Abstract
Inflamação do fígado como uma resposta à lesão é um processo altamente dinâmico envolvendo a infiltração de subtipos distintos de leucócitos incluindo monócitos, neutrófilos, subconjuntos de células T, células B, células assassinas naturais (NK) e as células NKT. Microscopia intravital do fígado para monitorar a migração de células imunes é particularmente desafiador devido às altas exigências em matéria de preparação de amostras e fixação, resolução óptica e sobrevivência dos animais no longo prazo. No entanto, a dinâmica dos processos inflamatórios, assim como estudos de interacção celular poderia fornecer informações importantes para compreender melhor o início, a progressão e regressão da doença inflamatória do fígado. Portanto, um método altamente sensível e confiável foi criada para estudar a migração e célula-célula-interações de células imunes diferentes em fígado de rato durante longos períodos (cerca de 6 h) por dois fótons de microscopia de varredura a laser intravital (TPLSM) em combinação com tratamento intensivo monitorização.
ent "> O método fornecido inclui uma preparação suave e fixação estável do fígado com perturbação mínima do órgão; imagiologia intravital longo prazo usando microscopia multiphoton multicolor com praticamente nenhuma fotodegradação ou efeitos fototóxicos, durante um período de até 6 horas, permitindo rastreamento de subconjuntos de leucócitos específicos; e condições de imagem estável devido à ampla fiscalização do rato parâmetros vitais e estabilização da circulação, temperatura e troca gasosa.Para investigar a migração de linfócitos após a inflamação do fígado CXCR6.gfp ratinhos knock-in foram submetidos a imagiologia do fígado intravital em condições basais e após os danos do fígado aguda e crónica induzida por injecção intraperitoneal (s) de tetracloreto de carbono (CCl 4).
CXCR6 é um receptor de quimiocina expressa em linfócitos, principalmente em Natural T assassinas (NKT) -, Natural Killer (NK) - e subconjuntos de linfócitos T, tais como células T CD4 +, mas também asso mucosasated invariante células (MAIT) T 1. Seguindo o padrão migratório e posicionamento de CXCR6.gfp + células imunes permitiu uma visão detalhada sobre o seu comportamento alterado após a lesão hepática e, portanto, o seu potencial envolvimento na progressão da doença.
Introduction
A visualização de células e as funções celulares em órgãos inteiros ou até mesmo de organismos inteiros tem sido de grande interesse para mais de 50 anos, incluindo praticamente todas as partes do corpo 2. Por isso, alguns estudos iniciais já empregaram imagens intravital do fígado 3,4. No entanto, existem várias limitações atualizado sobre estável imagens de alta resolução a longo prazo do tecido do fígado.
Devido à posição anatómica do fígado em estreito contacto com o diafragma e o tracto gastrointestinal 5, o problema mais comum para imagiologia intravital microscópica é o movimento devido à respiração e, em menor grau, peristáltica do tracto intestinal 6. Em comparação com outros órgãos sólidos, cirurgia do fígado é particularmente desafiador. Devido à estrutura microvascular densa, manipulação cirúrgica pode conduzir a lesões hemorrágicas maciças, microcirculação comprometida 7 e também a activação de residente immune células, tais como células de Kupffer 8. Portanto, a fixação mecânica do tecido como publicado anteriormente 6,9 é susceptível de interferir com a imagem de microscopia intravital.
Em um fígado saudável, 10-15% do volume total de sangue reside dentro da vasculatura hepática, e o órgão recebe cerca de 25% do débito cardíaco geral 10, tornando o órgão altamente susceptíveis a mudanças na circulação (por exemplo, flutuações de pressão arterial ). Portanto, as interrupções no fluxo sanguíneo hepático devido, por exemplo, tensão de cisalhamento, deslocamento, lesão por manuseio excessivo dos tecidos ou circulação centralizada vai levar a alterações artificiais no comportamento migratório de leucócitos, deficiente oxigenação fígado e, portanto, mais danos ao fígado, afetando as respostas imunes do fígado, bem como preservação de órgãos e tempo de vida total do animal.
Os primeiros estudos microscópicos foram baseados em mi epifluorescência intravitalcroscopy, mas várias restrições técnicas, tais como o branqueamento foto e baixa profundidade de penetração limitar o uso desta técnica para imagiologia do fígado a longo prazo 4,11,12. Com o desenvolvimento da microscopia multiphoton na década de 1990, as limitações de branqueamento foto ou profundidade de penetração foram principalmente resolvido, já que este novo método era tecnicamente capaz de realizar estudos de imagem em praticamente todos os órgãos em situações da vida real 13-15. No entanto, os principais desafios que subsistem no que diz respeito à geração de imagens de fígado foram: movimentos de respiração, autofluorescência do tecido do fígado, protegendo o fluxo sanguíneo inalterado nos sinusóides hepáticos, e de imagem especialmente estáveis por longos períodos de várias horas 16.
Apesar de vários estudos abordaram a função e migração de vários leucócitos no fígado 17, por exemplo, a NKT células-18-20, células T 21,22, os macrófagos do fígado 23,24 ou neutrófilos 25, a longo prazo multiphoton mimaging icroscopy ainda não tinha sido estabelecida com sucesso, uma tarefa ainda mais difícil em animais com doença hepática aguda ou crônica devido ao dano existente e, portanto, maior susceptibilidade a danos maiores 26. No entanto, monitorando o comportamento migratório e função celular de leucócitos no fígado em tempo real, permite que novas idéias em seu papel especial na homeostase do fígado e doença 27.
