Summary
यहाँ हम में मौजूद जैव-कणों के संग्रह के लिए एक अनुकूलित और कुशल हटाने की रणनीति का वर्णन एक एक कदम 5 μl सूक्ष्म मात्रा सेल / एसटीआर प्रवर्धन से जुड़े एक बढ़ाया प्रवर्धन प्रोटोकॉल के साथ एक साथ, नमूने 'डीएनए' स्पर्श, की वसूली की अनुमति के लिए कम मिलकर दोहराएँ (एसटीआर) जैव-कण दाता (एस) के प्रोफाइल।
Abstract
डीएनए प्रोफाइल मानव जैविक सामग्री का सूक्ष्म निशान शामिल हैं जो 'स्पर्श डीएनए' सबूत, से प्राप्त किया जा सकता है। ट्रेस डीएनए रोजगार कपास swabs या चिपकने वाला टेप की वसूली के लिए मौजूदा तरीकों को ब्याज की एक क्षेत्र नमूना करने के लिए। हालांकि, इस तरह के एक 'अंधा-swabbing' दृष्टिकोण सह-नमूना होगा सेलुलर सामग्री विभिन्न व्यक्तियों से, 'व्यक्तियों की कोशिकाओं आइटम पर भौगोलिक दृष्टि से अलग स्थानों में स्थित हैं, भले ही। इस प्रकार, स्पर्श डीएनए नमूनों में आई डीएनए मिश्रण के कुछ कृत्रिम रूप से खुद को swabbing द्वारा बनाई गई हैं। कुछ उदाहरणों में, एक शिकार के डीएनए इस प्रकार किसी भी संभावित अपराधी के डीएनए मास्किंग महत्वपूर्ण अतिरिक्त में पाया जा सकता है।
मानक वसूली और विश्लेषण के तरीकों के साथ चुनौतियों को दरकिनार करने के लिए, हम संपर्क डीएनए सबूत की बढ़ी आनुवांशिक विश्लेषण में यह परिणाम है कि एक कम लागत, 'स्मार्ट विश्लेषण' विधि विकसित किया है। हम एक अनुकूलित एक वर्णनस्पर्श डीएनए नमूनों में मौजूद जैव-कणों का संग्रह है, साथ ही जैव-कण दाता से एसटीआर प्रोफाइल के वसूली की अनुमति के लिए एक एक कदम 5 μl microvolume सेल / एसटीआर प्रवर्धन से जुड़े एक बढ़ाया प्रवर्धन की रणनीति के लिए डी कुशल micromanipulation वसूली की रणनीति (एस)। का उपयोग व्यक्ति या कुछ (यानी, "गुच्छों") एकल स्रोत प्रोफाइल को प्राप्त करने की क्षमता में bioparticles का परिणाम है। इन प्रक्रियाओं के अलगाव और फॉरेंसिक स्पर्श डीएनए साक्ष्य से ही bioparticles के विश्लेषण के लिए वैकल्पिक बढ़ाया तकनीक का प्रतिनिधित्व करते हैं। हर फोरेंसिक जांच में आवश्यक नहीं है, जबकि विधि मानक विश्लेषण तकनीक का उपयोग संभव नहीं हो सकता है कि शारीरिक हमला (जैसे, गला घोंटने) से जुड़े मामलों में एक ही स्रोत अपराधी डीएनए प्रोफाइल की वसूली के लिए अत्यधिक लाभकारी हो सकता है। साथ ही, यहां विकसित की रणनीतियों ओ की एक किस्म से एकल कोशिका के स्तर पर आनुवंशिक जानकारी प्राप्त करने के लिए एक अवसर प्रदान करते हैंवहाँ गैर फोरेंसिक ट्रेस जैविक सामग्री।
Introduction
टच डीएनए सेलुलर सामग्री का सीधा हस्तांतरण है जो ट्रेस जैविक सबूत का एक रूप है शारीरिक संपर्क एक के दौरान एक वस्तु या किसी अन्य व्यक्ति के लिए एक व्यक्ति से (उदाहरण के लिए, त्वचा कोशिकाओं शेड)। छुआ वस्तुओं की एक किस्म से डीएनए प्रोफाइल प्राप्त करने की क्षमता (दस्तावेजों, बिस्तर, जूते, आग्नेयास्त्रों, पीने के कंटेनर, कलम, अटैची संभालती है) साहित्य 2-9 की रिपोर्ट में किया गया है।
स्पर्श डीएनए साक्ष्य का विश्लेषण में एक महत्वपूर्ण कारक ट्रेस जैविक सामग्री वर्तमान के सफल वसूली है। डीएनए सबूत आम तौर पर एक बाँझ कपास झाड़ू के साथ संदिग्ध क्षेत्र swabbing द्वारा एकत्र की है स्पर्श ("अंधा-swabbing" के रूप में करने के लिए कहा गया है)। इस दृष्टिकोण का प्रयोग, एकत्र जैविक सामग्री की प्रकृति ज्ञात नहीं है और एक सामान्यीकृत क्षेत्र के नमूने किया जाता है। सतह खांचे या दरारों की उपस्थिति द्वि की अक्सर पहले से ही छोटी राशि के सफल वसूली में बाधा हो सकतीological सामग्री मौजूद है। इसके अतिरिक्त, एक 'अंधा-swabbing' दृष्टिकोण होगा जिसका कोशिकाओं मद पर मौजूद हैं, 'व्यक्तियों की कोशिकाओं आइटम पर स्थानिक अलग स्थानों में स्थित हैं, भले ही अलग-अलग व्यक्तियों से जरूरी सह नमूना