ヒト免疫不全ウイルスの複製フィットネスを決定するためのペアごとの成長競合アッセイ

Summary

Growth competition between nearly isogenic viruses provides a sensitive measurement for determining relative replication fitness. The protocols described here include the construction of recombinant HIV-1 clones, virus propagation and growth competition and analysis methods optimized to yield sensitive and consistent results.

Abstract

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to extrapolate viral replication fitness, ranging from the number of viral particles per infectious unit, growth rate in cell culture, and relative fitness derived from multiple-cycle growth competition assays. Growth competition assays provide a particularly sensitive measurement of fitness since the viruses are competing for cellular targets under identical growth conditions. There are several experimental factors to consider when conducting growth competition assays, including the multiplicity of infection (MOI), sampling times, and viral detection and fitness calculation methods. Each factor can affect the end result and hence must be considered carefully during the experimental design. The protocol presented here includes steps from constructing a new recombinant HIV-1 clone to performing growth competition assays and analyzing the experimental results. This protocol utilizes experimental parameter values previously shown to yield consistent and robust results. Alternatives are discussed, as some parameters need to be adjusted according to the cell type and viruses being studied. The protocol contains two alternative viral detection methods to provide flexibility as the availability of instruments, reagents and expertise varies between laboratories.

Introduction

ウイルス複製適性は、与えられた環境で¹感染性の子孫を生成するウイルスの能力として定義され^、2時間かけて集団レベルでのウイルス変異の有病率を決定する重要な要因です。 in vivoでのように、トレーニングの研究では、in vitroでの様々なそのようなHIV-1などの病原性ヒトウイルス、と現実的ではないですし、ex vivoでの複製フィットネスアッセイは、薬剤耐性および免疫回避突然変異から生じるフィットネス、上位性と進化への影響を研究するために開発されてきましたウイルス集団^3-6の。異なるフィットネスアッセイの中で、成長競合アッセイは、in vivo ^1,7,8 で起こるように、2つ以上のウイルス変異体は、正確に同じ環境条件下で同じ細胞集団のために競うように、フィットネス差のより感度の高い、有効な対策をもたらすと認識されています。成長競合実験を開始する前に、いくつかのvariabレ感染の異なる多重度（MOI）を用い、ウイルスの入力比、および分析のためのサンプリングのタイミングを含む、決定する必要があります。我々は、ウイルスの増殖速度のと競合実験の結果に、これらのパラメータの影響を研究している、および細胞培養⁹中のHIV-1のフィットネスの強固な測定のために必要な重要な要素を同定しました。

変数をアッセイに加えて、成長の競合実験においてウイルス変異体を定量するための様々な方法があります。バルク^10,11またはクローンの配列決定^12,13は、目的の部位（複数可）でのヌクレオチドの頻度に基づいて、競合するウイルスの割合を決定するために使用されてきました。相対的なフィットネスは、時間をかけて、この比率の変化に由来します。 DNAシークエンシングサービスが広く利用可能であるように、この方法が便利です。並列対立遺伝子特異的配列決定（PASS）メソッドは、複数の部位で配列決定および組換え体¹⁴の検出を可能に</sup>が、それはまた、特別に開発試薬および検出システムを必要とします。本質的に、これらの方法は、関心領域内のヌクレオチドの差異の数が少ないウイルス株を研究するために開発されました。他の方法は^、4,7,17,19ヘテロトラッキングアッセイ（HTA）、配列決定によって競合ウイルスを区別するためにタグとして^4,16-18小さなレポーター遺伝子¹⁵または同義突然変異を使用するか、または転写定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応を逆転します関係なく、配列類似性の競合株を研究するために適用することができるこれらの全て（RT-qPCRの^{）15,16,18,20、。}追加のステップは、ウイルスゲノムにタグを導入するために必要であり、RT-のqPCRアッセイはまた、特異的な試薬や機器を必要とします。我々は、バルクサンガー配列決定の利回り同等の結果^9。

成長競争に続いて、ウイルス複製のフィットネスは、相対フィットネス、またはTとフィットネス比として提示されていますウイルスの変異体をめざし。ウイルスの相対的な適応は、接種物中または2つの競合するウイルス間の正味の成長率の差としての最初の割合によって正規化ウイルス変異体の最終的な割合として定義することができます。我々は、後者の方法は、唯一の指数増殖期内の縦のデータポイントを使用して、最も強力な結果^9,20を生じたこと^を発見しました。

in vitroでのフィットネスアッセイは、生物学的クローン^6-8とHIV-1の感染性分子クローンを研究するために主に使用されています。後者は、遺伝子操作に適している、多くの場合、特定の突然変異または関心^3-5,21,22の特定の配列から、トレーニングの効果を研究するために使用されます。次のプロトコルは、ウイルスの増殖速度を、配列タグを含むHIV-1ベクターを使用して、新しいフルレングスの感染性HIV-1分子クローンを構築する目的の変異を導入、ウイルスストックを作製し、確立した時点からワークフローを記述します、相対的なフィットネスを成長競合アッセイを実施して計算する（ 図1）。

当社の最適化された手順を使用して、我々は3組換えHIV-1変異体を作成し、それらの複製のフィットネスを決定しました。組換え分子クローンは、第1の合成COTB（センターオブと、pNL4-3のHIV-1 のgag-P24遺伝子領域、HIV-1実験室株NL4-3の全長感染性ゲノムを含むプラスミドを置換することによって構築されましたプロトタイプ株を作成するために、ツリー、サブタイプB） のgag-P24配列 ^23。単一アミノ酸変化（T186M、T242N、およびI256V）は、次の3つの変異体のクローンを作成するために導入されました。各変異体は、特定の遺伝的背景の各突然変異の適応度への影響を観察するために、プロトタイプのウイルスに対して競合させました。原型ウイルスよりもわずかに有意に低いから複製fsitnessのレベルを変化させることを実証し3の変異体。 T242N突然変異は、以前適度なfitneを有することが報告されましたSSは、本研究で示した結果と同様の^24-26、コスト。他の2つの変異の適応コストは以前に報告されていませんでした。