O receptor de quimiocina CXCR6 é expresso em vários subconjuntos de linfócitos, incluindo células assassinas naturais (NK), as células NKT e algumas populações de células T 18,28. Estudos anteriores em ratos indicaram que CXCR6 e sua CXCL16 ligando cognato pode controlar o patrulhamento de células NKT em sinusóides hepáticos durante a homeostase. Por conseguinte, a utilização de ratinhos CXCR6.gfp (transportando um knock-in de proteína fluorescente verde [GFP] no locus CXCR6) tem sido descrita para investigar a migração de linfócitos em vários órgãos tais como o cérebro 29e também fígado 18,20, mostrando aumento da infiltração de células CXCR6.gfp sobre a inflamação.
Com o método proporcionado no presente estudo foi possível seguir estes processos durante um longo período de tempo sob condições estabilizadas. O procedimento baseado multiphoton intravital permitido de imagem que foi altamente reprodutível com perturbação mínima do animal e do órgão; otimizado para a sobrevivência dos animais a longo prazo através de monitoramento extensa, seguida de perto o controle da respiração e circulação; e altamente flexível e fácil de adoptar igualmente para outros órgãos parenquimatosos, tais como de rim ou baço.
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Protocol
NOTA: Os experimentos foram realizados em conformidade com a legislação alemã que rege os estudos em animais após o 'Guia para o cuidado e uso de animais de laboratório "(publicação NIH, 8ª edição, 2011) e da Directiva 2010/63 / UE relativa à protecção dos animais utilizados para fins científicos (Jornal Oficial da União Europeia, 2010). Permissão oficial foi concedida a partir do cuidado com os animais e uso de escritório governamental (LANUV Nordrhein-Westfalen, Recklinghausen, Alemanha).
Nota: Os passos que podem ser omitidos para a imagem latente de curto prazo (por exemplo, tirar fotos, pilhas 3-D ou também de microscopia de lapso de tempo curta duração) são marcados com asterisco (*) para reduzir o tempo de preparação e simplificar o protocolo cirúrgico. Imagiologia também pode ser realizada sem grande controlo e de circulação, se necessário, no entanto, o tempo de sobrevivência será acentuadamente reduzido.
1. Setup Microscópio e pré-cirurgia Preparação (5-10 min)
- Sistema Ligue (microscópio, laboratório de energia, laser, almofada de aquecimento, câmara climática, web cam, dispositivo de bomba de seringa, respirador).
- Ligue O 2 de abastecimento para Isoflurane Vapor e definir o nível de isoflurano para 1,5 Vol% (v / v), conectar-se a um pequeno respirador animal.
- Para imagens de curto prazo, manter a anestesia com isoflurano somente após a indução inicial anestesia ip (veja o passo 2.2). Em seguida, use 2 Vol% (v / v) isoflurano, e manter o tempo de imagem inferior a 2 horas para garantir estável microcirculação hepática.
- Definir a respiração 120-140 ciclos respiratórios / min com um volume de 150-200 uL.
- Configure fase rato agarose. Preparar 100 ml de 3% (w / v) de agarose, vertendo-a em um prato (aproximadamente 10 cm x 15 cm base) num ângulo de 40 °.
- Configure área de trabalho cirúrgico coletando a instrumentação necessária. Para prevenir a infecção microbiana, desinfectar instrumentos usando uma solução a 1% de Sekusept Forte S (9,9% w / v), Glutaral 9,8% w / v, formaldeído durante 5 minutos antes da experiência (Figura 1A).
- Obter restantes componentes: desinfectante da pele (por exemplo, solução de povidona iodo de 10%), no fígado (fase de pilhas e ponte), solução de agarose (3% (w v) em PBS /), bomba de seringa com 5% (w / v) de uma solução de glucose (G-5), bomba de seringa com solução anestésica I (cetamina 0,1 mg / ml, xilazina 0,5 mg / ml, 5 ug de fentanil / ml), cotonetes, n-Butil-2-Cyanoacrylat, e 1x PBS. Coloque agarose fase prato em câmara de incubação para o pré-aquecimento.
2. A traqueotomia (10-15 min)
- Use camundongos C57BL / 6 a partir da casa de reprodutoras de 25-28 g. Casa os ratinhos sob condições específicas isentas de patogénios de acordo com as orientações FELASA, num ambiente de temperatura e humidade controladas com um ciclo luz / escuro de 12 h de 12 horas de luz. Permitir que os animais livre acesso à dieta padrão ratos (Sniff Padrão Rodent Diet) e água ad libitum.
- Anestesiar o mouse pelo initial intraperitoneal (ip) de injecção de 250 ul de solução de anestésico cetamina (II 0,1 mg / ml, xilazina 1 mg / ml, de Buprenorfina 10 ug / ml).
- * Para manutenção durante imagens intravital, administrar continuamente solução anestésica I por injecção contínua ip (cetamina 0,1 mg / ml, xilazina 0,5 mg / ml, 5 ug de fentanil / ml) usando um dispositivo de bomba de seringa com uma taxa de fluxo de 0,2 ml / h em combinação com inalação de isoflurano 0,5 vol% (v / v).
- Verifique reflexos após 5 min (por exemplo pitada almofada do pé com uma pinça), desinfectar a pele de traqueostomia, preparação começar se o mouse está em estado de anestesia cirúrgica tolerante.
- Aplicar olho creme de protecção (por exemplo, dexpantenol 50 mg / g) para evitar a córnea de secar (Figura 1B).
- Fixar do mouse sobre a preparação mesa expondo lado ventral usando fita adesiva para as extremidades; overstretch suavemente pescoço, fixar nessa posição, por exemplo., através da utilização de uma faixa de borracha t enganchadoo incisivos.
- Desinfectar pele e da pele utilizando uma solução de povidona-iodo, mediante a aplicação de desinfectante com uma cotonete.
- Efetuar corte inicial pele (0,5-1 cm de comprimento) diretamente abaixo do queixo (Figura 1C)
- Dissecar cuidadosamente tecido conjuntivo entre as glândulas salivares (Figura 1D).
