Growth competition between nearly isogenic viruses provides a sensitive measurement for determining relative replication fitness. The protocols described here include the construction of recombinant HIV-1 clones, virus propagation and growth competition and analysis methods optimized to yield sensitive and consistent results.
In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to extrapolate viral replication fitness, ranging from the number of viral particles per infectious unit, growth rate in cell culture, and relative fitness derived from multiple-cycle growth competition assays. Growth competition assays provide a particularly sensitive measurement of fitness since the viruses are competing for cellular targets under identical growth conditions. There are several experimental factors to consider when conducting growth competition assays, including the multiplicity of infection (MOI), sampling times, and viral detection and fitness calculation methods. Each factor can affect the end result and hence must be considered carefully during the experimental design. The protocol presented here includes steps from constructing a new recombinant HIV-1 clone to performing growth competition assays and analyzing the experimental results. This protocol utilizes experimental parameter values previously shown to yield consistent and robust results. Alternatives are discussed, as some parameters need to be adjusted according to the cell type and viruses being studied. The protocol contains two alternative viral detection methods to provide flexibility as the availability of instruments, reagents and expertise varies between laboratories.
Viral replikation kondition definieras som kapaciteten hos ett virus att producera infektiöst avkomma i en given miljö 1 och är en viktig bidragande faktor vid bestämning av förekomsten av en virusvariant på populationsnivå över tiden 2. Som in vivo-fitness studier inte genomförbart med patogena humana virus, såsom HIV-1, olika in vitro och ex vivo replika fitness analyser har utvecklats för att studera effekterna på lämplighet till följd av läkemedelsresistens och immunutrymnings mutationer, epistasis och utvecklingen på virala populationer 3-6. Bland olika fitness analyser, är tillväxt kompetitionsanalyser erkänt att ge mer känsliga och giltiga mått på fitness skillnader som två eller flera virusvarianter konkurrerar om samma cell befolkningen under exakt samma miljöförhållanden, som sker in vivo 1,7,8. Innan du börjar tillväxtkonkurrensexperiment, flera variables måste fastställas, bland annat användningen av olika multipliciteter infektions (MOI), viral ingångsförhållande, och tidpunkten för provtagning för analys. Vi har studerat effekterna av dessa parametrar på virala tillväxtkinetik och om resultatet av konkurrensexperiment, och har identifierat viktiga faktorer som är nödvändiga för robusta mätningar av HIV-1 fitness i cellkultur 9.
Förutom analysvariabler, det finns en mängd olika metoder för att kvantifiera virusvarianter i tillväxtkonkurrensexperiment. Bulk 10,11 eller klonal sekvenering 12,13 har använts för att bestämma förhållandet mellan de konkurrerande virus baserat på de nukleotid-frekvenserna på platsen (er) av intresse. Relativ fitness härrör från förändringar i detta förhållande över tiden. Denna metod är bekväm eftersom DNA-sekvense tjänster är allmänt tillgängliga. Den parallella allelspecifik sekvenseringsmetod (PASS) möjliggör sekvense på multipla ställen och detekteringen av rekombinanter 14 </sup> Krävs men också specifikt utvecklade reagenser och detektionssystem. I huvudsak har dessa metoder utvecklats för att studera virusstammar med ett litet antal nukleotid-skillnader i en region av intresse. Andra metoder använder en liten reportergen 15 eller synonyma mutationer 4,16-18 som taggar för att skilja de konkurrerande virus genom sekvensering, heteroduplexspårningsanalyser (HTA) 4,7,17,19 eller omvänd transkription-kvantitativ realtids-polymeraskedjereaktion (RT-qPCR) 15,16,18,20, som alla kan göras tillämpliga för att studera konkurrerande stammar oavsett sekvenslikhet. Ett ytterligare steg krävs för att införa taggar till virala genom och RT-qPCR analys kräver också specifika reagens och instrumentering. Vi har funnit att bulk Sanger sekvense ger jämförbara resultat 9.
Efter tillväxt konkurrens, är virusreplikation fitness presenteras som relativ kondition, eller fitness förhållandet mellan two virusvarianter. Den relativa lämpligheten hos en virus kan definieras som den slutliga andelen av en viral variant normaliseras genom dess ursprungliga andel i ympen eller som nettoskillnaden tillväxttakten mellan de två konkurrerande virus. Vi fann att den senare metoden, med hjälp av longitudinella datapunkter endast inom den exponentiella tillväxtfasen, producerade de mest robusta resultat 9,20.