Protocol

注：このプロトコルは、以下に説明するように、任意の患者を特定できる情報は含まれていないため、ワシントン大学の治験審査委員会によるヒトテーマ研究やヒト対象の部門とはみなされません。 キメラHIV-1 NL4-3分子クローンの1建設 1.1）を増幅挿入DNA断片キメラプライマーを設計します。 5 'の両方の半分フォワードおよびリバースプライマーは、断片が挿入される時にHIV-1ベクター配列を含みます。プライマーの3 '側半分は、挿入配列（ 図2）の端部を含む必要があります。キメラプライマー配列は、元のオープンリーディングフレームを保持していることを確認します。 以上、60℃に等しい融点、約50％のGC含量、及びプライマーダイマー、ヘテロおよび/またはヘアピン構造を形成する傾向が低いと、長さのプライマー、少なくとも20塩基を使用してください。これらの性質を評価OligoAnalyzer Webツールを使用して（ https://www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/ ）。 使用するPCR 27及びキメラプライマーは、挿入DNA（ 図2）を増幅しました。各PCR反応は、1×高忠実度緩衝液、0.2mMのdNTPを、高忠実度DNAポリメラーゼの1 U、フォワードキメラプライマー0.5μM、逆キメラプライマー0.5μM、および挿入領域を有するDNAサンプルの1 PG0のNGを使用しています。 50μlの最終容量までのdH 2 Oを追加します。 次のように熱サイクリングステップを設定します。10秒間98℃での最初のDNA変性ステップを実行します。 20秒間の2つのプライマーの最低溶融温度より3℃で10秒、DNAアニーリング98℃のDNA変性の30サイクルで増幅します。 72℃で10分間の最終伸長を行います。 4°Cで保存したPCR産物。 からのPCR産物の5μLを取ります前のステップとアガロースゲル電気泳動28を実行します。 DNAサイズマーカーとしての0.7％アガロースゲル、1×TAE緩衝液（40mMのトリス – 酢酸、1mMのEDTA）、0.5 / mlのエチジウムブロマイド（EtBrを）最終濃度と1キロバイトラダーを使用します。電極間に5 V / cmの距離に電源電圧を設定します。ローディング色素が約2/3ゲル長の通って移動するときに電気泳動を停止します。ゲルドキュメンテーションシステム28を用いてゲルを可視化します。 注：EtBrをが疑われる発がん性物質であり、適切に金融機関の規制ごとに、廃棄しなければなりません。 EtBrを含有ゲルを取り扱う際の手袋を常に着用する必要があります。仕上げは材料を含有し、交差汚染を防止するために、他の材料や装置を取り扱う前にEtBrをを処理した後、新しい手袋に変更します。 所望のPCR産物に対応する大き​​さの唯一のDNAバンドが検出された場合、そのようなQIAクイックPCR精製キットアコードのような市販のキットを用いてPCR産物の残りを精製製造業者のプロトコルにる。 他の非特異的バンドも存在する場合、分取ゲル電気泳動を実行するためにPCR産物の残りを使用。ステップ1.1.4で指定された同じパラメータと条件を使用してください。ゲルウェルは〜PCR産物の45μLをロードするのに十分な大きさであることを確認してください。目的のバンドを切り出し、製造業者のプロトコルに従って、QIAquickゲル抽出キットを用いてゲルからDNAを抽出します。 1.2））（完全長感染性HIV-1サブタイプB VectorにpNL4-3を挿入断片を導入 PCRプライマーとしてステップ1.1.5から精製したPCR産物を使用してください。 1つのPCR反応において、鋳型DNAとしてpNL4-3VifA 20および他の反応（ 図2）において鋳型としてpNL4-3VifB 20を使用する使用。各PCR反応のために、1×高忠実度緩衝液、0.2mMのdNTPを、高忠実度DNAポリメラーゼの2 Uを使用し、プライマーDNAと鋳型DNA 50ngの500ngの最終体積で50μLの梅。 10分間72℃、続いて10分間、1分、72℃、30秒間、98℃、10秒間、98℃で35サイクル、48℃：熱サイクルにパラメータを設定します。 PCR反応の50μlにのDpn Iの10 Uを追加し、テンプレートDNAを消化し ​​、37℃で1時間インキュベートします。 例えば 、プラスミドDNAがメチル化コンピ細菌株から単離されていることを確認し、TOP10化学的にコンピテントな大腸菌 。 私は有能な細菌細胞を形質転換するために、製品を消化のDpnを使用してください。 TOP10化学的コンピテントE.と熱ショック変換を使用しますコリ 、製造業者のプロトコルに従って。組換えプラスミドを含む細菌細胞を選択するために、100 mg / Lのカルベニシリンを含むルリアブロス（LB）培養プレートを使用しています。 〜10十分に分離したコロニーを選択し、3ミリリットル100 mg / Lのカルベニシリンを含むLB液体培地で個別に成長し、30℃でインキュベートシェーカーO / N。 使用のQIAprepは、製造業者のプロトコルに従って、細菌の液体培養物からプラスミドDNAを単離するためにミニプレップキットをスピン。 プラスミドDNAは、適切な挿入物を含んでいるかどうかを決定するために、二重制限酵素消化を使用して29。制限部位の一つが唯一の挿入領域内に存在し、他の制限部位が挿入領域の外側に、HIV-1ベクター中に一度だけ存在することを確認します。 10μlの最終反応容量でプラスミドDNAのダイジェスト少なくとも300 ngの。選択した制限酵素の製造業者のプロトコールに従って、制限緩衝液、インキュベーション温度、インキュベーション時間を選択します。消化したDNAの9μLを取り、ステップ1.1.4で説明したようにゲル電気泳動を実行します。予想されるサイズのDNAバンドを持っている組換えプラスミドを選択します。 サンガー配列決定により、組換えプラスミドの配列完全性を確認してください。まれ、不要な一方、突然変異は、PCR反応中に導入することができます。 