Pairwise צמיחת התחרות Assay לקביעת כושר השכפול של וירוסי כשל חיסוני אנושיים

Summary

Growth competition between nearly isogenic viruses provides a sensitive measurement for determining relative replication fitness. The protocols described here include the construction of recombinant HIV-1 clones, virus propagation and growth competition and analysis methods optimized to yield sensitive and consistent results.

Abstract

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to extrapolate viral replication fitness, ranging from the number of viral particles per infectious unit, growth rate in cell culture, and relative fitness derived from multiple-cycle growth competition assays. Growth competition assays provide a particularly sensitive measurement of fitness since the viruses are competing for cellular targets under identical growth conditions. There are several experimental factors to consider when conducting growth competition assays, including the multiplicity of infection (MOI), sampling times, and viral detection and fitness calculation methods. Each factor can affect the end result and hence must be considered carefully during the experimental design. The protocol presented here includes steps from constructing a new recombinant HIV-1 clone to performing growth competition assays and analyzing the experimental results. This protocol utilizes experimental parameter values previously shown to yield consistent and robust results. Alternatives are discussed, as some parameters need to be adjusted according to the cell type and viruses being studied. The protocol contains two alternative viral detection methods to provide flexibility as the availability of instruments, reagents and expertise varies between laboratories.

Introduction

כושר שכפול נגיפי מוגדר כיכולת של וירוס לייצר צאצאי זיהומיות בסביבת נתונה ¹ והוא גורם תורם חשוב בקביעת השכיחות של גרסת וירוס ברמת האוכלוסייה לאורך זמן ^2. כמו במחקרים vivo כושר אינם אפשריים עם וירוסים פתוגניים אדם, כגון HIV-1, שונים במבחנה לשעבר vivo מבחני כושר שכפול פותחו כדי לחקור את ההשפעות על כושר הנובעות מהתנגדות לסמים ומוטציות בריחה חיסוניות, epistasis והאבולוציה אוכלוסיות נגיפיות של ^3-6. בין מבחני כושר שונים, מבחני תחרות צמיחה מוכרים להניב אמצעים רגישים יותר ותקפים של הבדלי כושר, כשתיים או יותר גרסאות נגיפיות להתחרות על אותה אוכלוסיית התא תחת בדיוק אותם התנאים סביבתיים, כפי שקורית בvivo ^1,7,8. לפני, כמה variab מתחיל ניסויי תחרות צמיחהles צריך להיקבע, כולל השימוש בmultiplicities שונה של זיהום (משרד הפנים), יחס קלט נגיפי, ועיתוי של דגימה לניתוח. יש לנו חקרנו את ההשפעות של פרמטרים אלה על קינטיקה צמיחה נגיפית ועל התוצאות של ניסויי תחרות, וזיהינו גורמי מפתח הכרחיים למדידות חזקות של כושר HIV-1 בתא התרבות ^9.

בנוסף למשתני assay, יש מגוון של שיטות לquantitating גרסאות נגיפיות בניסויי תחרות צמיחה. ^12,13 רצף גורף ^10,11 או משובט נעשה שימוש כדי לקבוע את היחס של הווירוסים המתחרים המבוססים על תדרי נוקלאוטיד באתר (ים) של עניין. כושר יחסית נגזר משינויים ביחס זה לאורך זמן. שיטה זו היא נוחה שירותי רצפי DNA זמינים באופן נרחב. רצף אלל ספציפי המקביל השיטה (PASS) מאפשר רצף במספר רב של אתרים וזיהוי של recombinants ¹⁴ </sup>, אבל זה גם דורש חומרים כימיים שפותחו במיוחד ומערכות גילוי. בעיקרו של דבר, בשיטות אלה פותחו ללמוד זני נגיפים עם מספר קטן של הבדלי נוקלאוטיד באזור של עניין. שיטות אחרות להשתמש גן כתב קטן ¹⁵ או נרדף מוטציות ^4,16-18 כתגים להבחין וירוסים מתחרים על ידי רצף, מבחני מעקב heteroduplex (פח"ע) ^4,7,17,19 או להפוך תגובת שרשרת של פולימראז בזמן אמת תמלול בכמותיים (RT-qPCR) ^15,16,18,20, כל מה שיכול להיות שהוחל ללמוד מתחרים זנים ללא קשר לדמיון רצף. צעד נוסף נדרש להציג תגים להגנום נגיפי וassay RT-qPCR גם דורש ריאגנטים ומכשור ספציפיים. מצאנו כי תשואות בתפזורת סנגר רצף תוצאות דומות ^9.

בעקבות תחרות צמיחה, כושר שכפול נגיפי מוצג ככושר יחסי, או יחס בין כושר tוו גרסאות נגיפיות. הכושר היחסי של וירוס יכול להיות מוגדר כחלק הסופי של גרסה נגיפית המנורמל על ידי החלק הראשוני שלה בבידוד או כהפרש שיעור צמיחת נטו בין שני הווירוסים המתחרים. מצאנו שהשיטה השנייה, שימוש בנקודתי נתוני אורך רק במסגרת שלב הגידול מעריכי, הניבה את התוצאות חזקות ביותר ^9,20.

במבחנה מבחני כושר משמשים בעיקר ללמוד שיבוטים ביולוגיים ^6-8 ושיבוטים מולקולריים זיהומיות של HIV-1. האחרון, שניתן למניפולציה גנטית, לעתים קרובות מועסק כדי לחקור את ההשפעה על כושר ממוטציות מסוימות או רצפים ספציפיים של עניין ^3-5,21,22. הפרוטוקולים הבאים מתארים זרימת עבודה מנקודת בניית HIV-1 שיבוטים מולקולריים זיהומיות באורך מלא החדש באמצעות HIV-1 המכילים וקטורי תג רצף, החדרת מוטציות של עניין, מה שהופך את המניות נגיפיות והקמת קינטיקה צמיחת ויראלי, לביצוע assay תחרות צמיחה וחישוב כושר יחסי (איור 1).

באמצעות הנהלים המותאמים, יצרנו שלוש מוטציות HIV-1 רקומביננטי ונקבעו כושר שכפולם. השיבוט המולקולרי רקומביננטי נבנה ראשון על ידי החלפת אזור גן איסור הפרסום-p24 HIV-1 של pNL4-3, פלסמיד המכיל הגנום זיהומיות באורך מלא של מעבדה זן HIV-1 NL4-3, עם COTB סינטטי (המרכז-של- עץ, תת סוג B) רצף איסור הפרסום-p24 ²³ כדי ליצור את מתח אב הטיפוס. שינויי אמינו בודדים (T186M, T242N, וI256V) היו אז הציגו ליצור שלושה שיבוטים מוטציה. כל מוטציה שהתחרתה נגד וירוס אב הטיפוס להתבונן השפעת הכושר של כל מוטציה ברקע הגנטי המסוים. שלוש מוטציות הפגינו רמות משתנות של fsitness שכפול מקלים לנמוך משמעותית מוירוס אב הטיפוס. המוטציה T242N דווחה בעבר שיש fitne מתוןss יעלה ^24-26, דומה לתוצאות שמוצגת במחקר זה. עלות הכושר של שתי מוטציות האחרות שלא דווחה בעבר.