In vitro-fitness analyser används främst för att studera biologiska kloner 6-8 och infektiösa molekylära kloner av HIV-1. Den senare, som är mottaglig för genetisk manipulation, används ofta för att studera effekten på fitness från specifika mutationer eller specifika sekvenser av intresse 3-5,21,22. Följande protokoll beskriver ett arbetsflöde från punkten för att konstruera nya fullängds infektiösa HIV-1 molekylära kloner med hjälp av HIV-1-vektorer innehållande en sekvens tagg, introducera mutationer av intresse, vilket gör virala stockar och upprättande virala tillväxtkinetik, Att utföra tillväxtkonkurrensanalys och beräkning av relativ fitness (Figur 1).
Använda våra optimerade procedurer, skapade vi tre rekombinanta HIV-1-mutanter och bestäms deras replikering fitness. Den rekombinanta molekylär klon konstruerades först genom att ersätta HIV-1-gag-p24-genen regionen av pNL4-3, en plasmid innehållande en fullängds infektiöst genomet av HIV-1 labb stam NL4-3, med ett syntetiskt COTB (Center-of- Träd, subtyp B) gag-p24-sekvensen 23 för att skapa prototypstammen. Enskilda aminosyror förändringar (T186M, T242N och I256V) infördes sedan för att skapa tre muterade kloner. Varje mutant tävlade mot prototypen viruset att observera fitness effekterna av varje mutation i den givna genetisk bakgrund. De tre mutanterna demonstrerade varierande nivåer av replikations fsitness från lätt till betydligt lägre än prototypvirus. Den T242N mutation tidigare rapporterats ha en måttlig fitnessanläggningss kosta 24-26, i likhet med det resultat som visas i denna studie. Den lämplighets kostnaden för de andra två mutationer hade inte tidigare rapporterats.
De protokoll som presenteras bestod av två huvuddelar: konstruktion av rekombinanta HIV-1 molekylära kloner och tillväxt konkurrensanalyser. För att särskilja två virus i en för sig infekterad cellkultur, är det viktigt att de konkurrerande molekylära kloner innehåller sekvens taggar, som kan detekteras av en RT-qPCR primer-prob-analys eller av Sånger-sekvensering. Detta protokoll använder sig av de Vifa och VifB taggar, som upptar samma region av HIV-1 NL4-3 vif och kodar för samma aminosyrasekvens men skiljer sig åt med sex synonyma mutationer. Dessa mutationer visades inte påverka viral replikation kondition 20. PCR-baserad klonings metod som används i detta protokoll ger större flexibilitet vid val av kloningsställen, jämfört med restriktionsställe baserad kloning. Emellertid effektiviteten av PCR-kloning minskar när storleken ökar insatsen. Den nuvarande gränsen för insatsen storlek är ~ 5 kb 34. För PCR-baserad kloning och ställesriktad mutagenesiar, är användningen av en high-fidelity-DNA-polymeras avgörande för att minska sannolikheten för att extra mutationer. Användning av det minimala antalet PCR-cykler som behövs för att ge tillräckliga mängder av produkter rekommenderas också. I vår erfarenhet, vi inte upptäcka några extra mutationer efter PCR-baserade kloning och riktad mutagenes steg som beskrivs här. Ändå PCR-produkterna skall sekvenseras för att kontrollera om det finns några oönskade mutationer. Helst ska hela HIV-kodande regionen kan resequenced.
Minst tre provtagnings tidpunkter bör undersökas inom den exponentiella tillväxtfasen 9. De virala tillväxtkinetik måste först fastställas med hjälp av daglig provtagning för att fastställa lämpliga odlingsperioden och samplingstidpunkter för tillväxt konkurrens. En faktor som påverkar virala tillväxtkinetik är den mångfald av infektion (MOI). Detta protokoll använder totalt MOI av 0,005 för både monoinfection och tillväxt konkurrens, eftersom det visade sig ge mer robyst resultat än lägre MOI 9. Icke desto mindre kan lägre MOI användas för att erhålla en längre exponentiell tillväxtfas om nödvändigt, men på bekostnad av resultatet konsistens. Detta protokoll föreslår en initial infektion förhållandet 50:50, förutsatt att de fitness skillnader i virus är i allmänhet okända i förväg. Men användningen av ojämlika ingångsförhållanden är lämpliga när det finns preliminära data tyder på betydande skillnader i virusreplikation kinetik. I dessa fall är en infektion av 70:30 rekommenderas att möjliggöra detektion av ett stort gym skillnad där mindre passa viruset placeras i överskott 9.