配列のプラスミドDNAの両方の鎖。配列決定プライマーを設計するために、ステップ1.1.1.1の手順に従ってください。また、その前方を確保し、それぞれ、組換えプラスミドの上流と下流の挿入領域の配列決定プライマーのアニーリング、少なくとも50塩基対を逆転。 市販のDNAシーケンシングサービスプロバイダにプラスミドDNAと配列決定プライマーを提出してください。サービスプロバイダによって指定されるようにDNAサンプルとプライマーを準備します。 製造業者のプロトコルに従ってエンドトキシンフリーのプラスミドDNAキットを用いて変異したプラスミドDNAのエンドトキシンフリーのストックを作ります。次のステップでトランスフェクションのためにエンドトキシンを含まないプラスミドDNAの少なくとも1μgのを準備します。 1.3）小規模変異経由部位特異的突然変異誘発を導入前方に重ねて変異プライマーを設計し、希望mutatを含むリバースプライマーイオン（複数可）。位置ベース（s）は、置換、挿入、またはプライマーの途中で削除された、10-15の相同な塩基によって隣接されます。ステップ1.1.1.1の指示に従ってください。 変異プラスミドを合成するために、PCRを使用します。各PCR反応は、1×高忠実度緩衝液を使用し、10mMのdNTPを、高忠実度DNAポリメラーゼの2 U、フォワード変異原プライマー0.5μM、逆変異原プライマー0.5μMおよびキメラpNL4-3VifB 50ngの、ステップ1.2.6から、50μlの最終容量中。 10分間72℃、続いて10分間、1分、72℃、30秒間、98℃、10秒間、98℃で25サイクル、48℃：熱サイクルにパラメータを設定します。 繰り返し手順1.2.6に1.2.2。 トランスフェクションを使用してウイルスストックの2世代必要なウイルスストック希望とプラスミドDNAの量を計算します。 10 4 IU / ml以上のウイルス力価を有するウイルスストック1.8mlの成長競争ASSA二組のために十分ですYS、monoinfections含め、それぞれが三連で行われ。 6ウェルプレート中で行われ、トランスフェクションのために、約1.8ミリリットルの上清をウェルあたり採取します。プラスミドDNA1μgの6ウェルプレートで行った各トランスフェクションのために必要とされます。 6ウェルプレートの各ウェルについては、 例えば 、トランスフェクション混合物100μlの準備をします。、1μlのX-tremeGENE 9トランスフェクション試薬（または同等の製品）からなる、プラスミドDNAおよび無血清DMEM1μgの。 ウェルあたり1μgのプラスミドDNAを使用して必要なプラスミドDNAの量を決定します。プラスミドDNAの最終濃度は、少なくとも50 ng /μLであることを確認してください。 よく式を用いごとに必要とされているどのくらいの無血清培地（DMEM）を決定しますμL= 100μlのDMEMの総容量 – μlのDNA量を。 6ウェルプレートに10 6 HEK 293T-17（ATCC）細胞/ウェルで増殖培地（DMEM + 10％ウシ胎児血清（FBS））を2mlを加えます。 37℃で1時間インキュベートします5％CO 2雰囲気 。必要に応じて（ステップ2.1で決定された）など、多くの井戸をシード。 トランスフェクション混合物を調製し、アリコート無血清DMEMの適切な量、上で計算したように、1.8ミリリットルのポリプロピレンマイクロ遠心チューブに、その後、トランスフェクション試薬を追加します。 ピペット試薬が直接培地溶液に、マイクロチューブのプラスチック表面にそれを追加しないでください。最後のプラスミドDNAを追加します。上下ピペットで静かに溶液を混合します。トランスフェクション複合体の形成を可能にするために、RT（25℃〜15℃）で15分間インキュベートします。 6ウェルプレートに播種した細胞に滴下様式で、混合物を追加します。ゆっくり振るまたはトランスフェクション複合体の均一な分布を確実にするために井戸を旋回。 プラスチックラップでシールプレート。 48時間、5％CO 2雰囲気中で37℃で培養物をインキュベートします。 慎重に15ミリリットルチューブthrouに上清を収集し、転送するためにピペットを使用して、0.22μmフィルタートップをGH。 蓋ゴムガスケットと1.8ミリリットルマイクロチューブに濾過した上清250μlの以上を転送するためにピペットを使用してください。 ストアは、使用するまで-80℃で上清を濾過しました。 3.末梢血単核細胞（PBMC）のウイルスストックの感染力価を決定しますフィトヘマグルチニン（PHA）でのPBMCを刺激します。つのウイルスストック、シード完全イスコフ改変ダルベッコ培地中で2×10 6のPBMC当たり（cIMDMを、ヒトインターロイキン2を20 U / mlを補充したIMDM（HIL-2）、10％ウシ胎児血清および1％ペニシリン/ストレプトマイシン）を補充しPHA（1.5μgの/ ml）で。 2×10 6細胞/ mlの種子のPBMC。 72時間、5％CO 2雰囲気中、37℃でのPBMCをインキュベートします。 収穫PHAはPBMCを刺激しました。 50mlコニカルチューブに非接着性のPHA-PBMCを転送します。 10分間、228×gでチューブをスピン。慎重disruptinずに上清を除去G細胞ペレット。 cIMDMで2×10 5個のPBMC / mlの最終濃度まで細胞ペレットを再懸濁します。 シード2×10 4 PHAは、丸底96ウェルプレートに100μl/ウェルcIMDMに/ウェルのPBMCを刺激しました。 ウイルスストックの1:10希釈液を作ります。そして、第1希釈したストックから、96ウェルマスタープレートに12 3倍連続希釈液を作ります。この希釈スキームは、1ml当たり4月 10 日から6月 10 日まで感染単位（IU）の範囲内でウイルス力価を検出することをお勧めします。 例えば、1.5mlチューブに180μlの培地にウイルスストックの20μLを加えます。慎重にピペットで希釈を混ぜます。