सेलुलर सामग्री। अक्सर कम टेम्पलेट डीएनए नमूनों के साथ विशेष रूप से हल करने के लिए चुनौती दे रहे हैं जो admixed डीएनए प्रोफाइल की वसूली, अक्सर 8,10,11 मनाया जाता है और कई मामलों में swabbing प्रक्रिया का ही एक परिणामी विरूपण साक्ष्य हो जाएगा। सामग्री का केवल एक छोटी राशि दानदाताओं में से एक से मौजूद था, तो मानक निष्कर्षण और विश्लेषण तकनीक नाबालिग योगदानकर्ता से एक प्रोफाइल को ठीक करने में विफल हो सकता है। इसके अतिरिक्त, यह सूखा या गीला इस्तेमाल किया गया था या झाड़ू के प्रकार के कारण निगलने को योग्यता और adsorptivity और जैविक सामग्री 12 की रिहाई की दक्षता में अंतर करने के लिए एकत्र किया जाता है कि जैविक पदार्थ की मात्रा को प्रभावित कर सकते हैं (बाँझ पानी के साथ पहले से सिक्त)। एसtandard निकासी तरीकों की वजह से नमूना या नमूना हस्तांतरण चरणों के लिए आवश्यक शारीरिक हेरफेर करने के लिए अतिरिक्त नमूना हानि हो सकती है।
ऊपर वर्णित है, जैविक सामग्री की वसूली के लिए सरल swabbing तकनीक की वजह से अलग-अलग जैविक घटकों को अलग करने के लिए एक विफलता के लिए जैविक नमूने के रूप में अच्छी तरह से admixed प्रोफाइल के एक वृद्धि की घटना की मात्रा का पता लगाने के नुकसान में परिणाम हो सकता है। इसलिए, हम छुआ वस्तुओं पर मौजूद सेलुलर microparticles के संग्रह के लिए अधिक चयनात्मक और कुशल वसूली रणनीति विकसित करने की मांग की। स्पर्श डीएनए सबूत से जैविक सामग्री के विश्लेषण के लिए विकसित की रणनीति (कारण त्वचा की बाहरी एपिडर्मल परत में पाया कोशिकाओं के बहुमत या मर मर कर रहे हैं के बाद से एक नाभिक हमेशा दिखाई नहीं देता है तथ्य यह है कि "bioparticles" यहाँ के रूप में करने के लिए भेजा जेल फिल्म fr के माध्यम से जैविक सामग्री (यानी, bioparticles) की 1) संग्रह: निम्न) 13 केरेटिनकोशिकाओं शामिलओम एक पानी में घुलनशील चिपकने का उपयोग की वस्तुओं और सतहों, पहना कपड़े आइटम या सीधे मानव त्वचा, संभावित मानव जैविक सामग्री का संग्रह करने के लिए सुनिश्चित बरामद जैविक सामग्री का 2) सूक्ष्म परीक्षण, और एक या कुछ जैव-कणों की 3) micromanipulation छुआ, और एक microvolume (5 μl) एक कदम सेल / प्रवर्धन प्रतिक्रिया का उपयोग कर एकत्र जैव-कणों की 4) ऑटोसोमल डीएनए एसटीआर रूपरेखा।
यह प्रक्रिया पारंपरिक रूप से इस्तेमाल विश्लेषण के तरीकों पर कई लाभ प्रदान करता है। जेल का उपयोग कर फिल्म bioparticles की रिकवरी विश्लेषण करने से पहले नमूने में जैविक सामग्री वर्तमान की एक सूक्ष्म परीक्षा परमिट। स्पर्श डीएनए सबूत से बरामद bioparticles के बहुमत एकल कोशिकाओं इसे और अधिक कठिन या जैव-कणों का चयन किया जाना चाहिए कि कितने, विश्लेषण अवसर के लिए प्रदान करने से पहले इन नमूनों की सूक्ष्म परीक्षा केन्द्रक की कोशिकाओं के लिए खोज करने के लिए जो निर्धारित करने के लिए कर रही है नहीं हो सकता है इस प्रकार maximizडीएनए प्रोफ़ाइल वसूली की संभावना आईएनजी। पानी में घुलनशील चिपकने की सहायता micromanipulation का उपयोग कर bioparticles का संग्रह प्रतिक्रिया ट्यूबों में लक्षित bioparticles के प्रत्यक्ष हस्तांतरण परमिट। यह प्रक्रिया जैविक सामग्री का सफल हस्तांतरण सुनिश्चित करने के लिए खुर्दबीन के नीचे कल्पना की है। नमूना प्रति विश्लेषण की लागत को कम करते हुए कम या microvolume प्रतिक्रिया संवेदनशीलता बढ़ जाती है। इस सबूत के एक व्यक्ति के टुकड़े से नमूनों की बढ़ी संख्या के विश्लेषण परमिट। कारण स्पर्श डीएनए साक्ष्य के रूप में जैव-कणों की आनुवंशिक राज्य में श्रृंखला के लिए, अलग-अलग आइटम से कई samplings सिफारिश कर रहे हैं।
