Growth competition between nearly isogenic viruses provides a sensitive measurement for determining relative replication fitness. The protocols described here include the construction of recombinant HIV-1 clones, virus propagation and growth competition and analysis methods optimized to yield sensitive and consistent results.
In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to extrapolate viral replication fitness, ranging from the number of viral particles per infectious unit, growth rate in cell culture, and relative fitness derived from multiple-cycle growth competition assays. Growth competition assays provide a particularly sensitive measurement of fitness since the viruses are competing for cellular targets under identical growth conditions. There are several experimental factors to consider when conducting growth competition assays, including the multiplicity of infection (MOI), sampling times, and viral detection and fitness calculation methods. Each factor can affect the end result and hence must be considered carefully during the experimental design. The protocol presented here includes steps from constructing a new recombinant HIV-1 clone to performing growth competition assays and analyzing the experimental results. This protocol utilizes experimental parameter values previously shown to yield consistent and robust results. Alternatives are discussed, as some parameters need to be adjusted according to the cell type and viruses being studied. The protocol contains two alternative viral detection methods to provide flexibility as the availability of instruments, reagents and expertise varies between laboratories.
Viral replikation fitness defineres som evnen af en virus til at producere infektiøst afkom i et givet miljø 1 og er en vigtig medvirkende faktor til bestemmelse af forekomsten af et virus variant på populationsniveau over tid 2. Som in vivo fitness undersøgelser er ikke muligt med patogene humane vira, såsom HIV-1, forskellige in vitro og ex vivo replikering fitness assays er blevet udviklet til at studere virkningerne på fitness følge af lægemiddelresistens og immune escape mutationer, epistasis og udviklingen på virale populationer 3-6. Blandt forskellige fitness-analyser, er væksten konkurrencemæssige analyser anerkendt for at give mere følsomme og gyldige mål for fitness forskelle, som to eller flere virale varianter konkurrerer om den samme celle befolkningen under præcis de samme miljøforhold, som forekommer i vivo 1,7,8. Før du starter vækst konkurrencemæssige eksperimenter, flere variables skal fastlægges, herunder brug af forskellige infektionsmultipliciteter (MOI), viral input forhold, og timingen af prøveudtagning til analyse. Vi har undersøgt virkningerne af disse parametre på virale vækstkinetik og om resultaterne af konkurrencemæssige eksperimenter, og har identificeret centrale faktorer, der er nødvendige for robuste målinger af HIV-1 fitness i cellekultur 9.
Foruden assay variabler, er der en række fremgangsmåder til kvantificering af virale varianter i vækst konkurrenceforsøg. Bulk 10,11 eller klonal sekventering 12,13 er blevet anvendt til at bestemme forholdet mellem konkurrerende vira baseret på nucleotid frekvenser på stedet (r) af interesse. Relativ fitness er afledt af ændringer i dette forhold over tid. Denne metode er praktisk som DNA-sekventering tjenester er bredt tilgængelige. Den parallelle allel-specifikke sekventering (PASS) metode gør det muligt sekventering på flere steder og påvisning af rekombinanter 14 </sup>, Men det kræver også specifikt udviklede reagenser og detektionssystemer. Væsentlige, blev disse fremgangsmåder udviklet til at studere virale stammer med et lille antal af nucleotid-forskelle i en region af interesse. Andre metoder bruger en lille reporter gen 15 eller synonyme mutationer 4,16-18 som koder til at skelne de konkurrerende virus ved sekventering, heteroduplex sporing analyser (MTV) 4,7,17,19 eller transskription-kvantitativ real-time polymerasekædereaktion vende (RT-qPCR) 15,16,18,20, som alle kan gøres gældende for at studere konkurrerende stammer uanset sekvenslighed. Et yderligere trin er nødvendigt at indføre tags i virusgenomer og RT-qPCR assay kræver også specifikke reagenser og instrumentering. Vi har fundet, at bulk- Sanger sekventering udbytter sammenlignelige resultater 9.
Efter vækst konkurrence, er viral replikation fitness præsenteres som relativ fitness, eller et fitnesscenter forhold mellem two virale varianter. Den relative egnethed af et virus kan defineres som det endelige andel af en viral variant normaliseret ved dens oprindelige andel i podestoffet eller som nettet vækstrate forskel mellem de to konkurrerende virus. Vi fandt, at den sidstnævnte metode, ved hjælp af langsgående datapunkter kun inden den eksponentielle vækstfase, produceret de mest robuste resultater 9,20.