そして、第一のウェル180μlの培地に希釈した株式の90μLを転送し、ピペッティングでよく混ぜます。 次のウェルに180μlのメディアに現在のウェルから11回以上90μLを転送することにより、希釈系列を続けます。 10 6 IU / mlの力価よりも高い場合には最初の希釈を増減またはより低い10 4 IU / mlのそれぞれ、期待されています。 四重に（ステップ3.3から）マスター希釈プレートから播種したPBMCプレートに段階希釈したウイルスストックの40μLを加えます。 16〜24時間、5％CO 2雰囲気中、37℃でプレートをインキュベートします。 慎重に、各ウェルから100μlの上清を除去し、200μl/ウェルの総体積に新鮮cIMDM160μlのと交換してください。 5％CO 2雰囲気（1日目）で37℃で培養します。 日4、7、10および13の転送上の各ウェルに100μlの破壊緩衝液（PBS中の2％トリトンX-100）からの上清100μl、新鮮なcIMDM100μlと交換してください。 -20℃で上清を保存します。 サンプリングし、力価が安定するまで3日ごとに新鮮なcIMDMを追加してください。 7日目と1を用いたp24 ELISAによってウイルスストックの50％組織培養感染量（TCID 50）を決定3つのサンプルは、ステップ4で説明しました。 13日目から得られたTCID 50は、7日目から力価よりも明らかに高い場合、ウイルスストックは拡大するより長い時間が必要な場合があります。 2つのサンプリングの時点からの感染力価が安定（または減少）になるまで、それ以降のサンプルを用いたp24 ELISAを繰り返します。最高の力価を有するサンプルから株式を選択します。 ウイルス感染力価を決定するためのHIV-1のp24 4. ELISA（酵素結合免疫吸着アッセイ）検出注：以下のプロトコルは、我々の研究室30で製造したp24抗原捕捉プレートを使用して開発されました。市販のHIV-1のp24 ELISAプレート/キットはまた、製造業者のプロトコールに従って使用することができます。 サンプルで作業をする前に、一次抗体（ウサギ抗HIV-1 SF2 p24を抗血清）の作業ストックを準備します。 室温で解凍のp24抗血清。 phosphat 10％FBS 2mlのグリセロール2.5mlのを混ぜますE緩衝生理食塩水（PBS）。 抗血清0.5 mlを加え、混合します。 ストア-20℃でアリコートの1ミリリットル。 37℃のインキュベーターのステップ3.7からの雪解けサンプル。 P24捕捉プレートを（0.05％のTween-20を有する1×PBS）洗浄緩衝液で5回洗浄します。 その後、適切なウェルに50μlのサンプルを追加し、（RPMI-1640で、1％ウシ血清アルブミン（BSA）が0.2％のTween-20）を50μl/ウェルの試料希釈剤のを追加します。唯一のモック/陰性対照としてサンプル希釈剤で少なくとも3つのウェルを含みます。 4℃で37°CまたはO / Nで2時間インキュベートします。 使用前に、新鮮な一次抗体溶液を準備します。一次抗体の希釈液（RPMI-1640中で12％FBS）を使用して株式を働いた一次抗体の2000倍希釈：1にします。 96ウェルプレート中のウェルの各サンプル/対照あたり100μlの溶液を使用するために十分に準備することを確認してください。 例えば、一次抗体workiの5μlを添加、1枚の96ウェルプレートのための十分な解決策を作るために10ミリリットルの最終容量のための一次抗体希釈液に株式をngの。 洗浄バッファーで捕獲プレートを5回洗浄します。 各ウェルに一次抗体溶液100μlを追加します。 5％CO 2雰囲気中、37℃で1時間インキュベートします。 使用前に、新鮮な二次抗体溶液を準備します。二次抗体希釈液（7％のFBS、RPMI-1640で0.01％のTween-20）を使用した二次抗体（1 mg / mlのヤギ抗ウサギHRP）の14,400倍希釈：1にします。ピペッティングの誤差を低減するために、二段階連続希釈を行います。 96ウェルプレート中のウェルの各サンプル/対照あたり100μlの溶液を使用するために十分に準備することを確認してください。 例えば、第1の2次抗体希釈液の99μlにした二次抗体の1μlを添加、1枚の96ウェルプレートのための十分な溶液を作製します。その後、10ミリリットルの最終容量二次抗体希釈液に最初の希釈液70μlを添加します。 ウォッシュ捕獲プレート5ティム洗浄緩衝液でES。 各ウェルに二次抗体溶液100μlを加えます。 5％CO 2雰囲気中、37℃で1時間インキュベートします。 洗浄緩衝液でプレートを5回洗浄します。 RT TMB基質100μlを追加します。光から保護するために密閉容器中、室温で30分間インキュベートします。 RT停止溶液100μl（1 NH 2 SO 4）を追加します。 各ウェルマイクロプレートリーダーを使用して450〜650 nmの吸光度を読みます。各だけでなく、感染または感染していないスコアに吸光度の値を使用してください。吸光度の値が負/モック対照ウェルから読み取った値よりも少なくとも3倍高い場合、感染性ウイルスを含むことをよく考えてみましょう。リードMeunch法31を使用してウイルスストックのTCID 50を計算します。 5.ウイルス増殖速度論を確立 5.1）単一菌感染シード3×10 5 PHA刺激PBMC /ウェルで48ウェルプレート中500μL/ウェルの全容量の。接種まで、5％CO 2雰囲気中で37℃で培養プレートを保管してください。 各ウイルスについて、cIMDM 2mlに6,000 IUを含む接種材料を準備します。 播種した細胞に接種物を500μl（1,500 IU）を追加することで、三連のウェルに接種。感染細胞培養物の最終容量は/ウェル1 mlであるとMOIが0.005です。 アリコートバックアップとして保存されて一方がRNA単離のための2つの96ウェルプレートのそれぞれの残りの接種材料を200μl。 16〜24時間、5％CO 2雰囲気中で37℃で培養物をインキュベートします。 洗浄培養接種後16〜24時間。 