Protocol

הערה: הפרוטוקול, כפי שתתואר להלן, אינה כולל מידע המאפשר זיהוי מטופל ובכך לא נחשבת מחקר בבני אדם על ידי דירקטוריון הסקירה המוסדי אוניברסיטת וושינגטון או חטיבת בני אדם. 1. בנייה של המשובטים מולקולריים NL4-3 כימרי HIV-1 1.1) להגביר הכנס DNA שבר לתכנן פריימרים chimeric. חצאים '5 של שני קדימה ולהפוך פריימרים לכלול רצף וקטור HIV-1, שבו שבר יוכנס. מחצית 3 'של פריימרים חייבת לכלול סוף רצף ההוספה (איור 2). ודא שרצף פריימר chimeric שומרת לעצמה את מסגרות קריאה פתוחות המקוריות. השתמש פריימרים לפחות 20 בסיסים באורך, עם טמפרטורת התכה גדולה או שווה ל -60 מעלות צלזיוס, ~ 50% תוכן GC, ונטייה נמוכה ליצירת הדימרים, heterodimers פריימר ו / או מבני סיכת ראש. להעריך נכסים אלהבאמצעות כלי האינטרנט OligoAnalyzer (https://www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/). השימוש PCR 27 ופריימרים chimeric כדי להגביר DNA להוסיף (איור 2). עבור כל תגובת PCR, להשתמש חיץ 1X איכות גבוהה, 0.2 dNTPs מ"מ, 1 U של DNA פולימרז נאמנות הגבוה, 0.5 מיקרומטר של פריימר chimeric קדימה, 0.5 מיקרומטר של פריימר chimeric ההפוך, וng pg0 1 של דגימת DNA נושאת אזור הוספה. להוסיף DH 2 O לנפח סופי של 50 μl. הגדר את צעדי רכיבה תרמית כדלקמן: בצע צעד denaturation DNA ראשוני על 98 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות. להגביר עם 30 מחזורים של denaturation DNA על 98 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות חישול ו- DNA ב 3 ° C מעל טמפרטורת ההתכה הנמוכה ביותר של שני פריימרים במשך 20 שניות. לבצע הרחבה סופית על 72 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. מוצרי ה- PCR חנות ב 4 מעלות צלזיוס. קח 5 μl של מוצרי ה- PCR מהשלב קודם ולהפעיל ג'ל אלקטרופורזה agarose 28. השתמש ג'ל 0.7% agarose, חיץ 1x טה (40 מ"מ טריס-אצטט, 1 mM EDTA), 0.5 מיקרוגרם / מיליליטר ethidium ברומיד (EtBr) ריכוז סופי וסולם 1 KB כסמן גודל DNA. מתח מקור כוח סט 5 מרחק V / סנטימטר בין האלקטרודות. עצור את אלקטרופורזה כאשר טעינת הצבע נודד דרך על 2/3 מאורך ג'ל. דמיין את הג'ל באמצעות מערכת תיעוד ג'ל 28. הערה: EtBr הוא קרצינוגן חשד וחייב להיות מסולק כראוי ל, על פי תקנות מוסד. כפפות תמיד צריכים להיות משוחק בעת טיפול ג'לי המכיל EtBr. לשנות לכפפות חדשות לאחר EtBr טיפול גימור המכיל חומר ולפני הטיפול בחומרים או ציוד אחרים על מנת למנוע זיהום צולב. אם להקת DNA רק אחד עם הגודל המתאים למוצר PCR הרצוי מזוהה, לטהר את שאר מוצר ה- PCR באמצעות ערכה מסחרית כגון הסכם ערכת ה- PCR QIAquick טיהורing לפרוטוקולים של היצרן. אם להקות אחרות, שאינן ספציפיות גם בהווה, להשתמש בשאר מוצר ה- PCR לרוץ ג'ל אלקטרופורזה preparative. השתמש באותם הפרמטרים ותנאים המפורטים בשלב 1.1.4. ודא שגם ג'ל הוא גדול מספיק כדי לטעון ~ 45 μl של מוצרי ה- PCR. חותך את הלהקה של ריבית ולחלץ את ה- DNA מג'ל באמצעות ערכת חילוץ ג'ל QIAquick על פי הפרוטוקולים של היצרן. 1.2) להציג פיסה הכנס לאורך מלא זיהומיות HIV-1 סוג משנה B וקטור (pNL4-3) השתמש במוצרי PCR מטוהרים מצעד 1.1.5 כפריימרים PCR. השתמש pNL4-3VifA 20 כתבנית ה- DNA באחד תגובת PCR ולהשתמש pNL4-3VifB 20 כתבנית בתגובה אחרת (איור 2). עבור כל תגובת PCR, להשתמש חיץ איכות גבוהה 1x, 0.2 מ"מ dNTPs, 2 U של DNA פולימרז נאמנות הגבוה, 500 ng של DNA פריימר ו -50 ng של תבנית ה- DNA בכרך אחרוןUme של 50 μl. הגדר את הפרמטרים רכיבה תרמית ל: 98 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 35 מחזורים 98 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות, 48 מעלות צלזיוס במשך דקות 1 ו -72 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות, ואחריו 72 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. הוסף 10 U של DPN אני 50 μl של תגובת PCR ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 לעכל את תבנית ה- DNA. ודא שה- DNA פלסמיד מבודד ממתילציה זן חיידקים מוסמך, למשל., Escherichia coli כימי המוסמך TOP10. השימוש DPN אני מתעכל מוצר להפוך תאי חיידקים המוסמכים. השתמש שינוי חום-הלם עם TOP10 כימי מוסמך E. coli, על פי הפרוטוקול של היצרן. כדי לבחור עבור תאי חיידקים המכילים פלסמיד רקומביננטי, להשתמש בצלחות תרבות וריא מרק (LB) המכילות carbenicillin / L 100 מ"ג. פיק ~ 10 מושבות מופרדות היטב ולגדול, כל אחד בנפרד ב 3 מיליליטר נוזל LB המכיל 100 מ"ג / carbenicillin L ולדגור על 30 מעלות צלזיוס בO ייקר / N. השתמש ערכת Miniprep ספין QIAprep לבודד פלסמיד דנ"א מתרבות נוזל החיידקים, על פי הפרוטוקול של היצרן. השתמש עיכול הגבלה כפולה 29 כדי לקבוע אם פלסמיד דנ"א מכיל את התוסף המתאים. ודא שאחד אתרי ההגבלה קיים רק באזור להוסיף ואתר ההגבלה האחר קיים רק פעם אחת בווקטור HIV-1, מחוץ לאזור ההוספה. התקציר לפחות 300 ng של DNA פלסמיד בμl 10 תגובה אחרונה נפח. מאגרים בחרו הגבלה, טמפרטורת דגירה וזמן דגירה על פי הפרוטוקול של היצרן של אנזימי הגבלה שנבחרו. קח 9 μl של אלקטרופורזה