- Retire com cuidado aberta muscular tubo circundante traquéia (Figura 1E, F).
- Coloque fio cirúrgico debaixo da traquéia para posterior fixação do tubo de ventilação (Figura 1G).
- Abrir traqueia com micro-tesoura entre anéis cartilaginosos realizando uma incisão em forma de T (Figura 1H)
- Coloque tubo de ventilação na traquéia através da incisão (~ 0,5 centímetros). Para empurrar o tubo para a frente, pegue final caudal com pequenas pinças anatômicas e avançar gentilmente o tubo na traquéia (Figura 1-I)
- Fixar tubo com fio cirúrgico (por exemplo, (Figura 1J, K).
- Corte do selo com cola de tecidos (por exemplo, n-butil-2-Cyanoacrylat) (Figura 1D).
- Fixar tubo na cabeça, usando fita adesiva.
3. laparotomia (15-20 min)
- Coloque o mouse sobre almofada de aquecimento para evitar a hipotermia. Shave abdômen, retire cuidadosamente o cabelo da pele. Desinfetar pele raspada e pele com a solução de iodopovidona.
- Realize uma pequena pele cortada abaixo do esterno utilizando uma tesoura cirúrgica (Figura 2A). Estender o corte lateralmente abaixo das costelas para ambos os lados, cauterização todos os vasos sanguíneos visíveis para evitar sangramento.
- Executar cuidadosamente um pequeno corte na linha alba abaixo do esterno, a abertura do peritônio (Figura 2B). Estender o corte para ambos os lados usando cauterizção para impedir o sangramento (Figura 2C, D).
- Coloque o mouse em agarose fase prato (Figura 2E). Inserir as pilhas de altura adequada em ambos os lados do rato (geralmente 12-14 lamelas) (Figura 2F).
- Coloque sensor de gatilho respiratório debaixo parte superior das costas para sincronizar o microscópio com a respiração. Ative unidade de gatilho (Figura 2G).
- Coloque fio cirúrgico (5-0) através do esterno para retrair costelas (Figura 2?).
- Cuidadosamente corte ligamento ligar fígado e diafragma (ligamento falciforme), bem como do tracto gastrointestinal e fígado usando tesouras cirúrgicas curvas. Cortar o ligamento falciforme para baixo na aorta (Figura 2J).
4. Configuração da amostra (10-15 min)
- Coloque o mouse sobre o lado direito, com um ângulo de 45 ° para facilitar o acesso a grande lobo hepático.
- Adicionar ponte encenar abaixo das costelas, que abrange o abdominalcavidade. Fabricação de uma ponte, usando uma lâmina de cobertura padrão com revestimento de fita adesiva para cobrir as bordas cortantes (Figura 2K).
- Coloque grande lobo hepático no palco. Deslizar cuidadosamente sonda stylus dupla bola ou uma espátula acolchoado abaixo do fígado e segure a parte superior do órgão com um cotonete molhado ou tecido molhado. Levante lobo para o slide e aplicar arrastar suave. Lobe pode ser dobrado ou enrolado. Prestar cuidados extra para só manipulação suave do fígado (Figura 2L).
- Coloque estacas laterais de apoio, por exemplo, pilhas de pequenas peças de cobertura (20 mm x 20 mm), com aproximadamente a mesma altura do lóbulo do fígado ao lado dela para suportar a cobertura de deslizamento.
- Coloque grande lamela (24 mm x 50 mm) no lóbulo do fígado. Certifique-se de que lamela é orientada mais horizontal possível (Figura 2 M).
NOTA: A cobertura de vidro deve estar em contato com o tecido sem apertar. Verifique se há sinais visíveis de fluxo sanguíneo prejudicado (tecido branco). Se microcircmento é interrompido, adicionar um maior apoio stakes. - * Coloque dois cateteres intraperitoneal independentes (Figura 2 N) para anestesia longo prazo e G-5 aplicação. Instale cateteres lateralmente na parte inferior do abdômen ao lado dos membros posteriores.
NOTA: Os cateteres intraperitoneais podem ser auto-fabricados através da ligação 27 agulhas G com tubagem de silicone flexível (Figura 3). - * Agulha Fixate com um laço de 5-0 cirúrgica na pele para evitar o deslocamento acidental.
- * Prenda bomba de seringa com solução anestesia I à cateterização 1, defina a taxa de fluxo de 0,2 ml / h; anexar bomba de seringa com G-5 ao cateter 2, definir taxa de fluxo de 0,1 ml / hr.
5. Rato Monitoring
- * Coloque eletrodos de ECG em frente e as extremidades traseiras (Figura 4A).
- * Conecte a tubulação de expiração para o CO 2 sensor de nível.
- Adicionar sensor de temperatura externo conectado a almofada de calor (Figura 4C).
6. Incorporação e fixação do tecido (5-10 min)
- Preparar 100 ml de 3% (w / v) de agarose em 1X PBS. Incorporar fígado quando a temperatura é 41 ° C, utilizando uma seringa de 5 ml e uma agulha de 18 G (Figura 5A).
- Pour agarose restante em lamela e em torno do rato (Figura 5B, C). Espere até agarose está totalmente gelatinizado.
- Retire o excesso de agarose usando a espátula Heidemann, preparando uma grande viewfield suficiente para digitalizar o lobo hepático preparado (Figura 5D, E).
7. Criação de Imagens
- Transferir o mouse na câmara de microscópio climáticas.
- Adicionar 50-100 ml de 1x PBS (pré-aquecido a 37 ° C).
- Cubra amostra prato para evitar a evaporação (Figura 5F).
- * Diminuição isoflurano inalativa de 0,5 Vol% (v / v).
