Growth competition between nearly isogenic viruses provides a sensitive measurement for determining relative replication fitness. The protocols described here include the construction of recombinant HIV-1 clones, virus propagation and growth competition and analysis methods optimized to yield sensitive and consistent results.
In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to extrapolate viral replication fitness, ranging from the number of viral particles per infectious unit, growth rate in cell culture, and relative fitness derived from multiple-cycle growth competition assays. Growth competition assays provide a particularly sensitive measurement of fitness since the viruses are competing for cellular targets under identical growth conditions. There are several experimental factors to consider when conducting growth competition assays, including the multiplicity of infection (MOI), sampling times, and viral detection and fitness calculation methods. Each factor can affect the end result and hence must be considered carefully during the experimental design. The protocol presented here includes steps from constructing a new recombinant HIV-1 clone to performing growth competition assays and analyzing the experimental results. This protocol utilizes experimental parameter values previously shown to yield consistent and robust results. Alternatives are discussed, as some parameters need to be adjusted according to the cell type and viruses being studied. The protocol contains two alternative viral detection methods to provide flexibility as the availability of instruments, reagents and expertise varies between laboratories.
바이러스 복제의 니스는 주어진 환경에서 한 감염성 자손을 생산하는 바이러스의 능력으로 정의하고 2 시간 이상 인구 수준에서 바이러스 변이체의 유병률을 결정하는 중요한 요인이다. 생체으로 피트니스 연구는 HIV-1과 같은 병원성 인간 바이러스, 다양한 vitro와 in와 가능하지 않은 생체 복제 피트니스 분석 약제 내성과 면역 탈출 돌연변이, 상위 성 및 진화에서 발생하는 체력에 미치는 영향을 연구하기 위해 개발되었다 바이러스 성 인구 3-6. 다른 피트니스 분석 중 성장 경쟁 분석은 생체 -1,7,8,8- 발생으로 두 개 이상의 바이러스 변종, 정확하게 동일한 환경 조건 하에서 동일한 세포 인구를위한 경쟁으로, 피트니스 차이에 더 민감하고 유효한 조치를 얻을에 인식하고 있습니다. 성장 경쟁 실험을 시작, 여러 variab 전레 감염의 다양한 다중성 (MOI), 바이러스의 입력 비율 및 분석을위한 샘플링 타이밍의 사용을 포함하여 결정되어야한다. 우리는 바이러스 성 성장 속도론에 경쟁 실험의 결과에 이러한 매개 변수의 효과를 공부하고, 세포 배양 9 HIV-1의 적합성에 강력한 측정에 필요한 핵심 요소를 확인했다.
분석 변수 외에도, 성장 경쟁 실험에서 바이러스 변이체를 정량을위한 다양한 방법이있다. 10,11 또는 벌크 클론 시퀀싱 12,13은 관심 부위 (들)에서 뉴클레오티드 주파수에 기초하여 상기 경쟁 바이러스의 비율을 결정하기 위해 사용되어왔다. 상대 체력은 시간이 지남에 따라이 비율의 변화에서 파생됩니다. DNA 시퀀싱 서비스를 광범위하게 사용할 수있는이 방법은 편리하다. 병렬 대립 유전자 특정 염기 서열 (PASS) 방법은 여러 사이트에서 시퀀싱 및 재조합 (14)의 검출을 가능하게 </sup>뿐만 아니라 특별히 개발 시약 및 탐지 시스템을 필요로한다. 본질적으로,이 방법은 관심 영역의 뉴클레오티드 차이의 소수의 바이러스 균주를 개발하기 위해 연구 하였다. 다른 방법은 작은 리포터 유전자를 시퀀싱하여 경쟁 바이러스 heteroduplex를 추적 분석 (HTA) 4,7,17,19 구별 또는 전사 정량 실시간 중합 효소 연쇄 반응을 반대로 태그 15 또는 돌연변이 4,16-18 동의어를 사용 에 관계없이 서열 유사성의 균주 경쟁 연구에 적용 할 수 모두 (RT-qPCR에) 15,16,18,20. 추가 단계는 바이러스의 게놈에 태그를 도입하는 데 필요한 및 RT-qPCR에 분석은 특정 시약 및 장비를 필요로한다. 발명자들은 대량 생거 시퀀싱 수익률 비교 결과 (9).
성장 경쟁에 이어, 바이러스 복제 피트니스는 상대의 적합성, 또는 T 사이의 피트니스 비율로 제공됩니다바이러스 변종 하시다. 바이러스의 상대적인 니스는 접종의 초기 비율에 의해 또는 두 바이러스 간의 경쟁 순 성장 속도 차이로 규격화 바이러스 변이체의 최종 비율로 정의 할 수있다. 우리는 후자의 방법은, 단지 지수 성장기 내에 길이 데이터 포인트를 이용하여, 가장 견고한 결과 9,20 생산하였습니다.