DNA וג'ל הריצה מתעכל כמתואר בשלב 1.1.4. בחר פלסמידים רקומביננטי שיש להקות ה- DNA של הגדלים חזו. לאשר שלמות רצף של פלסמידים רקומביננטי על ידי רצף סנגר. בעוד נדיר, לא רצוימוטציה (ים) יכולה להיות מוצגת במהלך PCR התגובות. רצף שני הגדילים של ה- DNA פלסמיד. עקוב אחר הוראות בשלב 1.1.1.1 לתכנן פריימרים רצף. בנוסף, ודא שקדימה הפוך לחשל פריימרים רצף לפחות 50 נ"ב במורד זרם של האזור להוסיף בפלסמיד רקומביננטי, בהתאמה. שלח פלסמיד דנ"א ופריימרים רצף לספקית שירות רצפי DNA מסחרי. הכן דגימת DNA ופריימרים כמפורט על ידי ספק השירות. הפוך ללא מניות רעלן פנימי של פלסמיד דנ"א המוטציה באמצעות ערכת פלסמיד דנ"א החופשי רעלן פנימי על פי הפרוטוקול של היצרן. הכן מיקרוגרם לפחות 1 של ה- DNA פלסמיד ללא רעלן פנימי לtransfection בשלב הבא. ויה 1.3) להציג בקנה מידה קטנה מוטציות אתר בימוי mutagenesis לתכנן פריימרים mutagenic עם חופף קדימה הפוך פריימרים המכילים mutat הרצוייון (ים). מקם את הבסיס (ים) שהוחלף, הוכנס, או נמחק באמצע פריימרים, מוקף 10-15 בסיסים הומולוגיים. עקוב אחר הוראות בשלב 1.1.1.1. השתמש PCR לסנתז פלסמידים מוטציה. עבור כל תגובת PCR, להשתמש חיץ איכות גבוהה 1x, 10 מ"מ dNTPs, 2 U של DNA פולימרז נאמנות הגבוה, 0.5 מיקרומטר של פריימר mutagenic קדימה, 0.5 מיקרומטר של פריימר mutagenic ההפוך ו -50 ng של pNL4-3VifB chimeric, מצעד 1.2.6 , בנפח סופי של 50 μl. הגדר את הפרמטרים רכיבה תרמית ל: 98 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 25 מחזורים 98 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות, 48 מעלות צלזיוס במשך דקות 1 ו -72 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות, ואחריו 72 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. חזור על שלב 1.2.2 ל1.2.6. 2. דור של מניית ויראלי שימוש Transfection לחשב את כמות ה- DNA המניה הרצויה ופלסמיד הנגיפי הנדרש. עם כייל נגיף של 10 IU 4 / מיליליטר או גבוה יותר, 1.8 מיליליטר של מניית ויראלי מספיק עבור שתי קבוצות של אסא תחרות הצמיחהי"ש, כולל monoinfections, כל שנעשה בשלושה עותקים. לtransfection נעשה בצלחת 6-היטב, על 1.8 מיליליטר supernatant שנקטפו בכל טוב. מיקרוגרם אחד פלסמיד דנ"א נחוץ לכל transfection נעשה בצלחת 6 היטב. לכל גם צלחת 6-גם, להכין תערובת transfection, למשל 100 μl., בהיקף של מגיב μl 1 X-tremeGENE 9 transfection (או מוצר דומה), 1 מיקרוגרם של ה- DNA פלסמיד והסרום ללא DMEM. לקבוע את עוצמת הקול של ה- DNA פלסמיד צורך, באמצעות פלסמיד דנ"א 1 מיקרוגרם לכל טוב. ודא שהריכוז הסופי של ה- DNA פלסמיד הוא לפחות 50 ng / μl. לקבוע כמה בינוני סרום ללא (DMEM) נחוץ לכל גם באמצעות הנוסחא: היקף כולל של DMEM ב= 100 μl μl – DNA נפח בμl. להוסיף תאי 10 6 HEK 293T-17 (ATCC) / גם ב 2 מיליליטר של התפשטות בינונית (DMEM + 10% בסרום שור עוברי (FBS)) לתוך צלחת 6-גם. דגירה עבור שעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס ב5% אווירת CO 2. זרעי בארות רבות כמו צורך (שנקבעו בשלב 2.1). כדי להכין את תערובת transfection, aliquot הנפח המתאים של סרום ללא DMEM, כפי שמחושב לעיל, לתוך צינור microcentrifuge 1.8 מיליליטר פוליפרופילן, ולאחר מכן להוסיף את מגיב transfection. מגיב פיפטה ישירות לתוך פתרון התקשורת, לא להוסיף אותו למשטח הפלסטיק של צינור microcentrifuge. להוסיף פלסמיד דנ"א האחרון. Pipet למעלה ולמטה בעדינות לתערובת הפתרון. דגירה במשך 15 דקות ב RT (15 מעלות צלזיוס עד 25 מעלות צלזיוס), כדי לאפשר ההיווצרות של קומפלקסי transfection. מוסיף את התערובת באופן טיפה חכמה לתאי זרע בצלחת 6 היטב. נער בעדינות או מערבולת הבארות כדי להבטיח חלוקה שווה של קומפלקסי transfection. צלחות חותם בניילון נצמד. דגירה תרבויות על 37 מעלות צלזיוס באווירת 5% CO 2 למשך 48 שעות. השתמש פיפטה לאסוף בזהירות ולהעביר supernatant לצינור 15 מיליליטר throuGH עליון 0.22 מיקרומטר סינון. השתמש פיפטה להעביר 250 μl או יותר מsupernatant המסונן 1.8 מיליליטר צינורות microfuge עם אטמי גומי במכסים. חנות מסוננת supernatants ב -80 ° C עד שימוש. 3. לקבוע זיהומיות כייל של מניות ויראלי בתאי הדם ההיקפיים mononuclear (PBMCs) לעורר PBMCs עם phytohemagglutinin (PHA). למניית ויראלי אחד, זרע 2 x 10 6 PBMCs במדיום של Iscove המלא השתנה Dulbecco (cIMDM; IMDM בתוספת 20 U / ml של אינטרלוקין האנושי 2 (Hil-2), 10% בסרום שור עוברי 1% פניצילין / סטרפטומיצין) בתוספת עם PHA (1.5 מיקרוגרם / מיליליטר). PBMCs הזרע ב 2 x 10 6 תאים / מיליליטר. דגירה PBMCs על 37 מעלות צלזיוס באווירת 5% CO 2 למשך 72 שעות. קציר PHA גירוי PBMCs. העבר את PHA-PBMCs לא חסיד לצינור חרוטי 50 מיליליטר. ספין צינור ב228 XG במשך 10 דקות. להסיר supernatant בזהירות מבלי disruptinז התא גלולה. להשעות מחדש את התא גלולה לריכוז סופי של 2 x 10 5 / מיליליטר PBMCs בcIMDM. הזרע 2 x 10 4 PHA גירוי PBMCs / גם ב 100 μl / גם cIMDM בצלחת 96-היטב תחתית עגולה. הפוך דילול 1:10 של מניית