- * Iniciar o monitoramento de software, a gravação de ECG, freqüência cardíaca e expiratória CO 2.
- Comece imagem: abrir lapersianas SER, identificar campos exibição de interesse, definir limites superior e inferior para Z-stacks, e começar a tempo de gravação lapso. Reajustar Z pilhas se necessário, para corrigir-Z deriva (ex., Devido a alterações na pressão sanguínea ou a variação de temperatura, Figura (5G).
NOTA: Após a conclusão do período de imagem, ou se a circulação ou anestesia dos animais torna-se instável, sacrificar os ratinhos por deslocamento cervical (sem despertar da anestesia).
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Representative Results
Para validar nossa abordagem TPLSM intravital, nós submetido GFP / + camundongos CXCR6 a imagem TPLSM intravital. Os ratos foram quer deixados sem tratamento como controlos de linha de base ou submetido a uma única injecção intraperitoneal de tetracloreto de carbono (CCl 4) para induzir danos no fígado aguda 20.
As sequências de vídeo foram tomadas ao longo de um período de tempo de 2-5 horas, e as células foram traçadas ao longo do tempo, devido à sua fluorescência verde. Para mostrar a motilidade celular geral, todas as faixas que foram detectados durante o procedimento foram representados como uma imagem sobreposta (Figura 6A). Enquanto as células sob condições de base apresentaram migração de longa distância ao longo dos sinusóides hepáticos para a veia central, 18 horas após o CCI4 tratamento das células + / GFP CXCR6 mostrou padrões de movimento já parcialmente depreciados. Apesar de algumas células em movimento rápido ainda estavam presentes nos sinusóides hepáticos, várias áreas focais eram visíveis com células quetinha mudado de migração aleatória de varrimento local, indicando uma resposta quimiotáctica recrutar as células para a área de lesão. O efeito foi ainda mais acentuada após 36 h, mostrando uma prisão quase completa das células CXCR6 + praticamente sem migração ativa. Embora sob condições basais maioria das células migratórias tinha velocidades de migração variável com mudanças de direção aleatórias, CCl 4 animais tratados apresentaram células que foram apenas lentamente rastejando, bem como algumas células livremente motilidade patrulhando as sinusóides depois de 18 horas, mas não depois de 36 horas. Usando faixas de migração codificados por cores, a velocidade célula pode ser visualizado directamente para avaliar o efeito do tratamento com CCl4. A migração foi prejudicada também visível no diagrama de pistas normalizada (Figura 6B), indicando que 18 horas após o CCl4 quantidade de longa distância faixas, bem como o comprimento do rasto médio foi significativamente reduzida, enquanto que após 36 horas sem células móveis foram detectáveis quaisquer mais. Em linha wom estes resultados, o deslocamento celular, que descreve a capacidade de uma célula para patrulha livremente na vasculatura, diminuiu ao longo do tempo, indicando um aprisionamento das células 36 horas após CCl4 tratamento no local da lesão hepatocelular (Figura 6C).
Para seguir o comportamento migratório das células CXCR6 + / GFP em fígado em mais pormenor, a velocidade de migração de células individuais representativos foi representada graficamente para visualizar o seu nível de motilidade ao longo do tempo. Nós e outros previamente descritos vários padrões de movimento distinto de CXCR6 células + / GFP: crawling aleatória ativa com a degola padrão rolando, mostrando as fases da motilidade celular e estados quiescentes temporais; dirigido recrutamento celular com células digitalizar uma área de interesse, mas ainda capaz de rastreamento ativo; detenção celular total acompanhado por activação de células imunes 18,20. Enquanto os ratos sem tratamento mostrou principalmente as células que estavam Moti livrementele com velocidades de até 15 mm / s, células CXCR6 + / GFP em camundongos tratados com CCl4 exibida uma redução marcada velocidade de migração celular e parada parcial já depois de 18 horas e parada migratória integral após 36 h (Figura 7a). De acordo com a análise de uma única célula, os dados estatísticos de todas as células dentro de uma seqüência revelou diminuir a velocidade de migração global após CCI4 tratamento (Figura 7B), que também foi assemelhava por velocidades de trilha médios (Figura 7C) e acompanhar as velocidades máximas de migração (Figura 7D), mostrando que a abordagem foi adequado para descrever as diferenças de migração celular e posicionamento no desenvolvimento de doença hepática.
Figura 1:. Tracheotomy do mouse (A) equipamentos cirúrgicos utilizados para a preparação. 1x patter padrãon fórceps, pinça 1x Semken, fórceps 1x Dumont No.7, fórceps Graefe (serrilhada, 2x straight / 1x curvas), afastadores 2x Blair (4 frentes (rombo)), sonda stylus duplo bola (por exemplo, Amálgama burnisher 3PL), Heidemann espátula HD2, porta-agulha (Mathieu ou Halsey), pequenas tesouras cirúrgicas 1x (sharp / sem corte, 1xcurved, 1x retas), micro-tesoura (eg, Vannas Primavera Scissors), 1x pequeno Cauter animal, cotonetes, Olho Salve protetora, cirúrgico rosca, n-Butil-2-Cyanoacrylatglue. (B) Os olhos são protegidos usando uma pomada protetora dos olhos. (C) corte da pele inicial para a preparação traquéia. (D) Dissecção do tecido conjuntivo entre glândulas salivares submandibular. (E) Exposition da traquéia. (F) dissecção do tecido muscular circundante traquéia. (G) A colocação de fio cirúrgico debaixo traquéia para fixação do tubo. (H) Tracheincisão al usando microtesoura entre anéis cartilaginosos superiores. (I) A inserção do tubo de ventilação na traquéia. (J) A colocação de fio cirúrgico craniana tubo para fixar à pele. (K) de fixação do tubo duplo. (I) Vedação incisão cirúrgica usando n-Butil-2-Cyanoacrylat. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2:. Laparotomia e fígado preparação (A) incisão cutânea inicial, os vasos sanguíneos foram cauterizados para evitar sangramento excessivo. (B) a abertura do peritônio debaixo do esterno. (C) A prorrogação do corte peritoneal usando unidade cautério. (D) Selagem de vasos epigástricos. (
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Figura 3:. Cateter intraperitoneal 27 agulhas G ligados com tubo de silicone flexível.