यहाँ, हम स्पर्श डीएनए साक्ष्य के रूप में जैविक सामग्री का दाताओं की अत्यधिक प्रमाण आनुवंशिक प्रोफाइल प्राप्त करने के लिए विकसित प्रोटोकॉल का सफल प्रयोग प्रदर्शित करता है। विकसित bioparticle संग्रह और डीएनए प्रोफाइलिंग के तरीकों के लिए एक व्यापक 'स्मार्ट' (यानी, विशिष्ट, मध्यम श्रेणी, आटा उपलब्ध करानेलक्षण वर्णन, विश्लेषण और ट्रेस जैविक सामग्री की व्याख्या करने के लिए, inable यथार्थवादी और समय पर) आणविक आधारित दृष्टिकोण। मूल रूप से स्पर्श डीएनए सबूत के फोरेंसिक विश्लेषण के लिए आवेदन के लिए विकसित की है, जबकि यहां विकसित की रणनीतियों जैविक सामग्री के अन्य स्रोतों के लिए आवेदन किया है और एकल कोशिका के स्तर पर व्यक्तिगत पहचान की जानकारी प्राप्त करने के लिए एक अवसर प्रदान करते जा सकता है।
Protocol
नोट: शरीर के तरल पदार्थ सेंट्रल फ्लोरिडा के संस्थागत समीक्षा बोर्ड के विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित प्रक्रियाओं का उपयोग स्वयंसेवकों से एकत्र किए गए थे। जानकार लिखित सहमति के प्रत्येक दाता से प्राप्त हुई थी।
छुआ वस्तुओं और सतहों से Bioparticles 1. संग्रह
- इच्छित आकार को जेल फिल्म में कटौती। यह ठोस समर्थन के रूप में इस्तेमाल किया जा रहा गिलास खुर्दबीन स्लाइड के लिए उपयुक्त आकार है कि सुनिश्चित करें। उदाहरण के लिए, एक 3 "एक्स 1" गिलास स्लाइड के लिए, 2 "एक्स 0.75" की एक जेल फिल्म आकार का उपयोग करें।
नोट: लंबाई और सामग्री की चौड़ाई अगर वांछित, कम किया जा सकता है, लेकिन इस आकार से अधिक नहीं होना चाहिए। - जेल फिल्म से सफेद समर्थन निकालें और माइक्रोस्कोप स्लाइड (चित्रा 1 ए) के लिए जेल फिल्म देते हैं। एक पूरा लगाव सुनिश्चित करने के लिए मजबूती से नीचे दबाएँ।
नोट: दबाव जेल-फिल का टुकड़ा के साथ लागू करने के लिए अनुमति देने के लिए नहीं हटाया जाना चाहिए कि एक स्पष्ट शीर्ष सुरक्षात्मक परत हैजेल फिल्म सतह contaminating के बिना मी। जब तक जरूरत (संलग्न सुरक्षात्मक परत के साथ) तैयार जेल फिल्म स्लाइड कमरे के तापमान पर संग्रहित किया जा सकता है। - तैयार (चित्रा 1 बी) जेल फिल्म नमूना उपयोग करने के लिए जब बाँझ चिमटी का उपयोग कर जेल फिल्म से स्पष्ट शीर्ष सुरक्षात्मक फिल्म निकालें। वांछित छुआ वस्तु या सतह (चित्रा 2) के साथ सीधे संपर्क में जेल फिल्म सतह रखें। जेल फिल्म के लिए जैव-कणों की कुशल हस्तांतरण सुनिश्चित करने के लिए दबाव की एक छोटी राशि लागू करें।
नोट: बहुत अधिक दबाव लागू किया जाता है, तो गिलास स्लाइड तोड़ सकता है।
नोट: एक ही वस्तु या सतह से एकाधिक samplings जेल फिल्म के एक ही टुकड़े पर एकत्र किया जा सकता है। - एक stereomicroscope पर स्लाइड रखकर (चित्रा 3) जेल फिल्म पर जैव-कणों के स्थानांतरण की पुष्टि (पार या महामारी रोशनी में इस्तेमाल किया जा सकता है)। सबसे अच्छा VI के लिए ~ 200X का प्रयोग जेल फिल्म का सबसे अच्छा देखने के बड़े क्षेत्रों के लिए ~ 20X की बढ़ाई, और बढ़ाईEwing व्यक्ति जैव-कण।
- एक कवर स्लाइड बॉक्स में कमरे के तापमान पर जेल फिल्म नमूना स्लाइड दुकान या और / या जैव-कण संग्रह धुंधला करने के लिए तुरंत उपयोग करें।
दृश्य में सहायता करने के लिए Bioparticles की 2. वैकल्पिक धुंधला
- एक सिंक के ऊपर एक स्लाइड धुंधला रैक पर चरण 1 में तैयार जेल फिल्म नमूना स्लाइड रखें।
- एक डिस्पोजेबल हस्तांतरण pipet का प्रयोग, trypan नीले दाग (चित्रा -4 ए) के साथ पूरे जेल फिल्म की सतह को कवर किया। 1-2 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।
- दाग सिंक (4B चित्रा) में बंद पलायन करने की अनुमति देने के लिए स्लाइड झुकने से अतिरिक्त दाग निकालें।
नोट: (चित्रा 4C) अगर जरूरत स्लाइड एक डिस्पोजेबल हस्तांतरण pipet का उपयोग बाँझ पानी के साथ कोमल बाढ़ से rinsed जा सकता है। - जैव-कणों के अलगाव के लिए आगे बढ़ने से पहले शुष्क हवा की स्लाइड की अनुमति दें। वी ~ एक समग्र देखने के लिए stereomicroscope (~ 20X और का उपयोग कर 200-300X स्लाइड देखेंiew व्यक्ति bioparticles) उचित धुंधला (चित्रा 4D-ई) सुनिश्चित करने के लिए।