Protokollet för att bestämma TCID50, virala tillväxtkinetik, och för att utföra tillväxt konkurrensanalyser har optimerats med hjälp av HIV-1 subtyp B, har NL4-3 COTB-p24, och PBMC från en enda donator vars PBMC påvisat konsekvent känslighet för HIV 1-infektion in vitro. Odlingsperiodenoch samplingstidpunkter som presenteras i detta protokoll kommer sannolikt att vara lämpliga för att studera HIV-1 grupp M-virus i humana PBMC. Med hjälp av PBMC från en enda källa är starkt rekommenderat att få konsekventa resultat som virusreplikation kan variera i olika givarceller 35. Även mindre önskvärt, kan PBMC poolade från flera givare kan användas som ett byte under förutsättning att samma pool används i alla experiment. Ett annat alternativ är användningen av cellinjer. Protokollet presenteras här användes framgångsrikt med T-cellinje CEMx174 23,36. Det är emellertid viktigt att antalet celler ympade är re-optimerade för att uppnå konsekvent celltillväxt. Viral tillväxtkinetik måste också återupprättas, eftersom det är sannolikt att variera i olika cellinjer, att fastställa lämpliga samplingstidpunkter i tillväxtkonkurrens steg.
Två olika metoder för att bestämma den virala förhållande för beräkning lämplighet ingår i protocol. Den första använder RT-qPCR att mäta viral cDNA-kopietal vid varje provtagningstidpunkt. Viral replikation kondition beräknades sedan från den virala förhållandet, baserat på cDNA-kopietal. Alternativt kan det virala förhållande bestämmas baserat på förhållandet av kromatogram topphöjd på VifAB tagg webbplatser. De två metoderna gav jämförbara resultat (Figur 4). Kromatogrammet topphöjd metod kan tillämpas på andra HIV-1-stammar utan konstruerad sekvens tag. För RT-qPCR, användning av primers eller sönder för att särskilja virusvarianter måste först utvärderas noggrant (se 20). Ändå ger RT-qPCR bättre känslighet för prover med en liten mängd av viralt RNA, såsom de från den första tidpunkt inom den exponentiella tillväxtfasen. Direkt mätning av viral cDNA kan också upptäcka tekniska problem som kan uppstå från RNA-extraktion och cDNA-syntes. Använda molekylära kloner med sekvens taggar ger en kostnadseffektiv lösning to RT-qPCR metoder, eftersom endast två par primers och prober behövs för att studera flera virus. Denna strategi undviker också problemet med topphöjden variation i sekvens kromatogrammen beror på grannbaser 37, som sekvense sker på samma plats för alla virus i studien. PCR-produktema framställda för RT-qPCR och Sånger-sekvensering kan också vara användning av andra metoder för att bestämma viral förhållande såsom bulksekvensering av individuella kloner 12,13, HTA 4,7,17,19, eller oligonukleotid ligering analys (OLA) 38 .
The authors have nothing to disclose.
These studies were funded by US Public Health Services grants P01AI057005, R01AI047734, R01AI111806 and the Functional Profiling and Computational Biology Core of the University of Washington’s Center for AIDS Research (P30 AI027757).