ויראלי. ואז, מהמניות בדילול מלא הראשונות, להפוך את שנים עשר דילולים סדרתי של פי 3 בצלחת שני 96-היטב. תכנית דילול זו מומלצת לאיתור titers ויראלי בטווח של 10 אפריל – 10 יוני יחידת זיהומיות (IU) לכל מיליליטר. לדוגמא, להוסיף 20 μl של מניות וירוס 180 מדיה μl בצינור 1.5 מיליליטר. מערבבים את הדילול ידי pipetting בזהירות. לאחר מכן להעביר 90 μl של המניה מדוללת לתקשורת 180 μl של הבאר הראשונה ומערבבים היטב על ידי pipetting. סדרת דילול המשך על ידי העברת 90 μl מהבאר הנוכחית 180 מדיה μl בבאר הבאה אחת עשרה פעמים יותר. להגדיל או להקטין את הדילול הראשוני אם titers גבוה יותר מאשר 10 6 IU / mlאו נמוך מ -10 4 IU / ml צפוי, בהתאמה. הוסף 40 μl של מניית ויראלי בדילול סדרתי מצלחת דילול אדון לצלחת PBMCs זרע (משלב 3.3) ארבע פעמים. דגירה צלחות על 37 מעלות צלזיוס באווירת 5% CO 2 במשך 16-24 שעות. מוציא בזהירות של supernatant 100 μl מכל טוב, ולהחליף עם 160 μl של cIMDM הטרי להיקף כולל של 200 μl / טוב. דגירה צלחות על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 אווירה (יום 1). בימים 4, 7, 10 ו -13 העברת supernatant 100 μl מכל טוב עד 100 חיץ שיבוש μl (2% TritonX-100 ב PBS), ולהחליף עם של cIMDM הטרי 100 μl. אחסן את supernatants ב -20 ° C. שמור דגימה והוספת cIMDM הטרי כל שלושה ימים עד שכייל מייצב. לקבוע 50% מינון תרבית רקמת זיהומיות (50 TCID) של מניית ויראלי ידי p24 ELISA באמצעות היום 7 ו 13 דגימות כמתואר בשלב 4. אם TCID 50 מתקבל מיום 13 הוא גבוה יותר מאשר כייל מיום 7 באופן ברור, מניות הווירוס ייתכן שתהיינה צורך זמן רב יותר כדי להרחיב. חזור על p24 ELISA באמצעות דגימות מאוחר יותר עד titers זיהומיות משתי נקודות זמן דגימה להיות יציב (או ירידה). מניות בחרו מדגימות עם titers הגבוה ביותר. 4. ELISA (אנזים צמוד Immunoabsorbant Assay) איתור של HIV-1 p24 לקביעת ויראלי זיהומיות כייל הערה: הפרוטוקול הבא פותח באמצעות צלחות לכידת אנטיגן p24 הוכנו במעבדה שלנו 30. p24 צלחת ELISA / יכולה לשמש גם ערכות, בעקבות הפרוטוקול של היצרן המסחרי 1-HIV. לפני העבודה עם דגימות, להכין מניות עובדות (antiserum ארנב נגד HIV-1 SF2 p24) של נוגדן ראשוני. antiserum p24 הפשרה על RT. מערבבים 2.5 מיליליטר של גליצרול עם 2 מיליליטר של 10% FBS בphosphatחיץ מלוח דואר (PBS). הוסף 0.5 מיליליטר של antiserum ומערבבים. חנות 1 מיליליטר של aliquots ב -20 ° C. דגימות הפשרה מצעד 3.7 בחממה 37 ° C. לשטוף את צלחת לכידת p24 5 פעמים עם חיץ לשטוף (1x PBS עם Tween-20 0.05%). הוסף 50 μl / היטב diluent המדגם (1% אלבומין בסרום שור (BSA), 0.2% Tween-20 בRPMI-1640), ולאחר מכן להוסיף 50 μl של מדגם לבארות מתאימות. כולל לפחות שלוש בארות עם diluent מדגם רק כפקדים מדומים / שליליים. דגירה עבור שעה 2 ב 37 מעלות צלזיוס או O / N ב 4 מעלות צלזיוס. הכן את פתרון הנוגדן הראשוני הטרי לפני השימוש. הפוך דילול 1: פי 2,000 מהנוגדן הראשוני עובד מניות באמצעות diluent העיקרית הנוגדן (FBS 12% בRPMI-1640). ודא להכין מספיק לשימוש של 100 פתרון μl לכל דגימה / שליטה גם בצלחת 96-היטב. לדוגמה, כדי לעשות מספיק פתרון לצלחת אחת 96-היטב, להוסיף 5 μl של worki הנוגדן הראשוניng מניות לdiluent הנוגדן הראשוני עבור נפח סופי של 10 מיליליטר. לשטוף צלחת לכידה 5 פעמים עם חיץ לשטוף. להוסיף את פתרון הנוגדן הראשוני 100 μl היטב כל אחד. דגירה עבור h 1 על 37 מעלות צלזיוס באווירת 5% CO 2. הכן את פתרון הנוגדנים משני הטרי לפני השימוש. הפוך דילול 1: פי 14,400 של הנוגדנים משני (1 מ"ג / מיליליטר נגד ארנב עיזים HRP) באמצעות diluent הנוגדנים משני (FBS 7%, 0.01% Tween-20 בRPMI-1640). כדי להפחית שגיאות pipetting, לבצע דילול סדרתי שני שלבים. ודא להכין מספיק לשימוש של 100 פתרון μl לכל דגימה / שליטה גם בצלחת 96-היטב. לדוגמה, כדי לעשות מספיק פתרון לצלחת אחת 96-היטב, להוסיף ראשון 1 μl של הנוגדנים משני עד 99 μl של diluent הנוגדנים משני. ואז להוסיף 70 μl של הדילול הראשון לdiluent הנוגדנים משני עבור נפח סופי של 10 מיליליטר. צלחת לכידה לשטוף 5 טיםes עם חיץ לשטוף. להוסיף את פתרון נוגדנים משני 100 μl היטב כל אחד. דגירה עבור שעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס באווירת 5% CO 2. צלחת לשטוף 5 פעמים עם חיץ לשטוף. להוסיף מצע RT TMB 100 μl. דגירה 30 דקות ב RT במכל סגור כדי להגן מפני אור. הוסף לפתרון תחנת RT (1 NH 2 SO 4) 100 μl. קראו הספיגה ב 450-650 ננומטר בכל טוב באמצעות קורא microplate. השתמש בערך הספיגה להבקיע כל גם נגוע או נגוע. שקול גם להכיל וירוס מדבק אם הערך ספיגה גבוה לפחות פי שלושה מהערך לקרוא מבארות שליטה מדומה / שליליות. לחשב TCID 50 של מניית ויראלי בשיטת ריד-Meunch 31. 