培養上清750μlのを削除して破棄します。 新鮮cIMDMの750μlを添加します。 300×gで10分間ラップとスピンでプレートをラップします。 750μlの上清を除去し、廃棄します。 新鮮cIMDMの750μlを添加します。 5％CO 2で37℃でインキュベートしますmosphere（1日目）。 毎日の2日目から7日目のサンプルの文化。 1.8ミリリットル遠心管に培養上清500μlのを転送します。 3,000×gで1分間スピン。 再びバックアップとして一つのプレートを保存し、RNA単離のための2つの96ウェルサンプルプレートに、無細胞上清200μlのを転送します。 RNAの単離まで-80℃で保存上清。 各培養物に500μlの新鮮なcIMDMを追加します。 5％CO 2雰囲気中、37℃でインキュベートします。 実験の終了時にWescodyneに文化を捨てます。 メーカーの標準プロトコルに従って（例えば、のQIAampウイルスRNAミニキットなどの市販のキットを使用）して上清を200μlからRNAを分離します。多数のサンプルについては、キアゲンQIAxtractorを使用します。 cDNA合成まで-80℃で保存したRNAサンプル。 5.2）cDNA合成（逆転写） 各RNAのための十分な、ウイルスRNAの10μlに（7995に5'-GTTGATCCTTTAGGTATCTTTCCACAGC-3 '、HXB2のヌクレオチド7968）のdNTP 1.2ナノモルおよびcDNA合成プライマーの1.2ピコモルを、追加します。 14μlの最終容量に水を追加します。混合し、チューブの底に液体を収集するために簡単にスピンし、チューブをフリック。 マスターミックスが調製されるまで4℃で保持し、65℃で5分間混合物をインキュベートします。 5X第一鎖緩衝液（250 mMトリス-塩酸、pHが8.3、375のKCl、15mMのMgCl 2を）、5mMのDTT、120 SuperScriptIIIのUと240 UのRNase阻害剤を使用してマスターミックスを調製します。 10μlの最終容量に水を追加します。 、RNA混合物に混合し、収集するためにスピンするフリックをマスターミックス10μlのを追加します。 cDNAの合成を可能にするために、50℃で90分間混合物をインキュベートします。逆転写酵素を不活性化するために70℃で15分間インキュベートします。必要に応じて、4℃で保持します。 混合するためにRNアーゼH、フリックの2 Uを追加し、収集するためにスピン。 20分間インキュベート37℃。 -20℃で保存するcDNA。 5.3）のcDNA定量は定量PCRシステムを使用しました標準希釈シリーズを準備します。 3×10から6コピーが/ pNL4-3VifAの30コピー/μL、までμlで、10倍連続希釈してください。希釈液を蒸留水を使用してください。使用前に新たな標準希釈系列を準備したり、小さなバッチを調製し、-20℃で維持します。凍結融解しないでください標準を3回を超えて。 96ウェルのqPCR反応プレートを設定します。各プレートは、少​​なくとも一つの陰性対照のウェル、標準希釈シリーズの三連、各cDNAサンプルの少なくとも重複が含まれていることを確認してください。 各定量PCR反応のために、定量PCRマスターミックス12.5μlの、0.2μMのプローブ、フォワードおよびリバースプライマーの0.8μMのそれぞれのcDNAの1μlあるいは（よく負の制御用）標準希釈系列または水/緩衝液を使用しています。 25μlの最終容量に水を追加します。定量PCRプローブは、光銭ですsitive。密閉容器に保管してください。 VifABフォワードプライマー（GGTCTGCATACAGGAGAAAGAGACT）、VifAリバースプライマー（5'-AGGGTCTACTTGTGTGCTATATCTCTTTT-3 '）とVifABプローブ（6FAM-5'-CTCCATTCTATGGAGACTC-3：pNL4-3VifA基づく分子クローンに由来するcDNAを検出するために、VifAプライマー·プローブを使用します「-MGBNFQ）。 VifABフォワードプライマー、VifABプローブとVIFBリバースプライマー（5'-CACCTGCGTGCTATACCTTTTCT-3 '）：pNL4-3VifBベースのクローン由来のcDNAについて、VIFBプライマー – プローブを使用しています。 2分間、10分間、95°C、15秒、1分、60°C、95°Cの40サイクル、50℃でPCRサイクリングパラメータを設定します。定量PCR機の動作については、メーカーのサポートドキュメントを参照してください。 三重標準希釈系列からのデータを使用して標準曲線を計算します。コピー数を決定するために、標準曲線をcDNAサンプルの増幅データを比較します。ダについては、製造元のサポートドキュメントを参照してくださいTA処理。 5.4）ウイルス指数増殖期を決定します X軸およびY軸に沿ってcDNAコピー数に沿ってサンプリング日とプロットウイルスの増殖速度と、すなわち 、ウイルスの対数増殖期を識別する。、ウイルスcDNAは指数進行の数の増加をコピーします。 GRC Webツール（使用http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/grc/をウイルス増殖率（g）を計算します）。このアプリケーションでは、GRCツールは、cDNAは、入力として、少なくとも2つの時点から番号をコピーし、ウイルスの増殖速度（g）を出力する受け付けます。正確な成長率を得るために、（上記の手順5.4.1を参照）指数増殖期内でのみ時刻データを使用してください。 GRC Webツールで使用される数学的モデルの詳細については、20を参照してください。 6.成長競合アッセイシード3×10 5 </ SUP> PHA刺激PBMC（または1×10 5 CEMx174細胞）48ウェル平底プレート中のウェルあたり500μlの全容量。 接種まで、5％CO 2雰囲気中37℃でプレートを保管してください。 