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Construction of recombinant clones | |||
Chimeric primer/Mutagenic/Sequencing primers | IDT | N/A | Custom DNA oligos |
pNL4-3VifA and pNL4-3VifB plasmid | N/A | N/A | Please contact Dr. James I Mullins (jmullins@uw.edu) |
High-Fidelity DNA polymerase | Thermo Scientific | F-549S | |
High-fidelity buffer | Thermo Scientific | F-549S | |
dNTP | Bioline | Bio-39026 | |
Thermal cycler | Life Technologies | N/A | Applied Biosystems® GeneAmp® PCR System 9700 |
DNA loading dye | Thermo Scientific | R0631 | |
1kb Plus DNA ladder | Invitrogen | 10787-018 | |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
QIAquick gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
DpnI enzyme | New England Biolabs | R0176S | |
TOP10 chemically competent Escherichia coli | Invitrogen | C4040-10 | |
Luria Broth base powder | Invitrogen | 12795-084 | |
Carbenicillin | Research Products International | C46000-25.0 | |
QIAprep Spin Miniprep kit | Qiagen | 27104 | |
EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
Transfection | |||
X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent | Roche | 6365787001 | |
HEK 293T-17 | ATCC | CRL-11268 | http://www.atcc.org/ |
0.22um filter top tube | VWR International | 89220-716 | |
Cell culture | |||
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 10566016 | |
Iscove′s Modified Dulbecco′s Medium (IMDM) | Life Technologies | 31980-030 | |
RPMI-1640 media | Life Technologies | 61870-036 | |
Phytohemagglutinin (PHA) | Thermo Scientific | R30852801 | |
Human Interleukin-2 | Roche | 11147528001 | |
Fetal bovine serum | JR Scientific | 43640 | |
Penicillin and Streptomycin | Corning Cellgro | 30-001-CI | |
6 well plate | VWR Scientific | 73520-906 | |
48 well plate | VWR Scientific | 62407-338 | |
96 well flat-bottomed plate | ISC Bioexpress | T-3015-4 | |
96 well round-bottomed plate | BD Falcon | 353077 | |
1.5 ml Microcentrifuge Tube | Mt. Baker Bio | MBD-1500 | |
1.5 mL tubes w/ O-ring | VWR Scientific | 89004-290 | |
50 mL conical tube | ISC Bioexpress | C-3317-6 | |
ELISA | |||
Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
Phosphate buffer saline (PBS) | Invitrogen | 14190-250 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F0392 | |
glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
Rabbit anti-HIV-1 SF2 p24 antiserum | NIH AIDS Reagent Program | 4250 | |
Goat anti-rabbit HRP | KPL | 474-1516 | |
TMB Microwell Peroxidase Substrate | KPL | 52-00-01 | |
H2SO4 | Fisher Scientific | A300-500 | Causes severe burns by all exposure routes. Use personal protective equipment. Use only under a chemical fume hood. Wash off immediately with plenty of water for at least 15 minutes. |
HIV p24 standard | AIDS and Cancer Virus program (NCI-Frederick) | N/A | For order details please contact Julian Bess, Jr. (bessjw@mail.nih.gov); http://ncifrederick.cancer.gov/Programs/Science/Acvp/bio/Bess.aspx |
Microplate reader | Molecular Devices | N/A | VMax Kinetic ELISA Microplate Reader |
RNA isolation cDNA synthesis | |||
QIAxtractor | Qiagen | N/A | http://www.qiagen.com/products/catalog/automated-solutions/sample-prep/qiaxtractor |
QIAamp Viral RNA Mini Kit | Qiagen | 52906 | |
dNTP | Bioline | Bio-39026 | |
SuperscriptIII | Invitrogen | 18080-085 | |
First-strand buffer | Invitrogen | 18080-085 | |
Dithiothreitol (DTT) | Invitrogen | 18080-085 | |
Rnase inhibitor | Roche | 3335402001 | |
RnaseH | Invitrogen | 18021-071 | |
qPCR | |||
Real-time qPCR machine | Life Technologies | N/A | Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR |
TaqMan® Gene Expression Master Mix | Life Technologies | 4369016 | |
Forward, reverse primer | IDT | N/A | Custom order |
Probe | Life Technologies | N/A | Custom order |
optical 96 well reaction plate | Life Technologies | I19N3Q216 | |
PCR+sequencing | |||
Taq DNA polymerase (Biolase) | Bioline | Bio-21043 | |
NH4 buffer | Bioline | Bio-21043 | |
MgCl2 | Bioline | Bio-21043 | |
Sequencing primer | IDT | N/A | Custom order |
QIAxcel | Qiagen | http://www.qiagen.com/products/catalog/automated-solutions/detection-and-analysis/qiaxcel-advanced-system | |
DNA sequencing service provider | http://www.htseq.org/ | ||
GRC web tool | http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/grc/ | ||
ChromatQuan web tool | http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/cgi-bin/chromatquant.cgi |