In vitro fitness assays anvendes primært til at undersøge biologiske kloner 6-8 og infektiøse molekylære kloner af HIV-1. Sidstnævnte, som er modtagelige for genetisk manipulation, anvendes ofte til at undersøge virkningen på fitness fra bestemte mutationer eller specifikke sekvenser af interesse 3-5,21,22. Følgende protokoller beskrive en arbejdsgang fra det punkt at konstruere nye fuld længde smitsomme HIV-1 molekylære kloner bruger HIV-1 vektorer, som indeholder en sekvens tag, indføre mutationer af interesse, hvilket gør virale lagre og etablering af virale vækstkinetik, Udførelse af væksten konkurrerende analyse og beregning relativ fitness (figur 1).
Ved hjælp af vores optimerede procedurer, vi skabt tre rekombinante HIV-1-mutanter og bestemt deres replikation fitness. Det rekombinante molekylære klon blev først konstrueret ved at erstatte HIV-1 gag-p24-gen-regionen i pNL4-3, et plasmid indeholdende en fuld længde infektiøs genomet af HIV-1 lab stamme NL4-3, med en syntetisk COTB (Center-of træ, subtype B) gag-p24-sekvensen 23 til at skabe prototypen stamme. Single amino ændringer (T186M, T242N og I256V) blev derefter indført for at skabe tre mutant-kloner. Hver mutant blev konkurrerede mod prototype virus at observere fitness effekten af hver mutation i den givne genetiske baggrund. De tre mutanter demonstreret varierende niveauer af replikation fsitness fra let til væsentligt lavere end den prototype virus. Den T242N mutationen er tidligere rapporteret at have en moderat fitnessrumss koste 24-26, svarer til det resultat, der er vist i denne undersøgelse. Fitness udgifter til de to andre mutationer var ikke blevet indberettet tidligere.
Protokollerne fremlagte bestod af to hoveddele: konstruktionen af rekombinante HIV-1 molekylære kloner og vækst kompetitive assays. For at skelne to vira i en duelt inficeret cellekultur, er det vigtigt, at de konkurrerende molekylære kloner indeholder sekvens-tags, som kan påvises ved en RT-qPCR primer-probe-assay eller ved Sanger-sekventering. Denne protokol gør brug af de VIFA og VifB tags, som bor på samme region af HIV-1 NL4-3 vif og koder for den samme aminosyresekvens, men afviger med seks synonyme mutationer. Disse mutationer blev vist ikke at påvirke viral replikation fitness 20. PCR-baserede kloning metode anvendes i denne protokol giver mere fleksibilitet i valg af kloningssites, sammenlignet med restriktionssted baseret kloning. Men effektiviteten af PCR-kloning falder som insert størrelse stiger. Den nuværende grænse for indsatsen størrelse er ~ 5 kb 34. For PCR-baseret kloning og site rettet mutagenesis, er afgørende at anvende en high-fidelity DNA-polymerase til at reducere sandsynligheden for ekstra mutationer. Anvendelse af det minimale antal PCR-cykler, der er nødvendige til opnåelse af tilstrækkelige mængder af produkter er også anbefales. Det er vores erfaring, vi ikke registrere nogen ekstra mutationer efter de PCR-baserede kloning og site-directed mutagenese trin beskrevet her. Alligevel PCR produkterne bør sekventeret for at kontrollere for eventuelle uønskede mutationer. Ideelt set skal hele HIV kodende region blive resequenced.
Mindst tre prøveudtagningssteder tidspunkter bør undersøges inden for den eksponentielle vækstfase 9. De virale vækstkinetik skal først etableres ved hjælp af daglige stikprøver for at bestemme de passende kultur periode og prøvetagning tidspunkter til konkurrencen vækst. En faktor, der påvirker virale vækstkinetik er mangfoldigheden af infektion (MOI). Denne protokol anvendes i alt MOI på 0,005 for både monoinfection og vækst konkurrence, da det blev vist, hvilket gav flere robust resultater end lavere MOI 9. Ikke desto mindre kan lavere MOI anvendes til at opnå en længere eksponentielle vækstfase om nødvendigt, men på bekostning af resultatet konsistens. Denne protokol antyder en indledende infektion forhold på 50:50, forudsat at fitness forskelle i vira er generelt ukendt på forhånd. Men brugen af ulige input forhold er passende, når der er foreløbige data tyder signifikante forskelle i virusreplikation kinetik. I disse tilfælde er en infektion på 70:30 anbefales at give mulighed for detektion af et stort fitness forskel, hvor den mindre egnet virus anbringes i overskud 9.