नोट: स्लाइड एक कवर स्लाइड बॉक्स में कमरे के तापमान पर संग्रहित किया जा सकता है।
विश्लेषण के लिए ब्याज की Bioparticles 3. अलगाव
- एक रैक में 0.2 मिलीलीटर पीसीआर ट्यूब की उपयुक्त संख्या प्लेस और उचित ट्यूबों लेबल।
- एक नामित पीसीआर प्रवर्धन हुड या जैव सुरक्षा कैबिनेट में एसटीआर प्रवर्धन मिश्रण (माल की सूची देखें) तैयार करें। भंवर मास्टर मिश्रण अच्छी तरह से और संक्षेप में एक मिनी अपकेंद्रित्र में अपकेंद्रित्र।
- नमूना प्रति जरूरत प्रवर्धन मिश्रण की मात्रा 3.5 μl है; नमूनों की वांछित संख्या के लिए मास्टर मिश्रण का एक उचित मात्रा तैयार करते हैं।
- प्रत्येक 0.2 मिलीलीटर ट्यूब में प्रवर्धन मिश्रण के pipet 3.5 μl। शिथिल प्रत्येक ट्यूब टोपी।
- एक साफ कांच खुर्दबीन स्लाइड पर या सीधे एक गिलास ब्लॉक पर डबल स्टिक टेप का एक टुकड़ा रखें।
नोट: यह पकड़ करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगानमूना संग्रह के दौरान जगह में 0.2 मिलीलीटर ट्यूब। - एक साफ कांच खुर्दबीन स्लाइड पर डबल स्टिक टेप का एक टुकड़ा रखें। डबल स्टिक टेप के शीर्ष पर पानी में घुलनशील लहर मिलाप टेप का एक टुकड़ा रखें।
नोट: इस स्लाइड भविष्य में उपयोग के लिए एक desiccator में संग्रहित किया जा सकता है। - 3.4 कदम में तैयार डबल स्टिक टेप स्लाइड या ब्लॉक पर पहले 0.2 मिलीलीटर ट्यूब रखें। नमूना एकत्र किया जाता है जब तक एक तरफ इस ट्यूब सेट करें।
- माइक्रोस्कोप (कम बढ़ाई) के तहत पानी में घुलनशील लहर मिलाप टेप स्लाइड रखें। एक टंगस्टन सुई की नोक का प्रयोग, धीरे से एक छोटी राशि (या "गेंद") सुई (चित्रा 5A) के अंत में चिपकने के इकट्ठा करने के क्रम में टेप की सतह परिमार्जन।
नोट: गेंद के आकार एकत्र किया जाएगा कि bioparticles की संख्या के आधार पर छोटे या बड़े बनाया जा सकता है। - ध्यान से सुई की नोक परेशान बिना माइक्रोस्कोप के नीचे से चिपकने के साथ टंगस्टन सुई को हटा दें। सुई कर सकते हैंनमूना प्लेसमेंट के दौरान अगर वांछित एक रैक में जगह हो।
- खुर्दबीन मंच पर तैयार जेल-फिल्म (चरण 1 से और 2) नमूना रखें। Bioparticles आसानी से देखा जा सकता है जब तक ध्यान और बढ़ाई समायोजित करें। एकत्र किया जाएगा कि जैव-कणों को पहचानें।
ध्यान दें: एक गिलास ब्लॉक अगर जरूरत स्लाइड समर्थन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। - चिपकने वाली गेंद के साथ टंगस्टन सुई निकालते हैं, और ब्याज की जैव-कणों स्थित हैं जहां जेल फिल्म सतह पर सुई जगह है। यह जैव-कण (चित्रा 5 ब) के साथ संपर्क में है कि इतना नीचे (चिपकने के साथ) सुई की नोक दबाएँ। जैव-कण एकत्र किया गया है कि यह सुनिश्चित करने के लिए सुई उठा। जैव-कणों की वांछित संख्या एकत्र किया गया है, जब तक इस प्रक्रिया को दोहराएं।
- खुर्दबीन मंच पर तैयार 0.2 मिलीलीटर पीसीआर ट्यूब रखें। प्रवर्धन मिश्रण युक्त ट्यूब के नीचे ध्यान में है कि इतनी बढ़ाई समायोजित करें।
- ध्यान से टंगस्टन needl डालनेसुई की नोक तक 0.2 मिलीलीटर पीसीआर ट्यूब में ई प्रवर्धन मिश्रण में है।
नोट: माइक्रोस्कोप के माध्यम से देखते हुए यह सबसे अच्छा प्रदर्शन किया है। - चिपकने वाला घुल और bioparticles समाधान (चित्रा 5C) में जारी किए हैं, जब तक प्रवर्धन मिश्रण में सुई पकड़ो। , सुई निकालें ईमानदार 0.2 मिलीलीटर जगह है और शिथिल ट्यूब टोपी।
- अतिरिक्त नमूने के लिए संग्रह की प्रक्रिया को दोहराएं। नमूने के बीच में पोंछे पूर्व सिक्त शराब (isopropanol) के साथ टंगस्टन सुई साफ करें।
4. संयुक्त Microvolume न्यूक्लिक एसिड अलगाव (डायरेक्ट Lysis) और Autosomal लघु मिलकर दोहराएँ (एसटीआर) प्रोफाइलिंग