체외에서 피트니스 분석은 생물학적 클론 6-8과 HIV-1 감염 분자 클론을 연구하기 위해 주로 사용된다. 후자는, 유전자 조작 의무가되고, 종종 특정 돌연변이 또는 관심 3-5,21,22의 특정 시퀀스에서 체력에 미치는 영향을 연구하기 위해 사용된다. 다음 프로토콜은 바이러스 성 성장 속도론을, 일련의 태그를 포함하는 HIV-1 벡터를 사용하여 새로운 전체 길이 감염성 HIV-1 분자 클론을 구성하는 관심의 돌연변이를 도입, 바이러스 성 주식을 만들고 구축의 관점에서 워크 플로를 설명상대 체력을 성장 경쟁 분석을 수행하고 계산하는 (그림 1).
우리의 최적화 된 절차를 사용하여, 우리는 세 가지 재조합 HIV-1 돌연변이를 만들어 자신의 복제 체력을 결정했다. 재조합 분자 복제가 먼저 합성 COTB (센터 외과, pNL4-3, HIV-1 실험실 변형 NL4-3의 전체 길이 감염 유전자를 포함하는 플라스미드의 HIV-1 개그-P24 유전자 영역을 대체하여 건설되었다 나무, 서브 타입 B) 개그-P24 시퀀스 (23)는 프로토 타입의 변형을 만들 수 있습니다. 단일 아미노산 변경 (T186M은 T242N 및 I256V는) 다음 세 가지 돌연변이 클론을 생성하기 위해 도입되었다. 각각의 돌연변이는 주어진 유전 적 배경에서 각 돌연변이의 체력에 미치는 영향을 관찰하기 위해 프로토 타입 바이러스에 대해 경쟁했다. 세 가지 돌연변이 프로토 타입 바이러스보다 약간 크게 낮은에서 복제 fsitness 다양한 수준의 보여 주었다. T242N 돌연변이는 이전에 적당한 fitne이보고되었다SS는이 연구에 나타낸 결과와 유사한 24-26, 비용. 다른 두 변이의 피트니스 비용은 이전에보고되지 않았다.
재조합 HIV-1 분자 클론 및 성장 경쟁 분석의 건설 : 제시된 프로토콜은 두 가지 주요 부분으로 구성되어있다. 이중 감염된 세포 배양 물에서 두 바이러스와 구별하기 위해, 경쟁 분자 클론을 RT-qPCR에 프라이머 – 프로브 분석으로 또는 생거 시퀀싱에 의해 검출 될 수있는 서열 태그를 포함하는 것이 중요하다. 이 프로토콜은 HIV-1의 NL4-3 VIF 동일한 영역을 점유하고 동일한 아미노산 서열을 인코딩하지만 여섯 동의어 돌연변이 차이 VIFA 및 VIFB 태그를 사용한다. 이러한 돌연변이는 영향을주지 나타냈다 바이러스 복제의 적합성 (20). 이 프로토콜에서 사용하는 PCR 계 클로닝 방법은 제한 부위 기반 복제에 비해 클로닝 사이트를 선택하는데 더 많은 유연성을 제공한다. 그러나, PCR 클로닝의 효율은 인서트의 크기가 증가함에 따라 감소한다. 인서트 크기의 전류 제한은 ~ 5킬로바이트 (34)이다. PCR 기반의 복제 및 사이트 감독 mutagenesi 들어S, 고 충실도 DNA 중합 효소의 사용은 추가적인 돌연변이 가능성을 줄이기 위해 매우 중요하다. 제품의 충분한 양을 산출하기 위해 필요한 PCR 사이클의 최소 수의 사용은 권장된다. 우리의 경험에서, 우리는 여기에 설명 된 PCR 기반의 복제 및 부위 특이 적 변이 단계 후 여분의 돌연변이를 검출하지 않았다. 그럼에도 불구하고 PCR 제품은 원치 않는 돌연변이를 확인하기 위해 서열화한다. 이상적으로, 전체 HIV 코딩 영역을 resequenced해야합니다.
