Stable intravital high-resolution imaging of immune cells in the liver is challenging. Here we provide a highly sensitive and reliable method to study migration and cell-cell-interactions of immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hours) by intravital multiphoton laser scanning microscopy in combination with intensive care monitoring.
Leverbetennelse som en respons på skade er en svært dynamisk prosess som involverer infiltrering av distinkte subtyper av leukocytter, inkludert monocytter, neutrofiler, T-celle-undergrupper, B-celler, naturlige killer (NK) og NKT-celler. Intramikroskopi av leveren for overvåking av immuncellemigrasjon er spesielt utfordrende på grunn av de høye krav til prøveopparbeidelse og fiksering, optisk oppløsning og langsiktig dyr overlevelse. Likevel, kan dynamikken i inflammatoriske prosesser samt cellulære interaksjonsstudier gi viktig informasjon for bedre å forstå initiering, progresjon og regresjon av inflammatorisk leversykdom. Derfor, ble en svært følsom og pålitelig metode etablert for å studere migrasjon og celle-celle-interaksjoner av forskjellige immunceller i muselever over lange perioder (ca. 6 timer) ved intravital to-foton laser scanning mikroskop (TPLSM) i kombinasjon med intensiv pleie overvåking.
ent "> Fremgangsmåten omfatter gitt en svak preparat og stabil fiksering av leveren med minimal forstyrrelse av organet; langtidsintravital avbildning ved hjelp av flerfarget multiphoton mikroskopi med praktisk talt ingen fotobleking eller fototoksiske effekter over en tidsperiode på opp til 6 timer, slik at sporings av spesifikke leukocytt-undersett, og stabile avbildningsforhold på grunn av omfattende overvåking av mus viktige parametere og stabilisering av sirkulasjonen, temperatur og gassutveksling.For å undersøke lymfocyttmigrering ved leverinflammasjon CXCR6.gfp knock-in-mus ble utsatt for intravital leveravbildning i henhold til grunnlinjebetingelser og etter akutt og kronisk leverskade indusert ved intraperitoneal injeksjon (e) av karbontetraklorid (CCI4).
CXCR6 er en kjemokinreseptor uttrykt på lymfocytter, hovedsakelig på Natural Killer T (NKT) -, Natural Killer (NK) – og undergrupper av T-lymfocytter som CD4 T-celler, men også slimhinne associrerte invariant (MAIT) T-celler 1. Etter den vandrende mønster og posisjonering av CXCR6.gfp + immunceller tillatt en detaljert innsikt i deres endrede adferd på leverskade og derfor sitt potensial engasjement i sykdomsprogresjon.
Visualisering av celler og cellefunksjoner i hele organer eller hele organismer har vært av stor interesse for mer enn 50 år, inkludert nesten alle deler av kroppen 2. Derfor noen tidlige studier allerede anvendt intravital avbildning av leveren 3,4. Men flere begrensninger eksisterer oppdatert om langsiktig stabil høyoppløselig avbildning av leveren vev.
På grunn av den anatomiske stilling av leveren i nær kontakt med membranen og mage-tarmkanalen 5, er den mest vanlig problem for mikroskopisk intrabilde bevegelse på grunn av respirasjon, og, i mindre grad, peristaltiske av tarmkanalen 6. I forhold til andre faste organer, er leverkirurgi spesielt utfordrende. På grunn av den tette microvascular struktur, kan kirurgisk manipulering føre til massive hemoragisk lesjoner, nedsatt mikrosirkulasjon 7 og også aktivering av bosatt i-immun celler som Kupffer celler 8. Derfor, mekanisk fiksering av vevet som i andre sammenhenger 6,9 er sannsynlig å forstyrre den intramikros bildebehandling.