5. הקמת קינטיקס ויראלי הצמיחה 5.1) Monoinfection זרע 3 x 10 5 PBMC מגורה PHA / גם ב 48-גם צלחתים בהיקף כולל של 500 μl / טובה. שמור את צלחות התרבות על 37 מעלות צלזיוס באווירת 5% CO 2 עד חיסון. לכל וירוס, להכין הבידוד המכיל 6,000 יחב"ל ב 2 מיליליטר של cIMDM. לחסן בארות בשלושה עותקים על ידי הוספת 500 μl של הבידוד (1500 IU) לתאי זרע. הנפח הסופי של תרבית התאים הנגוע הוא 1 מיליליטר / גם ומשרד הפנים הוא 0.005. Aliquot 200 μl של הבידוד שנותר לכל אחד משני לוחות 96-גם לבידוד RNA, שאחד מהם נשמר כגיבוי. דגירה תרבויות על 37 מעלות צלזיוס באווירת 5% CO 2 במשך 16-24 שעות. תרבויות לשטוף 16-24 שעות לאחר חיסון. הסר וזורקים 750 μl של supernatant התרבות. להוסיף 750 μl של cIMDM הטרי. לעטוף צלחות בלעטוף וספין פלסטיק במשך 10 דקות ב 300 x גרם. הסר וזורקים 750 supernatant μl. להוסיף 750 μl של cIMDM הטרי. לדגור על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 באטמוספרה (יום 1). תרבויות מדגם יומי מיום 2 ליום 7. העבר את 500 μl של supernatant התרבות לצינור 1.8 מיליליטר צנטריפוגות. ספין 1 דקות ב3,000 x גרם. העברה 200 μl של supernatant התא ללא לשתי צלחות מדגם 96-גם לבידוד RNA, שוב חיסכון צלחת אחת כגיבוי. supernatants החנות ב -80 ° C עד בידוד RNA. להוסיף cIMDM 500 μl הטרי לכל תרבות. לדגור על 37 מעלות צלזיוס באווירת 5% CO 2. מחק תרבויות לWescodyne בסוף הניסוי. לבודד RNA מ -200 μl של supernatant (ערכות מסחריות שימוש כגון ערכת QIAamp ויראלי RNA מיני) בעקבות הפרוטוקול הסטנדרטי של היצרן. למספר גדול של דגימות, להשתמש QIAxtractor Qiagen. דגימות RNA החנות ב -80 ° C עד סינתזת cDNA. 5.2) cDNA סינתזה (שעתוק לאחור) לכל של RNAמספיק, להוסיף 1.2 nmol של dNTP ו -1.2 pmol של פריימר סינתזת cDNA, (5'-GTTGATCCTTTAGGTATCTTTCCACAGC-3 ', נוקלאוטיד HXB2 7968-7995) עד 10 μl של רנ"א הנגיפי. מוסיף מים עד נפח סופי של 14 μl. גרור את הצינור לערבב ספין בקצרה לאסוף נוזלי בחלק התחתון של הצינור. דגירה תערובת במשך 5 דקות על 65 מעלות צלזיוס, אז להחזיק ב 4 מעלות צלזיוס עד תערובת ההורים מוכנה. הכן תערובת אמן באמצעות החיץ ראשון גדיל 5x (250 מ"מ טריס HCl, pH 8.3, 375 מ"מ KCl, 15 מ"מ MgCl 2) המעכב U של RNase, 5 מ"מ DTT, 120 U של SuperScriptIII ו -240. מוסיף מים עד נפח סופי של 10 μl. הוסף 10 μl של מיקס מאסטר תערובת RNA, קפיצי לערבב ספין כדי לאסוף. דגירה תערובת למשך 90 דקות ב 50 ° C כדי לאפשר סינתזה של cDNA. דגירה במשך 15 דקות על 70 מעלות צלזיוס כדי להשבית טרנסקריפטאז. להחזיק ב 4 ° C, בהתאם לצורך. הוסף 2 U של RNase H, קפיצי לערבב, ואז ספין כדי לאסוף. דגירה 20 דקותעל 37 מעלות צלזיוס. cDNA החנות ב -20 ° C. 5.3) cDNA Quantitation שימוש מערכת qPCR הכן סדרת דילול סטנדרטית. האם פי 10 דילול סדרתי, מ 3 x 10 6 עותקים / μl עד 30 עותקים / μl, של pNL4-3VifA. השתמש במים מזוקקים לדילולים. הכן את סדרת הדילול הסטנדרטי טרי לפני השימוש או להכין קבוצות קטנות ולשמור ב -20 ° C. לא להקפיא להפשיר הסטנדרטים יותר משלוש פעמים. הגדר את צלחת תגובת 96-היטב qPCR. ודא שכל צלחת מכילה גם לפחות אחד מפקדים שליליים, שלושה עותקים של סדרת הדילול הסטנדרטי, ולפחות כפולה של כל דגימת cDNA. עבור כל תגובת qPCR, להשתמש 12.5 μl של תערובת אמן qPCR, 0.2 מיקרומטר בדיקה, 0.8 מיקרומטר כל אחד מצבעי היסוד קדימה לאחור וμl 1 של cDNA או סדרה סטנדרטית דילול או מים / חיץ (לביקורת השלילית גם). מוסיף מים עד נפח סופי של 25 μl. הבדיקה qPCR היא אור סןsitive. שמור את זה בכלי סגור. כדי לזהות cDNA נגזר משיבוט מולקולרי המבוסס pNL4-3VifA, להשתמש בפריימר-הבדיקה VifA: פריימר VifAB קדימה (GGTCTGCATACAGGAGAAAGAGACT), פריימר ההפוך VifA (5'-AGGGTCTACTTGTGTGCTATATCTCTTTT-3 ') ובדיקת VifAB (6FAM-5'-CTCCATTCTATGGAGACTC-3 "-MGBNFQ). לcDNA נגזר משיבוט מבוסס pNL4-3VifB, להשתמש בפריימר-הבדיקה VifB: פריימר קדימה VifAB, הבדיקה VifAB ופריימר ההפוכה VifB (5'-CACCTGCGTGCTATACCTTTTCT-3 "). להגדיר את פרמטרי רכיבה על אופניים PCR 50 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ו 40 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות ו 60 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות. התייעץ מסמך התמיכה של היצרן להפעלה של המכונה qPCR. לחשב עקומה סטנדרטית באמצעות נתונים מסדרת הדילול סטנדרטי השלושה עותקים. השוואת נתוני הגברה של מדגם cDNA לעקומה סטנדרטית כדי לקבוע את מספר העותק. התייעץ מסמך התמיכה של היצרן לדהעיבוד ת"א. 5.4) קבע ויראלי מעריכי צמיחת שלב העלילה קינטיקה צמיחת ויראלי עם יום הדגימה לאורך ציר ה- X ועותק מספר cDNA לאורך ציר Y ולזהות את שלב הצמיחה המעריכית הנגיפי, כלומר., כאשר cDNA ויראלי להעתיק מספרי עלייה בהתקדמות מעריכית. השתמש בכלי GRC האינטרנט (http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/grc/) כדי לחשב שיעור צמיחה נגיפי (ז). ביישום זה, כלי GRC מקבל cDNA להעתיק מספרים מלפחות שתי נקודות זמן כקלט, ומפיק את שיעור הצמיחה הנגיפי (ז). להשתמש בנתוני נקודת זמן רק בשלב הצמיחה המעריכית (ראה שלב 5.4.1 לעיל) להשיג שיעורי צמיחה מדויקים. לתיאור מפורט של המודל המתמטי המשמש בכלי האינטרנט GRC, ראה 20. Assay תחרות 6. צמיחה זרע 3 x 10 5 </ Sup> PBMCs מגורה PHA (או 1 x 10 5 CEMx174 תאים) בהיקף הכולל