 (4), 2015-2024 (1998).
- Amore, J. D., et al. In vivo multiphoton imaging of a transgenic mouse model of Alzheimer disease reveals marked thioflavine-S-associated alterations in neurite trajectories. J Neuropathol Exp Neurol. 62 (2), 137-145 (2003).
- Hickey, M. J., Westhorpe, C. L. V. Imaging inflammatory leukocyte recruitment in kidney, lung and liver--challenges to the multi-step paradigm. Immunol Cell Biol. 91 (4), 281-289 (2013).
- McLellan, M. E., Kajdasz, S. T., Hyman, B. T., Bacskai, B. J. In vivo imaging of reactive oxygen species specifically associated with thioflavine S-positive amyloid plaques by multiphoton microscopy. J Neurosci. 23 (6), 2212-2217 (2003).
- Geissmann, F., et al. Intravascular Immune Surveillance by CXCR6+ NKT Cells Patrolling Liver Sinusoids. PLoS Biology. 3 (4), (2005).
- Velázquez, P., et al. Cutting edge: activation by innate cytokines or microbial antigens can cause arrest of natural killer T cell patrolling of liver sinusoids. J Immunol. 180 (4), 2024-2028 (2008).
- Wehr, A., et al. Chemokine receptor CXCR6-dependent hepatic NK T Cell accumulation promotes inflammation and liver fibrosis. J Immunol. 190 (10), 5226-5236 (2013).
- Khandoga, A., Hanschen, M., Kessler, J. S., Krombach, F. CD4+ T cells contribute to postischemic liver injury in mice by interacting with sinusoidal endothelium and platelets. Hepatology. 43 (2), 306-315 (2006).
- Egen, J. G., et al. Macrophage and T cell dynamics during the development and disintegration of mycobacterial granulomas. Immunity. 28 (2), 271-284 (2008).
- Beattie, L., et al. Leishmania donovani-induced expression of signal regulatory protein alpha on Kupffer cells enhances hepatic invariant NKT-cell activation. Eur J Immunol. 40 (1), 117-123 (2010).
- Beattie, L., et al. Dynamic imaging of experimental Leishmania donovani-induced hepatic granulomas detects Kupffer cell-restricted antigen presentation to antigen-specific CD8 T cells. PLoS Pathog. 6 (3), e1000805 (2010).
- McDonald, B., et al. Intravascular danger signals guide neutrophils to sites of sterile inflammation. Science. 330 (6002), 362-366 (2010).
- Vanheule, E., et al. An intravital microscopic study of the hepatic microcirculation in cirrhotic mice models: relationship between fibrosis and angiogenesis. Int J Exp Pathol. 89 (6), 419-432 (2008).
- Jenne, C. N., Kubes, P. Immune surveillance by the liver. Nat Immunol. 14 (10), 996-1006 (2013).
- Zimmermann, H. W., Tacke, F. Modification of chemokine pathways and immune cell infiltration as a novel therapeutic approach in liver inflammation and fibrosis. Inflamm Allergy Drug Targets. 10 (6), 509-536 (2011).
- Kim, J. V., et al. Two-photon laser scanning microscopy imaging of intact spinal cord and cerebral cortex reveals requirement for CXCR6 and neuroinflammation in immune cell infiltration of cortical injury sites. J Immunol Methods. 352 (1-2), 89-100 (2010).
- Karlmark, K. R., et al. Hepatic recruitment of the inflammatory Gr1+ monocyte subset upon liver injury promotes hepatic fibrosis. Hepatology. 50 (1), 261-274 (2009).
- Heymann, F., et al. Hepatic macrophage migration and differentiation critical for liver fibrosis is mediated by the chemokine receptor C-C motif chemokine receptor 8 in mice. Hepatology. 55 (3), 898-909 (2012).
- Ramachandran, P., et al. Differential Ly-6C expression identifies the recruited macrophage phenotype, which orchestrates the regression of murine liver fibrosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (46), E3186-E3195 (2012).
- Moles, A., et al. A TLR2/S100A9/CXCL-2 signaling network is necessary for neutrophil recruitment in acute and chronic liver injury in the mouse. J Hepatol. 60 (4), 782-791 (2014).
- Hammerich, L., et al. Chemokine receptor CCR6-dependent accumulation of γδ T cells in injured liver restricts hepatic inflammation and fibrosis. Hepatology. 59 (2), 630-642 (2014).
- Syn, W. -K., et al. NKT-associated hedgehog and osteopontin drive fibrogenesis in non-alcoholic fatty liver disease. Gut. 61 (9), 1323-1329 (2012).
- McDonald, B., et al. Interaction of CD44 and hyaluronan is the dominant mechanism for neutrophil sequestration in inflamed liver sinusoids. J Exp Med. 205 (4), 915-927 (2008).
- Egen, J. G., et al. Intravital imaging reveals limited antigen presentation and T cell effector function in mycobacterial granulomas. Immunity. 34 (5), 807-819 (2011).
- Singer, G., Stokes, K. Y., Granger, D. N. Hepatic microcirculation in murine sepsis: role of lymphocytes. Pediatr Surg Int. 24 (1), 13-20 (2008).
- Phillipson, M., Kubes, P. The neutrophil in vascular inflammation. Nat Med. 17 (11), 1381-1390 (2011).
- Khandoga, A. G., et al. In vivo imaging and quantitative analysis of leukocyte directional migration and polarization in inflamed tissue. PLoS One. 4 (3), e4693 (2009).