적어도 세 개의 샘플링 시점은 지수 적 성장 단계 9에서 검토되어야한다. 바이러스의 성장 동역학을 먼저 성장 경쟁을위한 적절한 배양 시간 및 샘플링 시간의 포인트를 결정하기 위해 매일 샘플링을 사용하여 설정되어야한다. 바이러스 성 성장 반응 속도에 영향을 미치는 하나의 요인은 감염 (MOI)의 다양성이다. 그것은 더 RO을 수득 하였다 나타낸 바와 같이이 프로토콜은, monoinfection 성장 경쟁 모두 0.005 총 MOI를 사용낮은 MOIs 9보다 흉상 결과. 그럼에도 불구하고, 낮은 MOIs 필요하다면 장기간의 지수 성장기를 얻기 위해 사용되지만, 결과의 일관성을 희생 할 수있다. 이 프로토콜은 바이러스의 체력 차이가 미리 일반적으로 알려지지 않은 것으로 가정하여, 50:50의 초기 감염 비율을 의미한다. 바이러스 복제 속도론에 상당한 차이점을 시사 예비 데이터가있는 경우에는, 동일하지 않은 입력 비율의 사용이 적합하다. 이러한 경우에는, 70:30의 비율은 감염 바이러스가 덜 맞는 초과 9에 배치 큰 차이 니스의 검출을 허용하도록 권장한다.
바이러스 성장 속도론 및 HIV-1 서브 타입 B를 사용하여 경쟁 분석 최적화 된 성장을 수행하기위한 TCID 50을 결정하기위한 프로토콜은, PBMC를 하나의 기증자로부터 NL4-3 COTB-P24 및 PBMC를이 HIV-하는 일관된 감수성을 증명하고있다 체외에서 1 감염. 배양 기간이 프로토콜에서 제공 샘플링 시점에 인간 PBMC를 HIV-1 바이러스 M 군을 연구에 적합한 것으로 보인다. 단일 소스에서 PBMC를 사용하는 것은 매우 바이러스 복제가 다른 공여 세포 (35)에 따라 다릅니다 수있는 일관성있는 결과를 얻을 것을 권장합니다. 교체는 동일한 풀 모든 실험에 걸쳐 사용되는 것을 규정 덜 바람직하지만, 복수의 공여체로부터 풀링 된 PBMC를 사용할 수있다. 또 다른 대안은 세포주의 사용이다. 여기에 제시된 프로토콜 T 세포주 CEMx174 23,36 성공적으로 사용되었다. 그러나, 세포의 파종 번호 재 최적화 일관된 세포 성장을 달성하는 것이 중요하다. 그것이 성장 경쟁 단계에 적절한 샘플링 시점을 결정하기 위해, 상이한 세포주에서 다를 가능성이 바이러스 성 성장 동역학은 또한 재 확립되어야한다.
체력을 계산하는 바이러스 성 비율을 결정하는 두 가지 방법이 protoc에 포함되어 있습니다OL. 첫째는 각 샘플링 시점에서 바이러스의 cDNA 카피 수를 측정하기 위해 RT-qPCR에 사용. 바이러스 복제 적당이어서 cDNA의 사본 번호에 기초하여, 바이러스의 비로부터 계산 하였다. 대안으로, 바이러스 성 비 VifAB 태그 사이트의 크로마토 그램의 피크 높이의 비율에 기초하여 결정될 수있다. 두 가지 방법이 유사한 결과 (도 4)을 수득 하였다. 크로마토 그램의 피크 높이 방법은 서열 태그 조작없이 다른 HIV-1 균주에 적용될 수있다. RT-qPCR의 바이러스 변이체를 구별하기위한 프라이머 또는 프로브의 사용은 제 신중하게 평가되어야 들어 (20 참조). 그럼에도 불구하고, RT-qPCR에 같은 지수 성장기 내의 제 시점에서 그와 같은 바이러스 성 RNA의 소량의 샘플과 더 나은 민감도를 제공한다. 바이러스 cDNA를 직접 측정은 또한 RNA 추출 및 cDNA 합성에서 발생할 수있는 기술적 인 문제를 감지 할 수 있습니다. 서열 태그 분자 클론을 사용하는 것은 비용 효율적인 솔루션을 제공 tRT-qPCR에 방법 O를, 같은 프라이머 및 프로브의 두 쌍은 여러 바이러스를 연구하기 위해 필요하다. 이 전략은 또한 시퀀싱이 연구에서 모든 바이러스에서 동일한 사이트에서 수행되는 것처럼 순서로 피크 높이 변화의 문제, 이웃 기지 (37)에 의한 크로마토 그램 방지 할 수 있습니다. RT-qPCR에와 생거 시퀀싱 생성 된 PCR 제품은 다른 방법과 함께 사용은 개별 클론 12, 13의 대량 순서, HTA 4,7,17,19, 또는 올리고 뉴클레오티드 결찰 분석 (OLA) (38) 바이러스 성 비율을 결정하기 위해 할 수 있습니다 .
The authors have nothing to disclose.
These studies were funded by US Public Health Services grants P01AI057005, R01AI047734, R01AI111806 and the Functional Profiling and Computational Biology Core of the University of Washington’s Center for AIDS Research (P30 AI027757).