- एक नामित पीसीआर प्रवर्धन हुड या जैव सुरक्षा कैबिनेट में lysis बफर (सामग्री देखें) तैयार करें। एक 5 μl कुल प्रतिक्रिया मात्रा के लिए प्रत्येक ट्यूब lysis बफर के 1.5 μl जोड़ें। कसकर बंद ट्यूब पलकों।
नोट: 0.2 मिलीलीटर ट्यूब पहले से ही 3.5 μl होते हैंप्रवर्धन मिश्रण और चरण 3 से संग्रह जैव-कण। - प्लेस थर्मल cycler में नमूने और निम्न साइकिल चालन की स्थिति का उपयोग कर नमूने बढ़ाना: 15 मिनट के लिए 75 डिग्री सेल्सियस; 11 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस; 20 सेकंड और 3 मिनट के लिए 59 डिग्री सेल्सियस के लिए 94 डिग्री सेल्सियस के 34 चक्रों; 10 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस; और 4 डिग्री सेल्सियस पकड़।
- लघु अवधि के भंडारण के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर प्रवर्धन उत्पादों।
5. उत्पाद जांच - केशिका वैद्युतकणसंचलन (सीई)
- एक 96 अच्छी तरह से थाली में, (सामग्री देख, 9.7 μl विआयनीकृत formamide और 0.3 μl आकार मानक) सीई चल मिश्रण के 10 μl जोड़ें। प्रत्येक अच्छी तरह से परिलक्षित उत्पाद या allelic सीढ़ी के एक μl जोड़ें।
चेतावनी: Formamide एक संभावित उत्परिवर्तजन है और उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनने जबकि एक रासायनिक हुड में नियंत्रित किया जाना चाहिए। - प्रवर्धन किट मैनुअल या internall में निर्माता द्वारा निर्दिष्ट electrophoretic शर्तों का उपयोग करेंY शर्तों पुष्टि।
- एसटीआर विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ कच्चे डेटा का विश्लेषण।
Representative Results
एक पुरुष दाता द्वारा पहने एक शर्ट के कॉलर (100%) पॉलिएस्टर से बरामद किया गया है कि व्यक्ति और clumped bioparticles के प्रतिनिधि छवियों चित्रा 6 (व्यक्तिगत bioparticles) और चित्रा 7 (clumped bioparticles) में दिखाया जाता है। bioparticles यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग शर्ट के कॉलर से बरामद किया गया: trypan नीले, एक टंगस्टन सुई और पानी में घुलनशील चिपकने का उपयोग bioparticle नमूनों के संग्रह के साथ बरामद bioparticles का सीधा संपर्क, धुंधला के माध्यम से जेल-फिल्म के लिए शर्ट के कॉलर से bioparticles का स्थानांतरण और 5 μl सूक्ष्म मात्रा सेल / एसटीआर प्रवर्धन का उपयोग कर। एसटीआर विश्लेषण 6 और 7 के एक व्यक्ति को छूने के डीएनए मद (20 एकल / व्यक्तिगत bioparticles और 20 clumped bioparticles) से विश्लेषण किया जाएगा कि bioparticles का एक विशिष्ट नमूने का प्रतिनिधित्व करते हैं आंकड़े। प्रत्येक छवि में एकत्र bioparticle (एस) (माइक्रोन में) की लंबाई और चौड़ाई माप के साथ लेबल रहे हैं। PERCएकत्र bioparticle (ओं) में से प्रत्येक से बरामद एसटीआर alleles की entage सबूत के साथ इस प्रकार bioparticles से प्राप्त होने की उम्मीद की जा सकती है कि सफलता के चर डिग्री प्रदर्शित करने के लिए प्रत्येक व्यक्ति के लिए छवि पर प्रदान की जाती है। आंकड़े 6 और 7 में देखा जा सकता है के रूप में स्पर्श डीएनए नमूनों से बरामद bioparticles, मोटे तौर पर मृत या केरेटिनकोशिकाओं मर रहा है और इसलिए एक प्रमाण एसटीआर प्रोफाइल एकत्र प्रत्येक bioparticle से प्राप्त नहीं है। इस कमीज के कॉलर नमूने के लिए, एसटीआर प्रोफाइल के व्यक्तिगत bioparticles की 14/20 (70%) से प्राप्त की है और 15/20 (75%) bioparticles clumped थे। हालांकि, बरामद प्रोफाइल के प्रत्येक प्रमाण के मूल्य में पर्वतमाला: clumped bioparticle प्रोफाइल के लिए अलग-अलग bioparticles प्रोफाइल और 3-100% एलील वसूली के लिए 3-97% एलील वसूली। कारण सफलता दर में परिवर्तनशीलता के लिए, प्रत्येक स्पर्श डीएनए मद से कई bioparticles के संग्रह की सिफारिश की है। यह एक अत्यधिक probati प्राप्त करने का एक बेहतर मौका सुनिश्चित करता हैएसटीआर प्रोफाइल किया है।