I en frisk lever, befinner seg 10 til 15% av det totale blodvolum i leveren vaskulaturen, og organ mottar rundt 25% av den totale blodsirkulasjon 10, slik at organet meget følsom for endringer i sirkulasjon (f.eks, blod trykkfluktuasjoner ). Derfor vil forstyrrelser i leverblodstrømmer på grunn av f.eks skjærspenning, fortrengning, skade av overdreven vev håndtering eller sentralisert sirkulasjon føre til kunstige endringer i leukocytter trekkadferden, nedsatt leveroksygenering og derfor ytterligere skade leveren, påvirker leveren immunresponser samt som organbevaring og total levetid av dyret.
Tidlige mikroskopiske studier var basert på intra epifluorescence microscopy, men flere tekniske begrensninger som foto bleking og lav penetrasjon dybde begrense bruken av denne teknikken for langsiktig leveren bildebehandling 4,11,12. Med utviklingen av multiphoton mikros på 1990-tallet, ble begrensningene i fotobleking eller inntrengningsdybde i hovedsak løst, som denne nye metoden var teknisk i stand til å utføre imaging studier i nesten alle organer i henhold til virkelige situasjoner 13-15. Men de viktigste gjenværende utfordringer når det gjelder diagnostikk av lever var: pusten bevegelser, autofluorescence av levervev, sikring uforandret blodgjennomstrømningen i lever sinusoids, og spesielt stabil bildebehandling for lengre perioder av flere hr 16.
Selv om flere studier adressert funksjons og migrering av forskjellige leukocytter i leveren 17, f.eks NKT-celler, T-celler 18 til 20 21,22, 23,24 levermakrofager eller neutrofiler 25, langtids multiphoton microscopy bildebehandling hadde ennå ikke er opprettet, en oppgave enda mer utfordrende i dyr med akutt eller kronisk leversykdom på grunn av den eksisterende skader og derfor høyere mottakelighet for ytterligere skade 26. Men overvåking trekkadferden og cellulær funksjon av leukocytter i leveren i sanntid gjør at ny innsikt i deres spesielle rolle i lever homeostase og sykdom 27.
Kjemokinreseptoren CXCR6 uttrykkes på flere lymfocytt-delmengdene, inkludert naturlige killer (NK) celler, NKT-celler og noen T-celle-populasjoner 18,28. Tidligere studier på mus har indikert at CXCR6 og dens beslektede ligand CXCL16 kan kontrollere patruljering av NKT celler på lever sinusoids under homeostase. Følgelig har bruken av CXCR6.gfp mus (som bærer et knock-in for grønt fluorescerende protein [GFP] i CXCR6 locus) er beskrevet for å undersøke overføringen av lymfocytter i forskjellige organer som hjernen 29og også lever 18,20, som viser økt infiltrasjon av CXCR6.gfp celler på betennelse.
Med fremgangsmåten er gitt i denne studien var det mulig å følge disse prosesser over et langt tidsrom under stabiliserte betingelser. Den intravital multiphoton basert fremgangsmåte tillater avbildning som var meget reproduserbar med minimal forstyrrelse av dyret og det organ; optimalisert for langsiktig dyr overlevelse ved omfattende overvåkning fulgt av tett kontroll av respirasjon og sirkulasjon; og svært fleksibel og enkel å ta i bruk også til andre parenkymatøs organer som nyre eller milt.
Målet for studien var å utvikle et sterkt standardisert, stabil og reproduserbar metode for intravital TPLSM avbildning av leveren. Intra bildebehandling generelt har gitt verdifull innsikt i mobilnettet oppførsel under reelle levekår følgende homing og samspillet mellom ulike leukocyttpopulasjoner i utvikling, homeostase og sykdom. Imidlertid, noe utfordrende anatomisk posisjon i leveren, grunnet som åndedretts- og peristaltiske tarmbevegelse direkte overføres til leveren, så vel som deres høye skjørhet i for…
The authors have nothing to disclose.
The authors thank the Central Animal facility of the University Hospital Aachen for technical support. This work was supported by the German Research Foundation (DFG Ta434/2-1, DFG SFB/TRR 57) and by the Interdisciplinary Center for Clinical Research (IZKF) Aachen. This work was further supported by the Core Facility ”Two-Photon Imaging”, a Core Facility of the Interdisciplinary Center for Clinical Research (IZKF) Aachen within the Faculty of Medicine at RWTH Aachen University.