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Construction of recombinant clones | |||
Chimeric primer/Mutagenic/Sequencing primers | IDT | N/A | Custom DNA oligos |
pNL4-3VifA and pNL4-3VifB plasmid | N/A | N/A | Please contact Dr. James I Mullins (jmullins@uw.edu) |
High-Fidelity DNA polymerase | Thermo Scientific | F-549S | |
High-fidelity buffer | Thermo Scientific | F-549S | |
dNTP | Bioline | Bio-39026 | |
Thermal cycler | Life Technologies | N/A | Applied Biosystems® GeneAmp® PCR System 9700 |
DNA loading dye | Thermo Scientific | R0631 | |
1kb Plus DNA ladder | Invitrogen | 10787-018 | |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
QIAquick gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
DpnI enzyme | New England Biolabs | R0176S | |
TOP10 chemically competent Escherichia coli | Invitrogen | C4040-10 | |
Luria Broth base powder | Invitrogen | 12795-084 | |
Carbenicillin | Research Products International | C46000-25.0 | |
QIAprep Spin Miniprep kit | Qiagen | 27104 | |
EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
Transfection | |||
X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent | Roche | 6365787001 | |
HEK 293T-17 | ATCC | CRL-11268 | http://www.atcc.org/ |
0.22um filter top tube | VWR International | 89220-716 | |
Cell culture | |||
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 10566016 | |
Iscove′s Modified Dulbecco′s Medium (IMDM) | Life Technologies | 31980-030 | |
RPMI-1640 media | Life Technologies | 61870-036 | |
Phytohemagglutinin (PHA) | Thermo Scientific | R30852801 | |
Human Interleukin-2 | Roche | 11147528001 | |
Fetal bovine serum | JR Scientific | 43640 | |
Penicillin and Streptomycin | Corning Cellgro | 30-001-CI | |
6 well plate | VWR Scientific | 73520-906 | |
48 well plate | VWR Scientific | 62407-338 | |
96 well flat-bottomed plate | ISC Bioexpress | T-3015-4 | |
96 well round-bottomed plate | BD Falcon | 353077 | |
1.5 ml Microcentrifuge Tube | Mt. Baker Bio | MBD-1500 | |
1.5 mL tubes w/ O-ring | VWR Scientific | 89004-290 | |
50 mL conical tube | ISC Bioexpress | C-3317-6 | |
ELISA | |||
Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
Phosphate buffer saline (PBS) | Invitrogen | 14190-250 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F0392 | |
glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
Rabbit anti-HIV-1 SF2 p24 antiserum | NIH AIDS Reagent Program | 4250 | |
Goat anti-rabbit HRP | KPL | 474-1516 | |
TMB Microwell Peroxidase Substrate | KPL | 52-00-01 | |
H2SO4 | Fisher Scientific | A300-500 | Causes severe burns by all exposure routes. Use personal protective equipment. Use only under a chemical fume hood. Wash off immediately with plenty of water for at least 15 minutes. |
HIV p24 standard | AIDS and Cancer Virus program (NCI-Frederick) | N/A | For order details please contact Julian Bess, Jr. (bessjw@mail.nih.gov); http://ncifrederick.cancer.gov/Programs/Science/Acvp/bio/Bess.aspx |
Microplate reader | Molecular Devices | N/A | VMax Kinetic ELISA Microplate Reader |
RNA isolation cDNA synthesis | |||
QIAxtractor | Qiagen | N/A | http://www.qiagen.com/products/catalog/automated-solutions/sample-prep/qiaxtractor |
QIAamp Viral RNA Mini Kit | Qiagen | 52906 | |
dNTP | Bioline | Bio-39026 | |
SuperscriptIII | Invitrogen | 18080-085 | |
First-strand buffer | Invitrogen | 18080-085 | |
Dithiothreitol (DTT) | Invitrogen | 18080-085 | |
Rnase inhibitor | Roche | 3335402001 | |
RnaseH | Invitrogen | 18021-071 | |
qPCR | |||
Real-time qPCR machine | Life Technologies | N/A | Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR |
TaqMan® Gene Expression Master Mix | Life Technologies | 4369016 | |
Forward, reverse primer | IDT | N/A | Custom order |
Probe | Life Technologies | N/A | Custom order |
optical 96 well reaction plate | Life Technologies | I19N3Q216 | |
PCR+sequencing | |||
Taq DNA polymerase (Biolase) | Bioline | Bio-21043 | |
NH4 buffer | Bioline | Bio-21043 | |
MgCl2 | Bioline | Bio-21043 | |
Sequencing primer | IDT | N/A | Custom order |
QIAxcel | Qiagen | http://www.qiagen.com/products/catalog/automated-solutions/detection-and-analysis/qiaxcel-advanced-system | |
DNA sequencing service provider | http://www.htseq.org/ | ||
GRC web tool | http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/grc/ | ||
ChromatQuan web tool | http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/cgi-bin/chromatquant.cgi |