Figura 4: Acompanhamento do mouse. (A) A colocação de eletrodos de ECG (verde, vermelho, azul cabos). Agulhas para detecção ECG são colocados subcutaneamente como mostrado. (B) Monitoramento de ECG (vermelho), expiratório CO 2 (azul) e freqüência cardíaca (vermelho) de apresentar evolução a longo prazo (à esquerda) e medição real (à direita). (C) unidade de energia controlado por controle almofada de calor Temperatura. A temperatura é ajustada para 36 ° C. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Incorporação de fígado e de imagem. (A) A incorporação de lobo hepático. 3% de agarose em PBS é injetado a 41 ° C sob a cobertura de vidro usando uma seringa de 2 ml com agulha de 18G. (B) do lóbulo do fígado está totalmente incorporado em agarose para minimizar artefatos de movimento. (C) A vedação do peritoneu com o restante de agarose para evitar a desidratação. (D) A remoção do campo cobertura microscópio agarose de vista depois de gelatinização total. (E) Preparação de viewfield. F Ajustamento de-nível Z e avaliação do fluxo sanguíneo amostra usando microscopia de luz. (D) Cubra a assadeira para evitar a evaporação excessiva. A tampa é levantada na foto para mostrar a configuração. Por favor, clique aqui para ver um maiorversão desta figura.
Figura 6:. Seguimento de células CXCR6 gfp / + em danos no fígado crónica após injecção CCl4 Os ratinhos foram injectados ip com 0,6 ml / kg de CCl 4 dissolvido em óleo de girassol 18 h ou 36 h antes de imagem. No dia da experiência, os ratinhos foram submetidos a TPLSM intravital como descrito. (A) imagens de rastreamento de celular Still. Faixas de todos os pontos de tempo foram sobrepostas para mostrar motilidade celular e deslocamento. Imagens foram feitas usando um único feixe Titan Saphire Laser em 840 nm e um microscópio TPLSM. Áreas foram escaneados tendo 3-5 Z-stacks com uma profundidade de penetração de 70μm com uma taxa de amostragem de cerca de 30 segundos por ciclo de scan. Faixas foram codificados por cores para mostrar a velocidade de migração (azul claro: rotatividade ou células sésseis; roxo: células móveis). Barras de escala: 100 μ; M. (B) XY-diagramas de caminhos normalizado para sua origem, mostrando faixa direcionalidade e comprimento da pista (um). (C) o deslocamento total de células a partir de sua origem. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: As estatísticas de migração de células gfp CXCR6 / + seguido de TPLSM intravital no tecido do fígado na linha de base e CCl 4 ratinhos tratados As células foram analisadas quanto à sua velocidade de migração que patrulha o fígado.. (A) a velocidade Representante de células individuais seguido ao longo do tempo. A velocidade foi medida em cada ponto de tempo e traçada para cada quadro individualmente. As linhas representam as células individuais. Eixos Y são dimensionados de acordo com a velocidade máxima de migração. (B) Stanálise atistical de velocidades específicas A. Quadro de todas as células foram agrupadas e analisadas no início do estudo e CCI4 camundongos tratados. (C) A velocidade média foi calculada faixa por faixa e os dados de todas as faixas foram agrupados para análise. (D) A velocidade máxima de cada faixa foi traçada e analisados. Todos os experimentos foram realizados em grupos de 3 animais e os resultados foram confirmados em duas experiências independentes. *** P <0,001 (bicaudal teste t de Student não pareado). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O objetivo do nosso estudo foi desenvolver um método altamente padronizada, estável e reprodutível para a imagem latente TPLSM intravital do fígado. Imaging Intravital em geral deu informações valiosas sobre o comportamento celular sob condições reais seguintes homing e interação de diferentes populações de leucócitos em desenvolvimento, a homeostase e da doença. No entanto, a posição anatómica um pouco difícil de fígado, devido a que movimento respiratório e intestinal peristáltica são transmitidos directamente para o fígado, bem como a sua elevada fragilidade em relação a outros órgãos sólidos imposta vários desafios para imagens intravital estável a longo prazo. Nos últimos anos, muitos estudos experimentais em camundongos revelaram a natureza altamente dinâmica de infiltração de células imunes no fígado lesado 28, com importantes contribuições dos residentes ou infiltrando monócitos / macrófagos, neutrófilos 30-32 33 ou várias subpopulações celulares 34,35. No entanto, most destes dados foram obtidos a partir de análises de ponto final (por exemplo, multicolor citometria de fluxo após o sacrifício dos animais). Até agora apenas existem poucos estudos que descrevem a dinâmica do tráfego celular durante a inflamação do fígado usando imagens intravital multicolor. Usando microscópios invertidos contorna a necessidade de fixação e hidratação do fígado devido à adesão firme do tecido para o fundo de vidro 24. No entanto, uma vez que muitos microscópios Multiphoton são construídos como sistemas de imagem verticais, são necessários de preparação e métodos de fixação mais elaboradas para estabilizar o tecido para a obtenção de imagens. Comumente, os sistemas de estadiamento custom made foram descritas para fixação do tecido 6, 36,37, porém com estes é crucial para validar a microcirculação hepática, uma vez que a pressão mesmo mínima no tecido afeta o fluxo sanguíneo sinusoidal com efeitos ainda mais graves no fígado doente 38 .