של 500 μl לכל גם בצלחת 48 היטב שטוחה תחתית. שמור צלחת ב -37 מעלות צלזיוס באווירת 5% CO 2 עד חיסון. לכל וירוס, להכין 3 מיליליטר של הבידוד המכיל 6,000 יחב"ל. העבר 1.5 מיליליטר של כל הבידוד נגיפי לצינור סטרילי כדי ליצור הבידוד הזיהום הכפול. הוסף 500 μl של הבידוד הכפול (1,500 IU) 3 x 10 5 תאים בצלחת 48-היטב. סופי תרבות הנפח 1 מיליליטר / טוב. Aliquot 200 μl של הבידוד לשתי צלחות 96-היטב לבידוד RNA; להציל את צלחת אחת כגיבוי. דגירה תאים מחוסנים על 37 מעלות צלזיוס עם אווירת 5% CO 2 במשך 16-24 שעות. תרבויות לשטוף 16-24 שעות לאחר חיסון. הסר וזורקים 750 μl של supernatant התרבות. להוסיף 750 μl של cIMDM הטרי. לעטוף צלחות בלעטוף וספין פלסטיק במשך 10 דקות ב 300 x גרם. הסר וזורקים 75081; supernatant l. להוסיף 750 μl של cIMDM הטרי. לדגור על 37 מעלות צלזיוס עם אווירת 5% CO 2 (יום 1). פעמים דגימה בחרו לכלול לפחות 3 נקודות זמן בתוך שלב הצמיחה המעריכית נצפה בשלב 5.4.1. עבור כל דגימה, בצע את הצעד 5.1.7. בצע cDNA סינתזה כאמור בסעיף 5.2. לקבוע את יחס הגרסה הנגיפי באמצעות qPCR. הכן סדרת דילול סדרתי סטנדרטית בשלושה עותקים, דילול של פי 10 בכל שלב מ3 x 10 6 עותקים / μl 30 עותקים / μl של pNL4-3VifA. הגדר את צלחת תגובת 96-היטב qPCR. ודא שכל צלחת מכילה שליטה לפחות אחד שלילית, סדרת הדילול סטנדרטית בשלושה עותקים, וכפילויות של כל דגימת cDNA. עבור כל תגובת qPCR, להשתמש 12.5 μl של qPCR מיקס מאסטר, 0.2 מיקרומטר בדיקה, 0.8 מיקרומטר כל אחד מקדימה לאחור פריימרים ו1 μl של cDNA או ד הסטנדרטי סדרת ilution או מים / חיץ (לבארות שליטה השליליות). מוסיף מים עד נפח סופי של 25 μl. הבדיקה qPCR היא רגיש לאור, לשמור אותו בכלי סגור. השתמש בפריימר-הבדיקה VifA לזהות אותות בבקרה השלילית וסדרת הדילול סטנדרטית ועם כפול אחד של מדגם cDNA. השתמש בפריימר-הבדיקה VifB עם כפול האחרים של מדגם cDNA. להגדיר את פרמטרי רכיבה על אופניים PCR 50 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, אז 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ולאחר מכן 40 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות ו 60 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות. התייעץ מסמך התמיכה של היצרן להפעלה של המכונה qPCR. חשב את העקומה סטנדרטית באמצעות נתונים הגברה מסדרת הדילול הסטנדרטי. השוואת נתוני הגברה של דגימות cDNA לעקומה סטנדרטית כדי לקבוע מספר עותק. התייעץ מסמך התמיכה של היצרן לעיבוד נתונים. השתמש בכלי האינטרנט GRC (ol.washington.edu/grc/">http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/grc/) כדי לחשב כושר יחסי נגיפי (ד). הערה: כלי GRC מקבל cDNA להעתיק מספרים או גבהים שיא chromatogram מלפחות שתי נקודות זמן כקלט, ומפיק את ההפרש נטו שיעור צמיחה (ד) בין שני הווירוסים. בעוד הכלי יכול לחשב את שיעור הצמיחה נטו משני נתונים נקודת זמן, מומלץ מאוד לנתוני קלט משלוש נקודות או יותר זמן. השתמש רק נתונים המתקבלים מנקודות זמן בתוך שלב הצמיחה המעריכית (ראה שלב 5.4) כדי להשיג שיעורי צמיחה מדויקים. לתיאור מפורט של המודל המתמטי המשמש בכלי האינטרנט GRC, ראה 20. לקבוע יחסים נגיפיים באמצעות שיא-שיאי chromatogram PCR להגביר HIV-1 VIF שברים המכילים את תג רצף VifAB באמצעות VifFwd (5'-GAAAGAGACTGGCATTTGGGTCAGGG-3 '; HXB2 ממקם 5,266-5,291) פריימרים וVifRev (5'-GTCTTCT GGGGCTTGTTCCATCTGTCC-3 '; עמדות HXB2 5,579-5,553). עבור כל תגובת PCR, להשתמש μl 1 של cDNA, חיץ 1x NH 4, 1.5 מ"מ MgCl 2, 0.2 מ"מ dNTP, 2.5 U של תקי פולימראז, ו0.45 מיקרומטר של כל צבע יסוד. מוסיף מים עד נפח סופי של 50 μl. להגדיר את פרמטרי רכיבה על אופניים PCR עד 3 מחזורים ב 94 מעלות צלזיוס במשך דקות 1, 55 מעלות צלזיוס במשך דקות 1, ו- 70 מעלות צלזיוס במשך דקות 1, ואחרי 34 מחזורים ב 94 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, 58 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, ו 70 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות, ולאחר מכן להחזיק ב 4 מעלות צלזיוס. לטהר מוצרי PCR באמצעות ערכת טיהור QIAquick PCR על פי הפרוטוקול של היצרן. לשלוח את מוצרי PCR מטוהרים לDNA רצף ספק שירות לסנגרו רצף. בדוק את ציון איכות קריאה הממוצע, אשר אמור להיות מסופק על ידי שירות הרצף. אם שיחת בסיס הדיוק הממוצע הוא פחות מ -85%, שוב צעד 6.10.1 ל6.10.3 השתמש בכלי האינטרנט ChromatQuan (f="http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/cgi-bin/chromatquant.cgi">http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/cgi-bin/chromatquant.cgi ) כדי לחשב יחס נגיפי בכל נקודת זמן. הכלי דורש את קובץ עקבות רצף (* .ab1) ורצף 5 'לאתר נוקלאוטיד של עניין. הכלי מודד את עוצמת השיא באתר שצוין. היחס של עוצמת השיא מתאים למנה של שני הווירוסים (איור 4). השתמש בכלי GRC האינטרנט (http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/grc/) ועוצמות שיא שנרשמו כקלט לחישוב כושר נגיפי יחסי (ד). ראה שלב 6.10.6. 20