शर्ट के कॉलर से व्यक्तिगत bioparticle नमूनों में से एक से प्राप्त एसटीआर प्रोफाइल 8 चित्रा में दिखाया गया है (प्रोफ़ाइल उत्पन्न जहाँ से bioparticle बाईं ओर दिखाया गया है)। लगभग एक पूर्ण एसटीआर प्रोफाइल (28 से 30 alleles के बाहर, एक ठिकाना, संदर्भ प्रोफाइल की तुलना द्वारा सत्यापित प्राप्त प्रोफाइल की सटीकता बाहर ड्रॉप) इस व्यक्ति bioparticle से प्राप्त हुई थी। प्राप्त प्रोफाइल यथोचित संतुलित अंतर-ठिकाना शिखर हाइट्स के साथ उच्च गुणवत्ता की है और कोई allelic बाहर ड्रॉप। Allelic बाहर ड्रॉप और असंतुलित शिखर ऊंचाई कलाकृतियों दोनों अक्सर कम टेम्पलेट डीएनए नमूनों के साथ मनाया जाता है। शर्ट के कॉलर से clumped bioparticle नमूनों में से एक से प्राप्त एसटीआर प्रोफाइल 9 चित्रा में दिखाया गया है। प्राप्त हुई थी एक पूर्ण एसटीआर प्रोफाइल (30/30 एलील, संदर्भ प्रोफाइल की तुलना द्वारा सत्यापित प्राप्त प्रोफाइल की सटीकता)। जैसा कि पहले उल्लेख, एक एसटीआर प्रोफाइल कभी से बरामद नहीं किया गया हैY bioparticle एकत्र की। एक एकल bioparticle (3% एलील वसूली, 1/30 एलील) की असफल डीएनए प्रोफाइलिंग का एक उदाहरण चित्रा 10 (व्यक्तिगत bioparticle) में दिखाया गया है। इस व्यक्ति bioparticle सफल नहीं हुआ था, वहीं इस नमूने में bioparticles के दाता की अत्यधिक प्रमाण एसटीआर प्रोफाइल को ही नमूना से बरामद अन्य bioparticles से प्राप्त किया गया। यह वही वस्तु से कई एकल कक्ष / पेड़ों का झुरमुट samplings के प्रदर्शन करने की जरूरत दिखाता है।
स्पर्श डीएनए सबूत के लिए यहाँ वर्णित विकसित 'स्मार्ट' विश्लेषण के तरीकों एकल से प्रमाण एकल स्रोत प्रोफाइल को ठीक करने के लिए सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है और विभिन्न से "clumped" bioparticles वस्तुओं और कपड़ों की मदों (जैसे, कुर्सी armrests, कार स्टीयरिंग पहियों, सेल फोन को छुआ कॉफी के कप, सिगरेट, कलम, शर्ट, शॉर्ट्स, और स्वेटर)। हालांकि, महत्वपूर्ण बात, इस दृष्टिकोण भी पुरुष डी का पता लगाने और रूपरेखा के लिए इस्तेमाल किया गया हैनकली शारीरिक संपर्क / हमला मिश्रण नमूनों में onor डीएनए (एकल स्रोत) (जैसे, यौन हमले के रूप में पीड़ित के बिस्तर के साथ एक शिकार की कलाई, गर्दन या कपड़ों, या संपर्क हथियाने अपराधी)।
चित्रा 1: bioparticle संग्रह के लिए जेल फिल्म स्लाइड तैयार करना। (ए) सफेद पीठ सुरक्षा कवर चिपकने वाला समर्थन बेनकाब करने के लिए जेल फिल्म का टुकड़ा से बाँझ चिमटी का उपयोग कर निकाल दिया जाता है। जेल-फिल्म तो फर्म के दबाव के साथ एक गिलास खुर्दबीन स्लाइड का पालन किया है। (बी) जेल फिल्म नमूना, शीर्ष स्पष्ट सुरक्षात्मक फिल्म बाँझ चिमटी का उपयोग कर निकाल दिया जाता है bioparticle संग्रह के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए तैयार है जब।
चित्रा 2: जेल का उपयोग Bioparticle संग्रहविभिन्न substrates से -film। जेल फिल्म स्लाइड सतहों की एक किस्म से bioparticles इकट्ठा करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। जेल फिल्म वस्तु या ब्याज की सतह के साथ सीधे संपर्क में रखा गया है। कोमल दबाव जेल फिल्म की सतह पर bioparticles हस्तांतरण करने के क्रम में लागू किया जाता है। (ए) पहना कपड़े आइटम (कोट के कॉलर), (ख) से bioparticles का संग्रह दिखाए जाते हैं (यात्रा कॉफी कप), और (सी) प्रत्यक्ष मानव त्वचा (पुरुष कलाई) वस्तुओं को छुआ।
चित्रा 3:। Bioparticles (पंत पैर के अंदर) एक पहने कपड़ों आइटम पर Bioparticles वस्तु की सतह के साथ सीधे संपर्क के माध्यम से जेल-फिल्म के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं। Bioparticles "गुच्छों" या (लाल तीर के साथ संकेत दिया) व्यक्ति / एकल bioparticles के रूप में पाया जा सकता है।