Protokollen til bestemmelse af TCID50, virale vækst kinetik, og til at udføre væksten kompetitive assays blev optimeret under anvendelse af HIV-1 subtype B, har NL4-3 COTB-p24, og PBMC'er fra en enkelt donor, hvis PBMC demonstrerede konsekvent modtagelighed for HIV- 1-infektion in vitro. Dyrkningsperiodenog prøvetagning tidspunkter præsenteres i denne protokol vil sandsynligvis være egnet til at studere HIV-1 gruppe M virus i humane PBMC'er. Ved hjælp af PBMC'er fra en enkelt kilde er stærkt anbefales for at opnå ensartede resultater som den virale replikation kan variere i forskellige donorceller 35. Selv mindre ønskeligt, kan PBMC'er poolet fra flere donorer anvendes som en udskiftning, forudsat at den samme pulje bruges på tværs af alle forsøg. Et andet alternativ er anvendelsen af cellelinjer. Protokollen præsenteres her blev brugt med succes med T-celle linie CEMx174 23,36. Det er imidlertid vigtigt, at antallet af celler podet er re-optimeret til at opnå en ensartet cellevækst. Virale vækstkinetik skal også genetableres, da det er sandsynligt at variere i forskellige cellelinjer, for at bestemme de passende prøvetagning tidspunkter i væksten konkurrence- trin.
To forskellige metoder til fastlæggelse af virale ratio for beregning fitness er inkluderet i protocol. I første fase anvendes RT-qPCR at måle viral cDNA kopiantal ved hvert tidspunkt for prøvetagning. Viral replikation fitness blev derefter beregnet fra den virale forhold, baseret på cDNA kopiantal. Alternativt kan den virale forholdet bestemmes på grundlag af forholdet mellem kromatogram tophøjde på ViFAB tag sites. De to metoder gav sammenlignelige resultater (figur 4). Kromatogrammet tophøjde metode kan anvendes på andre HIV-1 stammer uden et konstrueret sekvens tag. For RT-qPCR, anvendelse af primere eller prober til at skelne virusvarianter først skal evalueres omhyggeligt (se 20). Alligevel RT-qPCR giver bedre følsomhed for prøver med en lille mængde af viralt RNA, såsom dem fra det første tidspunkt i den eksponentielle vækstfase. Direkte måling af viral cDNA tillader også påvisning af tekniske problemer, der kan opstå i forbindelse med RNA ekstraktion og cDNA-syntese. Ved hjælp af molekylære kloner med sekvensmærker giver en omkostningseffektiv løsning to RT-qPCR metoder, da kun to par primere og prober er nødvendig for at studere flere vira. Denne strategi undgår også problemet med peak-højde variation i sekvens chromatogrammerne skyldes tilstødende baser 37, som sekventering sker på det samme sted på tværs af alle vira i undersøgelsen. PCR-produkterne produceret til RT-qPCR og Sanger-sekventering kan også være brug med andre metoder til at bestemme viral forhold såsom bulk-sekventering af individuelle kloner 12,13, MTV 4,7,17,19 eller oligonukleotid ligeringsassayet (OLA) 38 .
The authors have nothing to disclose.
These studies were funded by US Public Health Services grants P01AI057005, R01AI047734, R01AI111806 and the Functional Profiling and Computational Biology Core of the University of Washington’s Center for AIDS Research (P30 AI027757).