各ウイルスについて、6,000 IUを含む接種材料の3ミリリットルを準備します。 二重感染接種物を作成するために滅菌チューブに各ウイルス接種の1.5ミリリットルを転送します。 48ウェルプレートに3×10 5個の細胞に二重の接種材料（1,500 IU）の500μlを添加します。最終培養容積は十分に1 / mlです。アリコートをRNA単離のための2つの96ウェルプレートに接種物200μlの。バックアップのような1つのプレートを保存します。 16〜24時間、5％CO 2雰囲気で37℃で接種した細胞をインキュベートします。 洗浄培養接種後16〜24時間。 培養上清750μlのを削除して破棄します。 新鮮cIMDMの750μlを添加します。 300×gで10分間、ラップとスピンでプレートをラップします。 750を取り外し、廃棄81; L上清。 新鮮cIMDMの750μlを添加します。 5％CO 2雰囲気（1日目）で、37℃でインキュベートします。 選択サンプリング時間は、ステップ5.4.1において観察指数増殖期中に少なくとも3時間ポイントを含めます。 各サンプリングのために、ステップ5.1.7に従ってください。 5.2節で説明したようにcDNA合成を行います。 定量PCRを用いてウイルスの変異率を決定します。 30コピー/ pNL4-3VifAのμlにμlの3×10 6コピー/から各ステップで10倍に希釈し、三連で標準シリアル希釈系列を調製します。 96ウェルのqPCR反応プレートを設定します。各プレートは、少​​なくとも一つの陰性対照、三連での標準希釈系列、各cDNAサンプルの複製が含まれていることを確認してください。 各定量PCR反応のために、定量PCRマスターミックス12.5μlの、0.2μMのプローブ、0.8μMのフォワードのそれぞれを使用して、プライマーおよびcDNAまたは標準Dの1μLを逆転 ilutionシリーズまたは（陰性対照ウェル用）水/バッファ。 25μlの最終容量に水を追加します。定量PCRプローブは、密閉容器に保管し、光に敏感です。 陰性対照及び標準希釈系列およびcDNAサンプルの1重複して信号を検出するVifAプライマー – プローブを使用してください。 cDNA試料の他の重複とVIFBプライマー – プローブを使用してください。 10分間、次いで95℃、2分間50℃でPCRサイクリングパラメータを設定し、1分15秒、60℃、95℃、40サイクル。定量PCR機の動作については、メーカーのサポートドキュメントを参照してください。 標準希釈系列から増幅データを使用して標準曲線を計算します。コピー数を決定するために、標準曲線をcDNAサンプルの増幅データを比較します。データ処理のための製造元のサポートドキュメントを参照してください。 （GRC Webツールを使用して、ol.washington.edu/grc/">http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/grc/）相対ウイルス適応度（D）を算出します。 NOTE：GRCツールは、cDNAは、入力として、少なくとも2つの時点から、番号またはクロマトグラムのピーク高さをコピーし、2つのウイルス間の正味の成長速度の差（d）を出力する受け付けます。ツールは、2つの時刻データからの正味の成長率を算出することができるが、それを強く3以上の時点からのデータを入力するために推奨されます。指数増殖期内の時点から得られたデータのみを使用して正確な成長速度を得る（ステップ5.4参照）。 GRC Webツールで使用される数学的モデルの詳細については、20を参照してください。 クロマトグラムのピーク高さを用いてウイルスの比率を決定します PCR HIV-1を増幅VIF VifFwd用いVifAB配列タグを含むフラグメント（5'-GAAAGAGACTGGCATTTGGGTCAGGG-3 '; HXB2の位置5266から5291）とVifRevプライマー（5'-GTCTTCT GGGGCTTGTTCCATCTGTCC-3 '; HXB2位置5579から5553）。 各PCR反応のために、1μlのcDNA、1×NH 4緩衝液、各プライマーの1.5のMgCl 2、0.2mMのdNTPを、UのTaqポリメラーゼの2.5、および0.45μMを使用します。最終体積50μlに水を追加します。 30秒間、15秒間、94℃で34サイクル、続いて1分間、1分間55°C、1分間70°C、94°Cで3サイクル58°CのPCRサイクリングパラメータを設定し、そしてその後、70℃1分間、C、および4℃で保持します。 製造業者のプロトコールに従ってキアクイックPCR精製キットを用いてPCR産物を精製します。 サンガー配列決定のためのDNAシークエンシングサービスプロバイダに精製したPCR産物を提出してください。 シークエンシングサービスによって提供されるべきである平均読み取り品質スコアを、確認してください。平均ベースコール精度が85％未満である場合に、6.10.3のステップ6.10.1をやり直します （ChromatQuan Webツールを使用して、f="http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/cgi-bin/chromatquant.cgi">http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/cgi-bin/chromatquant.cgi )各時点でのウイルスの比率を算出します。このツールは、配列トレースファイル（* .ab1）と目的のヌクレオチド部位に配列5 'を必要とします。ツールは、指定されたサイトでのピーク強度を測定します。ピーク強度の比は、2つのウイルス（ 図4B）の比に相当します。 GRC Webツール（使用http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/grc/ウイルス相対適応度（D）を計算するための入力として）、記録ピーク強度を。ステップ6.10.6を参照してください。20