चित्रा 4:। जेल फिल्म स्लाइड्स पर bioparticles की वैकल्पिक धुंधला bioparticles के बेहतर दृश्य के लिए, जेल-फिल्म नमूने trypan नीले दाग के साथ दाग जा सकता है। जेल फिल्म की पूरी सतह trypan नीले (ए) द्वारा कवर किया जाता है। धुंधला के 1-2 मिनट के बाद, स्लाइड धीरे अतिरिक्त दाग स्लाइड (बी) के बंद को चलाने के लिए अनुमति देने के लिए झुका हुआ है। बाँझ पानी (सी) के साथ कोमल बाढ़ अतिरिक्त दाग को दूर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। स्लाइड हवा सूख जाने के बाद, स्लाइड उचित धुंधला (डी, ई) सुनिश्चित करने के लिए माइक्रोस्कोप के नीचे देखा जा सकता है। नोट:। नहीं सभी bioparticles (रंग में यानी, नीला) दाग दिखाई देगा यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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चित्रा 5: Bioparticle संग्रह और विश्लेषण। पानी में घुलनशील लहर मिलाप टेप की (ए) एक छोटी राशि (या "गेंद") ("चिपकने वाला") कोमल scraping द्वारा एक टंगस्टन सुई की नोक पर एकत्र किया जाता है। (बी) चिपकने वाला तो gel- को छुआ है ब्याज की bioparticles इकट्ठा करने के क्रम में फिल्म सतह। व्यक्ति या एकाधिक bioparticles एक भी चिपकने वाला गेंद के साथ एकत्र किया जा सकता है। (सी) वांछित bioparticles एकत्र किया गया है एक बार, सुई की नोक एक 0.2 मिलीलीटर पीसीआर ट्यूब में प्रवर्धन मिश्रण में रखा गया है। यह हो जाती है जब तक सुई तरल में आयोजित किया जाता है और समाधान में bioparticles की रिहाई मनाया जाता है। संग्रह की प्रक्रिया में सभी चरणों सफल bioparticle संग्रह और हस्तांतरण सुनिश्चित करने के लिए प्रदर्शन किया और माइक्रोस्कोप के नीचे देखा जाता है। एक Lar देखने के लिए यहां क्लिक करेंइस आंकड़े की प्रासंगिकता संस्करण।
चित्रा 6:। एक शर्ट के कॉलर नमूने में व्यक्तिगत bioparticles Bioparticles एक पुरुष दाता द्वारा पहने एक शर्ट के कॉलर के अंदर से जेल-फिल्म का उपयोग बरामद किए गए। bioparticles दिखाए जाते हैं trypan नीले और नमूने में पहचान बीस अलग व्यक्ति bioparticles की छवियों का उपयोग दाग रहे थे। प्रत्येक छवि में एकत्र किया गया था कि bioparticle (; एक प्रोफाइल बरामद नहीं किया गया था, जिसमें bioparticles का संकेत काले हलकों एक प्रोफाइल बरामद किया गया था, जिसमें bioparticles का संकेत लाल हलकों) की परिक्रमा कर रहा है। प्रतिशत एलील वसूली (एक संभव 30 से बाहर मनाया एलील की संख्या) एक प्रोफाइल बरामद किया गया था जिसमें से bioparticle की छवि से ऊपर दिखाया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 7: एक कमीज़ कॉलर नमूने में clumped bioparticles Bioparticles एक पुरुष दाता द्वारा पहने एक शर्ट के कॉलर के अंदर से जेल-फिल्म का उपयोग बरामद किए गए।। bioparticles दिखाए जाते हैं trypan नीले और नमूने में पहचान बीस अलग clumped bioparticles की छवियों का उपयोग दाग रहे थे। । एक प्रोफ़ाइल एक संभव 30 से बाहर प्रतिशत एलील वसूली (मनाया एलील की संख्या) बरामद नहीं किया गया था, जिसमें bioparticles का संकेत काले घेरे, प्रत्येक छवि में, एकत्र किया गया था कि bioparticle एक प्रोफाइल बरामद किया गया था, जिसमें bioparticles का संकेत (लाल हलकों की परिक्रमा कर रहा है एक प्रोफाइल बरामद किया गया था, जहां से प्रत्येक bioparticle के लिए दिखाई गई है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 8: एक पुरुष शर्ट के कॉलर से एक भी bioparticle से प्राप्त Autosomal एसटीआर प्रोफाइल एक autosomal एसटीआर प्रोफाइल 5 μl प्रत्यक्ष सेल / प्रवर्धन प्रतिक्रिया