Portanto, os seguintes pontos foram advestido com a configuração deste método para otimizar os resultados obtidos por in vivo TPLSM imagem: Melhorar a qualidade da preparação por perturbação da amostra minimizados e perturbação da microcirculação devido a lidar com questões de maior sobrevida dos animais; monitorização de cuidados intensivos e subsequente adaptação de anestesia, a respiração e a estabilização da circulação reforçada sobrevivência dos animais e artefactos fisiológicas minimizadas, por exemplo, causada por desequilíbrios no pH do sangue. Respiração controlada, em combinação com a imagem desencadeada era essencial para eliminar artefactos de movimento devido a sincronização do microscópio com os ciclos respiratórios. A incorporação do órgão em agarose contendo concentrações fisiológicas de sal foi benéfica para fixar suavemente o órgão após a preparação, sem qualquer outra manipulação mecânica e impediu também a desidratação da amostra. A maioria dos protocolos utilizados para a microscopia de fígado fornecer métodos só insuficientes para sta ble, anestesia longo prazo. No entanto, a sobrevivência dos animais pode ser significativamente melhorada com o protocolo fornecido aqui anestesia e em combinação com o controlo foi suficiente para garantir a sobrevivência de até 8 horas. Métodos alternativos são geralmente adequados para visualizar processos dentro de um período de tempo de até 3 horas, tais como invasão de neutrófilos 39, mas falta-lhes a possibilidade de imagem mais processos duradouros, tais como monócitos ou linfócitos invasão 22 ou mesmo 6 a proliferação celular. Compreender a dinâmica de recrutamento, infiltração e interação celular durante a inflamação hepática aguda e crônica podem fornecer uma visão mais detalhada sobre o desenvolvimento e progressão da doença hepática. Ao utilizar este melhor compreensão da imunopatologia, será possível conceber terapias muito mais refinado em termos de tratar as células-alvo de interesse, em vez de utilizar abordagens imunossupressores por exemplo, não selectivos.
ove_content "> Para abordar o posicionamento, a transmigração de leucócitos e de interacção, as imagens de alta qualidade são necessários para o rastreamento 4D precisa das células dentro da vasculatura hepática e fígado tecido 18,20,40.O método que proporcionam aqui pode ser aplicado, utilizando os reagentes e equipamentos de laboratório comuns, tornando-o ao mesmo tempo fácil de manusear e de custo eficiente com o mínimo de perturbação da amostra. Para manter as condições fisiológicas do rato por tanto tempo quanto possível, é necessário ajustar com precisão o volume respiratório e a frequência para controlar a oxigenação do sangue e os níveis de CO 2. Embora, devido à infusão contínua de líquidos no peritoneu não é, pelo menos, uma fonte de tentativa de estabilizar as medições de circulação, ECG e do ritmo cardíaco apenas permitir que um controle parcial sobre a estabilização da circulação. Com a implementação de controle da pressão arterial e aplicação direta líquido venoso central é provável que o PARAMET vitalers pode ser estabilizado ainda mais, levando a maior reforço da estabilidade e sobrevivência.
Mesmo sob condições altamente controladas, imagens de animais que foram submetidos a modelos de dano hepático comumente usados em camundongos como o paracetamol induzida danos no fígado, CCI4 induzida danos do fígado ou doença hepática gordurosa induzida alimentar continua sendo um desafio. Devido à função essencial do fígado no controle estado metabólico e sua posição central na circulação, alterações da funcionalidade do fígado ou microcirculação impacta diretamente a sobrevivência a longo prazo dos animais, portanto, limitando a possibilidade de obter TPLSM vídeo-sequências longas de pesadamente órgãos danificados, por exemplo, com hemorragias graves ou microvasculature destruído. Além disso, em severamente alterado microanatomy fígado como em modelos com necroses extensas, continua a ser difícil de estudar célula-célula-interações e compartimentalização local dos agregados de células inflamatórias, porque nenhum standardized "contra-coloração" para estruturas (tais como hematoxilina-coloração em microscopia convencional ou DAPI nas técnicas de imunofluorescência) está disponível para a qualidade TPLSM.The intravital dos dados obtidos pelo processo de imagem depende, ainda, da intensidade de marcação das células e a configuração microscópica.
Existem várias abordagens para a visualização de células GFP + no fígado. A maior fluorescência com muito baixa fluorescência de fundo é obtido entre 900 e 920 nm de comprimento de onda de excitação. A perda quase completa de fundo de fluorescência do fígado não permite investigar o posicionamento das células dentro do fígado, quando não utilizar rastreadores adicionais do reservatório, como dextrano ou lectina. Por isso, decidimos imagem os leucócitos migram em um comprimento de onda de 840 nm, dando a melhor relação entre o sinal de GFP e detalhada, mas não muito brilhante fundo fígado fluorescência.