Representative Results

HIV-1のGag-P24における単一アミノ酸変化の適応度への影響を研究するために、我々はHIV-1 COTB-P24遺伝子23,32,33を含むpNL4-3プラスミドに変異を導入するために、オリゴヌクレオチド特異的変異誘発を使用していました。ウイルスストックは、293T細胞のトランスフェクションによって生成され、48時間後に回収しました。我々は、リード-ミュンヒ法31により各ウイルスストックの50％組織培養感染量（TCID 50）を推定しました。プロトタイプと変異体ウイルスのTCID 50は 10 4から10 5 IU / mlで（ 図3A）の範囲でした。 組換えウイルスの増殖動態は、0.005のMOIで、単一のドナーからのPBMCに設立されました。 RT-qPCRを、6日間毎日ウイルスcDNAコピー数を測定しました。ウイルスRNAのコピー数の増加の減少勾配によって示されるように、すべての変異体およびプロトタイプウイルスは<（、、2日目と4日目の間に指数関数的にウイルスの増殖を遅く次のように成長しました強い>図3B）。 0日目（接種物に相当）と2日目の間のcDNAコピー数の減少は、細胞へのウイルスの吸収と1日目の洗浄（ステップ5.1.6）によって結合していないビリオンの除去によるものです。指数増殖期では、すべての3つの変異体は、原型ウイルス（ 図3C）よりも遅い成長速度（g）を有していました。 すべての3つの変異体は、0.005の合計MOIで成長競合アッセイで原型ウイルス競いました。二重感染した培養物中のウイルスの増殖速度は、単一菌感染の場合と同様でした。ウイルスの指数増殖期は、2日目と4の間で、ウイルス増殖は、5日目（ 図4A）の周りにプラトーに達しました。 ウイルスの増殖速度の差は経時ウイルス比率の変化に由来しました。ウイルス比はcDNAコピーの参照の数とRT-qPCRのを使用して、変異体ウイルスであり、比較ピーク高さにより計算しましたシーケンス内の2つのウイルス（ 図4B）を区別するヌクレオチド部位でクロマトグラム。ピーク高さおよびウイルスRNAのコピー数の方法を用いて決定成長速度の違いは、同様の結果（ 図4C）を得ました。すべての3つの変異体は、最も低いフィットネス（ 図4C）を有する変異I256Vとプロトタイプのウイルスよりも低い複製のフィットネスを持っていました。 図1：本論文でのプロトコルのフロー図ウイルスストックのウイルス調製プロトコルの懸念のHIV-1組換えクローンの構築および生成。フィットネスアッセイプロトコルは、ウイルスの増殖速度を確立し、相対的なウイルスの適応度を決定するためのものです。破線は、プロトコルのための代替フローを表します。例えば、突然変異は、HIV-1 NL4-3に直接導入することができ組み換えクローンを作成することなく、分子クローン。 図2：オーバーラップ伸長PCR（A）を使用して、HIV-1 NL4-3 COTBギャグ-P24組換え分子クローンの構築キメラプライマーを設計します。 5 'プライマーの半分はNL4-3ベクター配列を含み、3'半分は、挿入配列の末端を含みます。 （B）キメラプライマーは、挿入断片、COTBのGag-P24を増幅するために使用されます。 （C）挿入断片は、新しい組換えプラスミドを生成するために第2のPCRのためのプライマーとして使用されます。 図3：PBMCにおけるウイルス増殖特性（A）ログ10 TCID 50 </sUB>ウイルスストックの。 （B）MOI = 0.005で開始monoinfectionsにおけるウイルス増殖動態。パネル（B）に由来する指数増殖期（日2-4）を含む6日間の（C）は、ウイルスの増殖速度、。表示される値は、一つの実験からの3つの複製の平均を表します。エラーバーは95％信頼区間を表します。 図4：ウイルスの増殖および相対フィットネスの決定（A）二重感染したPBMC培養におけるウイルスの増殖。 T242Nプロトタイプウイルスの（B）比は、RT-qPCRをシークエンシングまたはピーク高さ法を用いて決定しました。 （C）二重感染した培養物中の変異体およびプロトタイプウイルス間ネットウイルス増殖率の差（D）、（A）に示すようにd値は、fを計算しました（B）に示したウイルスの割合データをROM。表示される値は、一つの実験からの3つの複製の平均を表します。エラーバーは95％信頼区間を表します。

Discussion

組換えHIV-1分子クローンと成長競合アッセイの構築：提示プロトコルは、2つの主要な部分から構成されました。二重感染した細胞培養物中で2つのウイルスを区別するためには、競合分子クローンをRT-qPCRのプライマー – プローブアッセイにより、またはサンガー配列決定によって検出することができる配列タグを含むことが重要です。このプロトコルは、HIV-1 NL4-3 VIFの同じ領域を占有し、同じアミノ酸配列をコードするが、6同義突然変異によって異なるVifAとVIFBタグを利用します。これらの変異は影響を与えないことが示されました ウイルス複製のフィットネス^20。このプロトコルで使用されるPCRベースのクローニング法は、制限部位に基づくクローニングに比べ、クローニング部位を選択する際に、より柔軟性を提供します。しかし、PCRクローニングの効率は挿入サイズが増加するにつれて減少します。インサートサイズの電流制限は〜5キロバイト³⁴です。 PCRベースのクローニングおよび部位特異mutagenesi用S、高忠実度DNAポリメラーゼの使用は、追加の変異の可能性を低減するために重要です。生成物の十分な量を得るために必要なPCRサイクルの最小数を使用することも推奨されます。我々の経験では、我々はここで説明するPCRベースのクローニングおよび部位特異的突然変異誘発の工程の後、余分な突然変異を検出しませんでした。それにもかかわらず、PCR産物は、任意の望ましくない変異を確認するために配列決定されるべきです。理想的には、全体のHIVコード領域を再配列決定されるべきです。

少なくとも三つのサンプリング時点は指数増殖期⁹内で検討されるべきです。ウイルスの増殖速度は、第1の成長競争のための適切な培養期間とサンプリング時間点を決定するために、毎日のサンプリングを使用して確立されなければなりません。ウイルスの増殖速度に影響を与える要因の一つは、感染（MOI）の多重度です。それはより多くのROを得るために示されたように、このプロトコルは、単一菌感染と成長の競争の両方のために0.005の合計MOIを使用しています下のMOI ⁹よりバスト結果。それにもかかわらず、下側のMOIは、必要に応じてより長い指数増殖期を得るために使用されるが、結果の一貫性を犠牲にすることができます。このプロトコルは、ウイルスの適応度の差が予め概して未知であると仮定すると、50：50の初期感染率を示唆しています。ウイルス複製の動態に有意差を示唆する予備的なデータがある場合しかし、等しくない入力比の使用が適切です。これらのケースでは、70：30の感染率が少なくフィットウイルスが過剰⁹に配置されている大規模なフィットネス差の検出を可能にすることをお勧めします。

、ウイルスの増殖動態、及びHIV-1サブタイプBを用いた競合アッセイを最適化した成長を行うためのTCID _50を測定するためのプロトコルは、PBMCを単一のドナーからNL4-3 COTB-P24、及びPBMCをHIV-する一貫性の感受性を示しましたin vitroで 1感染。培養期間このプロトコルで提示サンプリング時点は、ヒトPBMCにおいてHIV-1 M群ウイルスを研究するために適切であると思われます。単一のソースからのPBMCを使用することは非常にウイルスの複製は、異なるドナー細胞³⁵に変化させることができるように一貫性のある結果を得ることをお勧めします。あまり望ましくないが、置換が同じプールをすべての実験全体で使用されていることを条件として、複数のドナーからプールされたPBMCを使用することができます。別の方法としては、細胞株の使用です。ここで紹介するプロトコルは、T細胞株CEMx174 ^23,36で正常に使用しました。しかし、播種した細胞の数は、一貫した細胞増殖を達成するために再最適化することが重要です。それは成長の競争段階で適切なサンプリング時点を決定するために、異なる細胞株において変化する可能性があるようにウイルスの増殖速度はまた、再確立されなければなりません。