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Construction of recombinant clones | |||
Chimeric primer/Mutagenic/Sequencing primers | IDT | N/A | Custom DNA oligos |
pNL4-3VifA and pNL4-3VifB plasmid | N/A | N/A | Please contact Dr. James I Mullins (jmullins@uw.edu) |
High-Fidelity DNA polymerase | Thermo Scientific | F-549S | |
High-fidelity buffer | Thermo Scientific | F-549S | |
dNTP | Bioline | Bio-39026 | |
Thermal cycler | Life Technologies | N/A | Applied Biosystems® GeneAmp® PCR System 9700 |
DNA loading dye | Thermo Scientific | R0631 | |
1kb Plus DNA ladder | Invitrogen | 10787-018 | |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
QIAquick gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
DpnI enzyme | New England Biolabs | R0176S | |
TOP10 chemically competent Escherichia coli | Invitrogen | C4040-10 | |
Luria Broth base powder | Invitrogen | 12795-084 | |
Carbenicillin | Research Products International | C46000-25.0 | |
QIAprep Spin Miniprep kit | Qiagen | 27104 | |
EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
Transfection | |||
X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent | Roche | 6365787001 | |
HEK 293T-17 | ATCC | CRL-11268 | http://www.atcc.org/ |
0.22um filter top tube | VWR International | 89220-716 | |
Cell culture | |||
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 10566016 | |
Iscove′s Modified Dulbecco′s Medium (IMDM) | Life Technologies | 31980-030 | |
RPMI-1640 media | Life Technologies | 61870-036 | |
Phytohemagglutinin (PHA) | Thermo Scientific | R30852801 | |
Human Interleukin-2 | Roche | 11147528001 | |
Fetal bovine serum | JR Scientific | 43640 | |
Penicillin and Streptomycin | Corning Cellgro | 30-001-CI | |
6 well plate | VWR Scientific | 73520-906 | |
48 well plate | VWR Scientific | 62407-338 | |
96 well flat-bottomed plate | ISC Bioexpress | T-3015-4 | |
96 well round-bottomed plate | BD Falcon | 353077 | |
1.5 ml Microcentrifuge Tube | Mt. Baker Bio | MBD-1500 | |
1.5 mL tubes w/ O-ring | VWR Scientific | 89004-290 | |
50 mL conical tube | ISC Bioexpress | C-3317-6 | |
ELISA | |||
Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
Phosphate buffer saline (PBS) | Invitrogen | 14190-250 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F0392 | |
glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
Rabbit anti-HIV-1 SF2 p24 antiserum | NIH AIDS Reagent Program | 4250 | |
Goat anti-rabbit HRP | KPL | 474-1516 | |
TMB Microwell Peroxidase Substrate | KPL | 52-00-01 | |
H2SO4 | Fisher Scientific | A300-500 | Causes severe burns by all exposure routes. Use personal protective equipment. Use only under a chemical fume hood. Wash off immediately with plenty of water for at least 15 minutes. |
HIV p24 standard | AIDS and Cancer Virus program (NCI-Frederick) | N/A | For order details please contact Julian Bess, Jr. (bessjw@mail.nih.gov); http://ncifrederick.cancer.gov/Programs/Science/Acvp/bio/Bess.aspx |
Microplate reader | Molecular Devices | N/A | VMax Kinetic ELISA Microplate Reader |
RNA isolation cDNA synthesis | |||
QIAxtractor | Qiagen | N/A | http://www.qiagen.com/products/catalog/automated-solutions/sample-prep/qiaxtractor |
QIAamp Viral RNA Mini Kit | Qiagen | 52906 | |
dNTP | Bioline | Bio-39026 | |
SuperscriptIII | Invitrogen | 18080-085 | |
First-strand buffer | Invitrogen | 18080-085 | |
Dithiothreitol (DTT) | Invitrogen | 18080-085 | |
Rnase inhibitor | Roche | 3335402001 | |
RnaseH | Invitrogen | 18021-071 | |
qPCR | |||
Real-time qPCR machine | Life Technologies | N/A | Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR |
TaqMan® Gene Expression Master Mix | Life Technologies | 4369016 | |
Forward, reverse primer | IDT | N/A | Custom order |
Probe | Life Technologies | N/A | Custom order |
optical 96 well reaction plate | Life Technologies | I19N3Q216 | |
PCR+sequencing | |||
Taq DNA polymerase (Biolase) | Bioline | Bio-21043 | |
NH4 buffer | Bioline | Bio-21043 | |
MgCl2 | Bioline | Bio-21043 | |
Sequencing primer | IDT | N/A | Custom order |
QIAxcel | Qiagen | http://www.qiagen.com/products/catalog/automated-solutions/detection-and-analysis/qiaxcel-advanced-system | |
DNA sequencing service provider | http://www.htseq.org/ | ||
GRC web tool | http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/grc/ | ||
ChromatQuan web tool | http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/cgi-bin/chromatquant.cgi |