Tomados em conjunto, o intrsistema de imagem avital TPLSM introduzido neste estudo pode ser aplicado a uma ampla variedade de questões de microscopia intravital específicas do fígado. Com esta abordagem, a imagem latente TPLSM em outros órgãos sólidos, tais como rim, fígado, bexiga, intestino ou pâncreas é viável com apenas pequenas modificações dos procedimentos cirúrgicos e estadiamento de tecido, proporcionando assim uma abordagem altamente flexível para investigar processos migratórios longo prazo de células em vivo.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthetics | |||
| Buprenorphine | Essex Pharma | 997.00.00 | Analgeticum, 0.1 mg/kg |
| Fentanyl | Rotex Medica | charge: 30819 | |
| Fluovac anesthesia system | Harvard Apparatus | 34-1030 | |
| Glucose 5% | Braun | ||
| ISOFLO (Isoflurane Vapor) vaporiser | Eickemeyer | 4802885 | |
| Isoflurane | Forene Abbott | B 506 | |
| Isotonic (0.9%) NaCl solution | DeltaSelect GmbH | PZN 00765145 | |
| Ketamin 10% | ceva | Charge: 36217/09 | |
| Xylazin 2% | medistar | Charge: 04-03-9338/23 | |
| Consumable supplies | |||
| 20 ml Syringe | BD Plastipak | ||
| 250 ml Erlenmeyer flask | Schott Duran | 21 226 36 | |
| 25 ml Beaker 2x | Schott Duran | 50-1150 | |
| 2 ml syringe | BD Plastipak | ||
| 4-0 Vicryl suture | Ethicon | V7980 | |
| Agarose | commercially available | ||
| Bepanthen Eye and Nose ointment | Bayer Vital GmbH | 6029009.00.00 | |
| Change-A-Tip Deluxe High-Temp Cautery Kit | Fine Science Tools Inc. | 18010-00 | |
| Cotton Gauze swabs | Fuhrmann GmbH | 32014 | |
| Cover Slip 24x50 mm | ROTH | 1871 | |
| Durapore silk tape | 3M | 1538-1 | |
| Feather disposable scalpel | Feather | 02.001.30.011 | |
| Fine Bore Polythene Tubing 0.58 mm ID | Smiths medical | 800/100/200 | |
| Histoacryl | Braun | 1050052 | 5x 0.5 ml |
| Leukoplast | BSN Medical Inc. | ||
| Microscope Slides | ROTH | 1879 | |
| Poly-Alcohol Haut…farblos Antisepticum | Antiseptica GmbH | 72PAH200 | |
| Sterican needle 18 G x 1 | B. Braun | 304622 | |
| Sterican needle 27 3/4 G x 1 | B. Braun | 4657705 | |
| Tissue paper | commercially available | ||
| Surgical Instruments | |||
| Amalgam burnisher 3PL | Gatz | 0110? | |
| Blair retractors (4 pronged (blunt)) x2 | Storz&Klein | S-01134 | |
| Dumont No.7 forceps | Fine Science Tools Inc. | 91197-00 | |
| Graefe forceps curved x1 | Fine Science Tools Inc. | 11151-10 | |
| Graefe forceps straight x2 | Fine Science Tools Inc. | 11050-10 | |
| Heidemann spatula HD2 | Stoma | 2030.00 | |
| Needle holder Mathieu | Fine Science Tools Inc. | 12010-14 | |
| Scissor | Fine Science Tools Inc. | 14074-11 | |
| Semken forceps | Fine Science Tools Inc. | 11008-13 | |
| Small surgical scissors curved | Fine Science Tools Inc. | 14029-10 | |
| Small surgical scissors straight | Fine Science Tools Inc. | 14028-10 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools Inc. | 11000-12 | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools Inc. | 15000-08 | |
| Equipment | |||
| ECG Trigger Unit | Rapid Biomedical | 3000003686 | |
| MICROCAPSTAR End-Tidal Carbon Dioxide Analyzer | AD Instruments | ||
| Minivent Typ 845 | Harvard Apparatus | 73-0043 | |
| Multiphoton microscope Trimscope I | LaVision | ||
| Perfusor Compact | B. Braun | ||
| PowerLab 8/30 8 channel recorder | AD Instruments | PL3508 | |
| Temperature controlled heating pad | Sygonix | 26857617 | |
| Temperature sensor | comercially available | ||
| Temperature controlled System for Microscopes -Cube&Box | Life Imaging Services |
References
- Dusseaux, M., et al. Human MAIT cells are xenobiotic-resistant, tissue-targeted, CD161hi IL-17-secreting T cells. Blood. 117 (4), 1250-1259 (2011).
- Reese, A. J. The effect of hypoxia on liver secretion studied by intravital fluorescence microscopy. Br J Exp Pathol. 41, 527-535 (1960).
- Bhathal, P. S., Christie, G. S. Intravital fluorescence microscopy study of bile ductule proliferation in guinea pigs. Gut. 10 (11), 955 (1969).
- Stefenelli, N. Terminal vascular system and microcirculation of the rat liver in intravital microscopy. Wien Klin Wochenschr. 82 (33), 575-578 (1970).
- Hori, T., et al. Simple and sure methodology for massive hepatectomy in the mouse. Ann Gastroenterol. 24 (4), 307-318 (2011).
- Tanaka, K., et al. Intravital dual-colored visualization of colorectal liver metastasis in living mice using two photon laser scanning microscopy. Microsc Res Tech. 75 (3), 307-315 (2011).
- Schemmer, P., Bunzendahl, H., Klar, E., Thurman, R. G. Reperfusion injury is dramatically increased by gentle liver manipulation during harvest. Transpl Int. 13, Suppl 1. S525-S527 (2000).
- Schemmer, P., et al. Activated Kupffer cells cause a hypermetabolic state after gentle in situ manipulation of liver in rats. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 280 (6), G1076-G1082 (2001).
- Toiyama, Y., et al. Intravital imaging of DSS-induced cecal mucosal damage in GFP-transgenic mice using two-photon microscopy. J Gastroenterol. 45 (5), 544-553 (2010).
- Zimmon, D. S. The hepatic vasculature and its response to hepatic injury: a working hypothesis. Yale J Biol Med. 50 (5), 497-506 (1977).
- Wong, J., et al. A minimal role for selectins in the recruitment of leukocytes into the inflamed liver microvasculature. J Clin Invest. 99 (11), 2782-2790 (1997).
- Bonder, C. S., et al. Essential role for neutrophil recruitment to the liver in concanavalin A-induced hepatitis. J Immunol. 172 (1), 45-53 (2004).