Anesthetics | |||
Buprenorphine | Essex Pharma | 997.00.00 | Analgeticum, 0.1 mg/kg |
Fentanyl | Rotex Medica | charge: 30819 | |
Fluovac anesthesia system | Harvard Apparatus | 34-1030 | |
Glucose 5% | Braun | ||
ISOFLO (Isoflurane Vapor) vaporiser | Eickemeyer | 4802885 | |
Isoflurane | Forene Abbott | B 506 | |
Isotonic (0.9%) NaCl solution | DeltaSelect GmbH | PZN 00765145 | |
Ketamin 10% | ceva | Charge: 36217/09 | |
Xylazin 2% | medistar | Charge: 04-03-9338/23 | |
Consumable supplies | |||
20ml Syringe | BD Plastipak | ||
250ml Erlenmeyer flask | Schott Duran | 21 226 36 | |
25mL Beaker 2x | Schott Duran | 50-1150 | |
2ml syringe | BD Plastipak | ||
4-0 Vicryl suture | Ethicon | V7980 | |
Agarose | commercially available | ||
Bepanthen Eye and Nose ointment | Bayer Vital GmbH | 6029009.00.00 | |
Change-A-Tip Deluxe High-Temp Cautery Kit | Fine Science Tools Inc. | 18010-00 | |
Cotton Gauze swabs | Fuhrmann GmbH | 32014 | |
Cover Slip 24x50mm | ROTH | 1871 | |
Durapore silk tape | 3M | 1538-1 | |
Feather disposable scalpel | Feather | 02.001.30.011 | |
Fine Bore Polythene Tubing 0,58mm ID | Smiths medical | 800/100/200 | |
Histoacryl | Braun | 1050052 | 5x 0,5ml |
Leukoplast | BSN Medical Inc. | ||
Microscope Slides | ROTH | 1879 | |
Poly-Alcohol Haut…farblos Antisepticum | Antiseptica GmbH | 72PAH200 | |
Sterican needle 18 G x 1 | B. Braun | 304622 | |
Sterican needle 27 3/4 G x 1 | B. Braun | 4657705 | |
Tissue paper | commercially available | ||
Surgical Instruments | |||
Amalgam burnisher 3PL | Gatz | 0110? | |
Blair retractors (4 pronged (blunt)) x2 | Storz&Klein | S-01134 | |
Dumont No.7 forceps | Fine Science Tools Inc. | 91197-00 | |
Graefe forceps curved x1 | Fine Science Tools Inc. | 11151-10 | |
Graefe forceps straight x2 | Fine Science Tools Inc. | 11050-10 | |
Heidemann spatula HD2 | Stoma | 2030.00 | |
Needle holder Mathieu | Fine Science Tools Inc. | 12010-14 | |
Scissor | Fine Science Tools Inc. | 14074-11 | |
Semken forceps | Fine Science Tools Inc. | 11008-13 | |
Small surgical scissors curved | Fine Science Tools Inc. | 14029-10 | |
Small surgical scissors straight | Fine Science Tools Inc. | 14028-10 | |
Standard pattern forceps | Fine Science Tools Inc. | 11000-12 | |
Vannas spring scissors | Fine Science Tools Inc. | 15000-08 | |
Equipment | |||
ECG Trigger Unit | Rapid Biomedical | 3000003686 | |
MICROCAPSTAR End-Tidal Carbon Dioxide Analyzer | AD Instruments | ||
Minivent Typ 845 | Harvard Apparatus | 73-0043 | |
Multiphoton microscope Trimscope I | LaVision | ||
Perfusor Compact | B. Braun | ||
PowerLab 8/30 8 channel recorder | AD Instruments | PL3508 | |
Temperature controlled heating pad | Sygonix | 26857617 | |
Temperature sensor | comercially available | ||
Temperature controlled System for Microscopes -Cube&Box | Life Imaging Services |