適応度を計算するためのウイルスの比を決定するために、2つの異なる方法がprotocに含まれていますOL。最初は、各サンプリング時点でのウイルスcDNAのコピー数を測定するためにRT-定量PCRを使用しています。ウイルス複製適性は、その後のcDNAコピー数に基づいて、ウイルスの比から計算しました。あるいは、ウイルスの割合はVifABタグ部位でのクロマトグラムのピーク高さの比に基づいて決定することができます。二つの方法は、比較結果（ 図4）を得ました。クロマトグラムのピーク高方法が設計された配列タグなしで他のHIV-1株に適用することができます。 RT-qPCRを、ウイルスの変異体を区別するためのプライマーまたはプローブを使用することは最初に慎重に評価されなければならないために^（20を参照）。しかしながら、RT-qPCRのは、指数増殖期中に最初の時点からのものなどのウイルスRNAの少量のサンプルについて良好な感度を提供します。ウイルスcDNAの直接測定は、また、RNA抽出およびcDNA合成から生じ得る技術的問題を検出することができます。配列タグとの分子クローンを使用すると、費用対効果の高いソリューションを提供するTRT-qPCRの方法Oのようなプライマーおよびプローブの2つだけのペアが複数のウイルスを研究するために必要とされます。この戦略はまた、シーケンスで、ピークの高さのばらつきの問題を回避するシーケンシングが研究中のすべてのウイルスで同じサイトで行われているように、起因隣接塩基³⁷にクロマトグラム。 RT-qPCRのおよびサンガー配列決定のために生成されたPCR産物は、他の方法での使用は、個々のクローン^12,13のバルク配列決定、HTA ^4,7,17,19、またはオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ^（OLA）38のようなウイルスの比率を決定することができ。

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Construction of recombinant clones
Chimeric primer/Mutagenic/Sequencing primers	IDT	N/A	Custom DNA oligos
pNL4-3VifA and pNL4-3VifB plasmid	N/A	N/A	Please contact Dr. James I Mullins (jmullins@uw.edu)
High-Fidelity DNA polymerase	Thermo Scientific	F-549S
High-fidelity buffer	Thermo Scientific	F-549S
dNTP	Bioline	Bio-39026
Thermal cycler	Life Technologies	N/A	Applied Biosystems® GeneAmp® PCR System 9700
DNA loading dye	Thermo Scientific	R0631
1kb Plus DNA ladder	Invitrogen	10787-018
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28104
QIAquick gel extraction kit	Qiagen	28704
DpnI enzyme	New England Biolabs	R0176S
TOP10 chemically competent Escherichia coli	Invitrogen	C4040-10
Luria Broth base powder	Invitrogen	12795-084
Carbenicillin	Research Products International	C46000-25.0
QIAprep Spin Miniprep kit	Qiagen	27104
EndoFree Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12362
Transfection
X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent	Roche	6365787001
HEK 293T-17	ATCC	CRL-11268	http://www.atcc.org/
0.22um filter top tube	VWR International	89220-716
Cell culture
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Life Technologies	10566016
Iscove′s Modified Dulbecco′s Medium (IMDM)	Life Technologies	31980-030
RPMI-1640 media	Life Technologies	61870-036
Phytohemagglutinin (PHA)	Thermo Scientific	R30852801
Human Interleukin-2	Roche	11147528001
Fetal bovine serum	JR Scientific	43640
Penicillin and Streptomycin	Corning Cellgro	30-001-CI
6 well plate	VWR Scientific	73520-906
48 well plate	VWR Scientific	62407-338
96 well flat-bottomed plate	ISC Bioexpress	T-3015-4
96 well round-bottomed plate	BD Falcon	353077
1.5 ml Microcentrifuge Tube	Mt. Baker Bio	MBD-1500
1.5 mL tubes w/ O-ring	VWR Scientific	89004-290
50 mL conical tube	ISC Bioexpress	C-3317-6
ELISA
Triton-X 100	Sigma-Aldrich	X100
Phosphate buffer saline (PBS)	Invitrogen	14190-250
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F0392
glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1379
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153
Rabbit anti-HIV-1 SF2 p24 antiserum	NIH AIDS Reagent Program	4250
Goat anti-rabbit HRP	KPL	474-1516
TMB Microwell Peroxidase Substrate	KPL	52-00-01
H2SO4	Fisher Scientific	A300-500	Causes severe burns by all exposure routes. Use personal protective equipment. Use only under a chemical fume hood. Wash off immediately with plenty of water for at least 15 minutes.
HIV p24 standard	AIDS and Cancer Virus program (NCI-Frederick)	N/A	For order details please contact Julian Bess, Jr. (bessjw@mail.nih.gov); http://ncifrederick.cancer.gov/Programs/Science/Acvp/bio/Bess.aspx
Microplate reader	Molecular Devices	N/A	VMax Kinetic ELISA Microplate Reader
RNA isolation cDNA synthesis
QIAxtractor	Qiagen	N/A	http://www.qiagen.com/products/catalog/automated-solutions/sample-prep/qiaxtractor
QIAamp Viral RNA Mini Kit	Qiagen	52906
dNTP	Bioline	Bio-39026
SuperscriptIII	Invitrogen	18080-085
First-strand buffer	Invitrogen	18080-085
Dithiothreitol (DTT)	Invitrogen	18080-085
Rnase inhibitor	Roche	3335402001
RnaseH	Invitrogen	18021-071
qPCR
Real-time qPCR machine	Life Technologies	N/A	Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR
TaqMan® Gene Expression Master Mix	Life Technologies	4369016
Forward, reverse primer	IDT	N/A	Custom order
Probe	Life Technologies	N/A	Custom order
optical 96 well reaction plate	Life Technologies	I19N3Q216
PCR+sequencing
Taq DNA polymerase (Biolase)	Bioline	Bio-21043
NH4 buffer	Bioline	Bio-21043
MgCl2	Bioline	Bio-21043
Sequencing primer	IDT	N/A	Custom order
QIAxcel	Qiagen		http://www.qiagen.com/products/catalog/automated-solutions/detection-and-analysis/qiaxcel-advanced-system
DNA sequencing service provider	http://www.htseq.org/
GRC web tool	http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/grc/
ChromatQuan web tool	http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/cgi-bin/chromatquant.cgi