Representative Results

כדי לחקור את ההשפעה של שינויי כושר חומצת אמינו בודדים בHIV-1-Gag p24, השתמשנו mutagenesis המכוון oligonucleotide להציג מוטציות לפלסמיד המכיל pNL4-3 23,32,33 גן COTB-p24 HIV-1. מניות ויראלי נוצרו על ידי transfection של תאי 293T ונקטפו לאחר 48 שעות. הערכנו 50% מינון תרבית רקמת זיהומיות (50 TCID) של כל מניות נגיפיות בשיטת ריד Muench-31. TCID 50 של אב הטיפוס והווירוסים שעברו מוטציה נעו בין 10 אפריל – 10 מאי IU / מיליליטר (איור 3 א). קינטיקה הצמיחה של וירוסי רקומביננטי הוקמו בPBMCs מתורם יחיד במשרד פנים של 0.005. RT-qPCR שימש למדידת מספר עותק cDNA ויראלי יומית במשך שישה ימים. כל הווירוסים שעברו מוטציה ואב הטיפוס גדלו באופן אקספוננציאלי בין היום 2 ויום 4, הבא שצמיחה האט נגיפית, כפי שצוין על ידי מדרון ירידה של עליית מספר עותק רנ"א הנגיפי (<3B strong> איור). הירידה בcDNA להעתיק מספר בין 0 היום (המתאים לבידוד) ויום 2 בשל הספיגה של וירוס לתאים והסרת של virions מאוגד על ידי שטיפת היום 1 (צעד 5.1.6). בשלב הצמיחה המעריכית, כל שלוש מוטציות היו קצב איטי יותר צמיחה (ז) מוירוס אב הטיפוס (איור 3 ג). כל שלוש מוטציות היו התחרו נגד וירוס אב הטיפוס במבחני תחרות צמיחה במשרד פנים כולל של 0.005. קינטיקה צמיחת ויראלי בתרבויות dually נגועות היו דומה לזה של monoinfection; שלב הצמיחה המעריכית הנגיפי היה בין ימים 2 ו -4, וצמיחת ויראלי הגיעה לרמה סביב יום 5 (איור 4 א). הבדלי קצב צמיחת ויראלי נגזרו מהשינוי ביחס הנגיפי לאורך זמן. היחס הנגיפי חושבו על בסיס עותק מספר cDNA של ההתייחסות והווירוסים שעברו מוטציה באמצעות RT-qPCR, ועל ידי גבהים שיא השוואהברצף chromatograms באתרי נוקלאוטיד להבחין שני וירוסים (איור 4). הבדלי קצב הצמיחה נקבעו באמצעות שיא הגובה ושיטות מספר עותק רנ"א נגיפיים הניבו תוצאות דומות (איור 4C). היו כל שלוש מוטציות כושר שכפול נמוך מוירוסי אב הטיפוס עם I256V המוטציה שיש הכושר הנמוך ביותר (איור 4C). איור 1: תרשים זרימה של הפרוטוקולים שהוצגו במאמר זה בניית וירוס הדאגה פרוטוקולי הכנה של HIV-1 שיבוטים רקומביננטי והדור של מניות ויראלי.. פרוטוקולי מבחני כושר הם להקמת קינטיקה צמיחה הנגיפית וקביעת כושר נגיפי יחסי. קווים מקווקווים מייצגים תזרים חלופי לפרוטוקולים. לדוגמא, מוטציה יכולה להיות הציגה ישירות לתוך HIV-1 NL4-3שיבוט מולקולרי מבלי ליצור שיבוט רקומביננטי. איור 2:. בנייה של שיבוטים מולקולריים רקומביננטי HIV-1 NL4-3 COTB Gag-p24 באמצעות הארכת חפיפה () PCR עיצוב פריימרים chimeric. 5 'חצאי צבעי יסוד מכילים את רצף וקטור NL4-3 ו'3 חצאים להכיל את הקצוות של הרצף להוסיף. פריימרים כימרי (ב) משמשים כדי להגביר בר להוסיף, COTB Gag-p24. שברי להוסיף (C) משמשים כצבעי יסוד לPCR שני כדי ליצור פלסמיד רקומביננטי חדש. איור 3:. מאפייני צמיחת ויראלי בPBMCs () יומן 10 TCID 50 </sUB> מניות ויראלי. (ב) קינטיקה צמיחת ויראלי בmonoinfections החלה במשרד פנים = 0.005. שיעורים (C) ויראלי צמיחה מעל שישה ימים, כוללים שלב מעריכי צמיחה (ימים 2-4) נגזר מהפנל (B). הערכים המוצגים מייצגים את הממוצע של שלושה משכפל מניסוי אחד. הברים השגיאה מייצגים 95% מרווחי ביטחון. קביעות צמיחת ויראלי וכושר יחסי () צמיחת ויראלי בתרבויות PBMC dually נגועות: איור 4.. יחסים (B) של וירוסי T242N ואב טיפוס נקבעו באמצעות RT-qPCR או שיטת שיא גובה רצף. (ג) הבדלים נקי נגיפיים שיעור צמיחה (ד) בין המוטציה ווירוסי אב הטיפוס בתרבויות dually נגועות, כפי שמוצג ב(). ערכי ד חושבו FROM נתונים יחס הנגיפיים המוצגים ב( B). הערכים המוצגים מייצגים את הממוצע של שלושה משכפל מניסוי אחד. הברים השגיאה מייצגים 95% מרווחי ביטחון.

Discussion

הפרוטוקולים שהוצגו מורכבים משני חלקים עיקריים: הבנייה של שיבוטים רקומביננטי HIV-1 מולקולריים ומבחני תחרות צמיחה. כדי להבחין בין שני וירוסים בתרבית תאי dually נגוע, חשוב שהשיבוטים המולקולריים המתחרים מכילים תגי רצף, אשר יכול להיות מזוהה על ידי assay פריימר-הבדיקה RT-qPCR או על ידי רצף סנגר. פרוטוקול זה עושה שימוש בתגי VifA וVifB, אשר תופסים אותו האזור של HIV-1 VIF NL4-3 ולקודד אותו רצף חומצות אמינו אבל שונה בשש מוטציות נרדפות. מוטציות אלה הוצגו לא להשפיע כושר שכפול נגיפי ^20. שיטת שיבוט PCR מבוססת שימוש בפרוטוקול זה מספקת גמישות רבה יותר בבחירת אתרי שיבוט, בהשוואה לשיבוט מבוסס אתר הגבלה. עם זאת, יעילות שיבוט PCR יורדת ככל שעולה הגודל להכניס. המגבלה הנוכחית של הגודל הכנס היא ~ 5 KB ^34. לשיבוט PCR מבוסס וmutagenesi אתר מכווןים, השימוש בDNA פולימרז באיכות גבוהה הוא קריטי כדי להקטין את הסיכוי של מוטציות נוספות. שימוש במספר המינימלי של מחזורי PCR צריכים להניב כמויות מספיקות של מוצרים מומלצים גם. מניסיוננו, אנו לא מזהים כל מוטציות נוספות לאחר צעדי mutagenesis PCR מבוססי שיבוט ואתר מכוון שתוארו כאן. עם זאת יש רצף מוצרי ה- PCR כדי לבדוק את כל מוטציות לא רצויות. באופן אידיאלי, צריך להיות resequenced אזור HIV כל הקידוד.

לפחות שלוש נקודות זמן דגימה יש לבחון במסגרת שלב הצמיחה המעריכית ^9. קינטיקה הצמיחה הנגיפית חייבת להיות ראשון שהוקמה באמצעות דגימה יומית כדי לקבוע את נקודות תקופת התרבות וזמן דגימה המתאימות לתחרות הצמיחה. גורם אחד שמשפיע על קינטיקה צמיחת ויראלי הוא הריבוי של זיהום (משרד הפנים). פרוטוקול זה משתמש משרד הפנים כולל של 0.005 עבור שני monoinfection ותחרות צמיחה, כפי שהוצג להניב יותר roתוצאות חזה מאשר נמוך MOIs ^9. יחד עם זאת, ניתן להשתמש MOIs הנמוך להשיג שלב צמיחה המעריכית עוד במידת צורך, אבל על חשבון עקביות תוצאה. פרוטוקול זה מצביע על יחס זיהום ראשוני של 50:50, בהנחה שהבדלי הכושר של הווירוסים הם בדרך כלל לא ידועים מראש. עם זאת, השימוש ביחסים שוויוניים קלט מתאימים כאשר יש נתונים ראשוניים מצביעים על הבדלים משמעותיים בקינטיקה שכפול הנגיפית. במקרים אלה, יחס זיהום של 70:30 מומלץ לאפשר לגילוי הבדל כושר גדול שבו הווירוס פחות בכושר ממוקם בעודף ^9.