- Xu, C., Zipfel, W., Shear, J. B., Williams, R. M., Webb, W. W. Multiphoton fluorescence excitation: new spectral windows for biological nonlinear microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (20), 10763-10768 (1996).
- Centonze, V. E., White, J. G. Multiphoton excitation provides optical sections from deeper within scattering specimens than confocal imaging. Biophys J. 75 (4), 2015-2024 (1998).
- Amore, J. D., et al. In vivo multiphoton imaging of a transgenic mouse model of Alzheimer disease reveals marked thioflavine-S-associated alterations in neurite trajectories. J Neuropathol Exp Neurol. 62 (2), 137-145 (2003).
- Hickey, M. J., Westhorpe, C. L. V. Imaging inflammatory leukocyte recruitment in kidney, lung and liver--challenges to the multi-step paradigm. Immunol Cell Biol. 91 (4), 281-289 (2013).
- McLellan, M. E., Kajdasz, S. T., Hyman, B. T., Bacskai, B. J. In vivo imaging of reactive oxygen species specifically associated with thioflavine S-positive amyloid plaques by multiphoton microscopy. J Neurosci. 23 (6), 2212-2217 (2003).
- Geissmann, F., et al. Intravascular Immune Surveillance by CXCR6+ NKT Cells Patrolling Liver Sinusoids. PLoS Biology. 3 (4), (2005).
- Velázquez, P., et al. Cutting edge: activation by innate cytokines or microbial antigens can cause arrest of natural killer T cell patrolling of liver sinusoids. J Immunol. 180 (4), 2024-2028 (2008).
- Wehr, A., et al. Chemokine receptor CXCR6-dependent hepatic NK T Cell accumulation promotes inflammation and liver fibrosis. J Immunol. 190 (10), 5226-5236 (2013).
- Khandoga, A., Hanschen, M., Kessler, J. S., Krombach, F. CD4+ T cells contribute to postischemic liver injury in mice by interacting with sinusoidal endothelium and platelets. Hepatology. 43 (2), 306-315 (2006).
- Egen, J. G., et al. Macrophage and T cell dynamics during the development and disintegration of mycobacterial granulomas. Immunity. 28 (2), 271-284 (2008).
- Beattie, L., et al. Leishmania donovani-induced expression of signal regulatory protein alpha on Kupffer cells enhances hepatic invariant NKT-cell activation. Eur J Immunol. 40 (1), 117-123 (2010).
- Beattie, L., et al. Dynamic imaging of experimental Leishmania donovani-induced hepatic granulomas detects Kupffer cell-restricted antigen presentation to antigen-specific CD8 T cells. PLoS Pathog. 6 (3), e1000805 (2010).
- McDonald, B., et al. Intravascular danger signals guide neutrophils to sites of sterile inflammation. Science. 330 (6002), 362-366 (2010).
- Vanheule, E., et al. An intravital microscopic study of the hepatic microcirculation in cirrhotic mice models: relationship between fibrosis and angiogenesis. Int J Exp Pathol. 89 (6), 419-432 (2008).
- Jenne, C. N., Kubes, P. Immune surveillance by the liver. Nat Immunol. 14 (10), 996-1006 (2013).
- Zimmermann, H. W., Tacke, F. Modification of chemokine pathways and immune cell infiltration as a novel therapeutic approach in liver inflammation and fibrosis. Inflamm Allergy Drug Targets. 10 (6), 509-536 (2011).
- Kim, J. V., et al. Two-photon laser scanning microscopy imaging of intact spinal cord and cerebral cortex reveals requirement for CXCR6 and neuroinflammation in immune cell infiltration of cortical injury sites. J Immunol Methods. 352 (1-2), 89-100 (2010).
- Karlmark, K. R., et al. Hepatic recruitment of the inflammatory Gr1+ monocyte subset upon liver injury promotes hepatic fibrosis. Hepatology. 50 (1), 261-274 (2009).
- Heymann, F., et al. Hepatic macrophage migration and differentiation critical for liver fibrosis is mediated by the chemokine receptor C-C motif chemokine receptor 8 in mice. Hepatology. 55 (3), 898-909 (2012).
- Ramachandran, P., et al. Differential Ly-6C expression identifies the recruited macrophage phenotype, which orchestrates the regression of murine liver fibrosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (46), E3186-E3195 (2012).
- Moles, A., et al. A TLR2/S100A9/CXCL-2 signaling network is necessary for neutrophil recruitment in acute and chronic liver injury in the mouse. J Hepatol. 60 (4), 782-791 (2014).
- Hammerich, L., et al. Chemokine receptor CCR6-dependent accumulation of γδ T cells in injured liver restricts hepatic inflammation and fibrosis. Hepatology. 59 (2), 630-642 (2014).
- Syn, W. -K., et al. NKT-associated hedgehog and osteopontin drive fibrogenesis in non-alcoholic fatty liver disease. Gut. 61 (9), 1323-1329 (2012).
- McDonald, B., et al. Interaction of CD44 and hyaluronan is the dominant mechanism for neutrophil sequestration in inflamed liver sinusoids. J Exp Med. 205 (4), 915-927 (2008).
- Egen, J. G., et al. Intravital imaging reveals limited antigen presentation and T cell effector function in mycobacterial granulomas. Immunity. 34 (5), 807-819 (2011).
- Singer, G., Stokes, K. Y., Granger, D. N. Hepatic microcirculation in murine sepsis: role of lymphocytes. Pediatr Surg Int. 24 (1), 13-20 (2008).
- Phillipson, M., Kubes, P. The neutrophil in vascular inflammation. Nat Med. 17 (11), 1381-1390 (2011).
- Khandoga, A. G., et al. In vivo imaging and quantitative analysis of leukocyte directional migration and polarization in inflamed tissue. PLoS One. 4 (3), e4693 (2009).