הפרוטוקול לקביעת ₅₀ TCID, קינטיקה צמיחת ויראלי, ועל ביצוע מבחני צמיחת תחרות היו מותאמות באמצעות תת סוג B HIV-1, NL4-3 COTB-p24, וPBMCs מאותו תורם שPBMC הפגין רגישות עקבית ל- HIV זיהום 1 במבחנה. תקופת התרבותונקודות זמן דגימה המוצגות בפרוטוקול זה עשויות להיות מתאים ללימוד וירוסי M קבוצת HIV-1 בPBMCs האנושי. באמצעות PBMCs ממקור יחיד מומלץ מאוד כדי להשיג תוצאות עקביות כשכפול הנגיפי יכול להשתנות בתאי תורם שונים ^35. למרות שפחות רצוי, PBMCs אספו מתורמים מרובים יכול לשמש כתחליף ובלבד שאותו המאגר משמש בכל הניסויים. חלופה נוספת היא השימוש בשורות תאים. הפרוטוקול המובא כאן שימש בהצלחה עם קו T-cell CEMx174 ^23,36. עם זאת, חשוב שהמספרים של תאי זרע הם להשיג צמיחה עקבית תא-מותאם מחדש. קינטיקה צמיחת ויראלי חייבת להיות גם הוקמה מחדש, כפי שהוא עשוי להשתנות בשורות תאים שונות, כדי לקבוע את הנקודות המתאימות בזמן דגימה בשלבי תחרות צמיחה.

שתי שיטות שונות כדי לקבוע את היחס הנגיפי לחישוב כושר כלולות בprotocOL. הראשון משתמש RT-qPCR למדוד מספר עותק cDNA ויראלי בכל נקודת זמן דגימה. כושר שכפול נגיפי אז מחושב מהיחס הנגיפי, המבוסס על עותק מספר cDNA. לחלופין, היחס הנגיפי יכול להיקבע על בסיס היחס בין גובה שיא chromatogram באתרי תג VifAB. שתי השיטות הניבו תוצאות דומות (איור 4). שיטת גובה שיא chromatogram יכולה להיות מיושמת על זני HIV-1 אחרים ללא תג רצף מהונדס. לRT-qPCR, השימוש בצבעי יסוד או בדיקות להבחין גרסאות נגיפיות יש להעריך בזהירות ראשונה (ראה ^20). עם זאת, RT-qPCR מספק רגישות טובה יותר לדגימות עם כמות קטנה של רנ"א הנגיפי, כמו אלה מנקודת הפעם הראשונה במסגרת שלב הצמיחה המעריכית. מדידה ישירה של cDNA ויראלי גם מאפשרת זיהוי של בעיות טכניות שיכול לנבוע ממיצוי RNA וסינתזת cDNA. באמצעות שיבוטים מולקולריים עם תגי רצף מספק t עלות פתרון יעילo שיטות RT-qPCR, כמו שרק שני זוגות של צבעי יסוד ובדיקות דרושים כדי ללמוד וירוסים מרובים. אסטרטגיה זו גם מונעת את הבעיה וריאציה שיא גובה של ברצף chromatograms בשל בסיסים שכנים ^37, כרצף נעשה באותו אתר בכל הווירוסים במחקר. מוצרי ה- PCR הופקו עבור RT-qPCR וסנגר רצף יכולים להיות גם שימוש בשיטות אחרות כדי לקבוע יחס נגיפי כגון רצף תפזורת של שיבוטים בודדים ^12,13, HTA ^4,7,17,19, או assay קשירת oligonucleotide (OLA) ³⁸ .

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Construction of recombinant clones
Chimeric primer/Mutagenic/Sequencing primers	IDT	N/A	Custom DNA oligos
pNL4-3VifA and pNL4-3VifB plasmid	N/A	N/A	Please contact Dr. James I Mullins (jmullins@uw.edu)
High-Fidelity DNA polymerase	Thermo Scientific	F-549S
High-fidelity buffer	Thermo Scientific	F-549S
dNTP	Bioline	Bio-39026
Thermal cycler	Life Technologies	N/A	Applied Biosystems® GeneAmp® PCR System 9700
DNA loading dye	Thermo Scientific	R0631
1kb Plus DNA ladder	Invitrogen	10787-018
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28104
QIAquick gel extraction kit	Qiagen	28704
DpnI enzyme	New England Biolabs	R0176S
TOP10 chemically competent Escherichia coli	Invitrogen	C4040-10
Luria Broth base powder	Invitrogen	12795-084
Carbenicillin	Research Products International	C46000-25.0
QIAprep Spin Miniprep kit	Qiagen	27104
EndoFree Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12362
Transfection
X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent	Roche	6365787001
HEK 293T-17	ATCC	CRL-11268	http://www.atcc.org/
0.22um filter top tube	VWR International	89220-716
Cell culture
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Life Technologies	10566016
Iscove′s Modified Dulbecco′s Medium (IMDM)	Life Technologies	31980-030
RPMI-1640 media	Life Technologies	61870-036
Phytohemagglutinin (PHA)	Thermo Scientific	R30852801
Human Interleukin-2	Roche	11147528001
Fetal bovine serum	JR Scientific	43640
Penicillin and Streptomycin	Corning Cellgro	30-001-CI
6 well plate	VWR Scientific	73520-906
48 well plate	VWR Scientific	62407-338
96 well flat-bottomed plate	ISC Bioexpress	T-3015-4
96 well round-bottomed plate	BD Falcon	353077
1.5 ml Microcentrifuge Tube	Mt. Baker Bio	MBD-1500
1.5 mL tubes w/ O-ring	VWR Scientific	89004-290
50 mL conical tube	ISC Bioexpress	C-3317-6
ELISA
Triton-X 100	Sigma-Aldrich	X100
Phosphate buffer saline (PBS)	Invitrogen	14190-250
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F0392
glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1379
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153
Rabbit anti-HIV-1 SF2 p24 antiserum	NIH AIDS Reagent Program	4250
Goat anti-rabbit HRP	KPL	474-1516
TMB Microwell Peroxidase Substrate	KPL	52-00-01
H2SO4	Fisher Scientific	A300-500	Causes severe burns by all exposure routes. Use personal protective equipment. Use only under a chemical fume hood. Wash off immediately with plenty of water for at least 15 minutes.
HIV p24 standard	AIDS and Cancer Virus program (NCI-Frederick)	N/A	For order details please contact Julian Bess, Jr. (bessjw@mail.nih.gov); http://ncifrederick.cancer.gov/Programs/Science/Acvp/bio/Bess.aspx
Microplate reader	Molecular Devices	N/A	VMax Kinetic ELISA Microplate Reader
RNA isolation cDNA synthesis
QIAxtractor	Qiagen	N/A	http://www.qiagen.com/products/catalog/automated-solutions/sample-prep/qiaxtractor
QIAamp Viral RNA Mini Kit	Qiagen	52906
dNTP	Bioline	Bio-39026
SuperscriptIII	Invitrogen	18080-085
First-strand buffer	Invitrogen	18080-085
Dithiothreitol (DTT)	Invitrogen	18080-085
Rnase inhibitor	Roche	3335402001
RnaseH	Invitrogen	18021-071
qPCR
Real-time qPCR machine	Life Technologies	N/A	Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR
TaqMan® Gene Expression Master Mix	Life Technologies	4369016
Forward, reverse primer	IDT	N/A	Custom order
Probe	Life Technologies	N/A	Custom order
optical 96 well reaction plate	Life Technologies	I19N3Q216
PCR+sequencing
Taq DNA polymerase (Biolase)	Bioline	Bio-21043
NH4 buffer	Bioline	Bio-21043
MgCl2	Bioline	Bio-21043
Sequencing primer	IDT	N/A	Custom order
QIAxcel	Qiagen		http://www.qiagen.com/products/catalog/automated-solutions/detection-and-analysis/qiaxcel-advanced-system
DNA sequencing service provider	http://www.htseq.org/
GRC web tool	http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/grc/
ChromatQuan web tool	http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/cgi-bin/chromatquant.cgi