का उपयोग कर (बाईं ओर दिखाया गया है) एक एकल bioparticle से प्राप्त हुई थी।। इस प्रोफाइल की सटीकता एक दाता संदर्भ नमूना की तुलना द्वारा निर्धारित किया गया था। पंद्रह ऑटोसोमल एसटीआर लोकी और amelogenin (लिंग निर्धारण) के सह-प्रवर्धित एक भी प्रतिक्रिया में और केशिका वैद्युतकणसंचलन से अलग हो रहे हैं। परिणाम एक electropherogram यहाँ के रूप में प्रदर्शित कर रहे हैं। एलील संख्या प्रत्येक ठिकाना पर प्रत्येक चोटी से नीचे पद हैं। एक्स-अक्ष टुकड़ा आकार (आधार जोड़े, बीपी) और वाई अक्ष का प्रतिनिधित्व संकेत तीव्रता का प्रतिनिधित्व करता है। (RFU रिश्तेदार प्रतिदीप्ति इकाइयों, प्रत्येक इसी एलील संख्या के तहत प्रदान की गई) का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें यह आंकड़ा।
चित्रा 9: एक पुरुष शर्ट के कॉलर से एक clumped bioparticle से प्राप्त Autosomal एसटीआर प्रोफाइल एक autosomal एसटीआर प्रोफाइल 5 μl प्रत्यक्ष सेल / प्रवर्धन प्रतिक्रिया का उपयोग कर (बाईं ओर दिखाया गया है) एक clumped bioparticle से प्राप्त हुई थी।। इस प्रोफाइल की सटीकता एक दाता संदर्भ नमूना की तुलना द्वारा निर्धारित किया गया था। पंद्रह ऑटोसोमल एसटीआर लोकी और amelogenin (लिंग निर्धारण) के सह-प्रवर्धित एक भी प्रतिक्रिया में और केशिका वैद्युतकणसंचलन से अलग हो रहे हैं। परिणाम एक electropherogram यहाँ के रूप में प्रदर्शित कर रहे हैं। एलील संख्या प्रत्येक ठिकाना पर प्रत्येक चोटी से नीचे पद हैं। (; प्रत्येक इसी एलील संख्या के तहत प्रदान की RFU रिश्तेदार प्रतिदीप्ति इकाइयों) एक्स अक्ष संकेत तीव्रता का प्रतिनिधित्व करता है टुकड़ा आकार (आधार जोड़े, बीपी) और वाई अक्ष का प्रतिनिधित्व करता है।पीजी "लक्ष्य =" _blank "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 10:। एक एकत्र bioparticle से प्राप्त एक ऑटोसोमल एसटीआर प्रोफाइल प्राप्त करने के लिए एक विफलता का उदाहरण छोड़ दिया पर दिखाया गया व्यक्ति bioparticle एक शर्ट के कॉलर जेल फिल्म नमूना से एकत्र किया गया था। (सही पर दिखाया गया है) जिसके परिणामस्वरूप एसटीआर प्रोफाइल से देखा जा सकता है, (संभव 30 से बाहर) केवल एक एलील प्राप्त हुई थी। एलील संख्या प्रत्येक ठिकाना पर प्रत्येक चोटी से नीचे पद हैं। एक्स-अक्ष संकेत तीव्रता का प्रतिनिधित्व करता है टुकड़ा आकार (आधार जोड़े, बीपी) और वाई अक्ष का प्रतिनिधित्व करता है। (RFU रिश्तेदार प्रतिदीप्ति इकाइयों, प्रत्येक इसी एलील संख्या के तहत प्रदान की) यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Discussion
यहाँ हम संग्रह और स्पर्श डीएनए सबूत से बरामद bioparticles की बढ़ी आनुवांशिक विश्लेषण के लिए विधियों का वर्णन किया है। छुआ वस्तुओं और सतहों, पहना कपड़े आइटम या सीधे मानव त्वचा से जेल फिल्म के माध्यम से जैविक सामग्री (यानी, bioparticles) की 1) संग्रह, बरामद जैविक सामग्री का 2) सूक्ष्म परीक्षा क्षमता का संग्रह सुनिश्चित करने के लिए: विकसित दृष्टिकोण निम्नलिखित शामिल मानव जैविक सामग्री, और एक पानी में घुलनशील चिपकने का उपयोग एकल या कुछ bioparticles की 3) micromanipulation, और एक microvolume (5 μl) एक कदम सेल / प्रवर्धन प्रतिक्रिया का उपयोग कर एकत्र bioparticles की 4) ऑटोसोमल डीएनए एसटीआर रूपरेखा। एक एक कदम बंद ट्यूब प्रतिक्रिया का उपयोग अतिरिक्त नमूना जोड़तोड़ या अन्य प्रतिक्रिया ट्यूबों के लिए स्थानांतरण से प्रदूषण और नमूना नुकसान के लिए क्षमता कम कर देता है। बढ़ाया एक कदम microvolume (5 μl) सेल / एसटीआर प्रवर्धन प्रतिक्रियाओं पूर्ण या probativ की वसूली के लिए परमिटई एसटीआर एकल या कुछ bioparticles के दाता की प्रोफाइल। यह दृष्टिकोण एकल और बहु स्रोत स्पर्श डीएनए सबूत (जैसे, पहना कपड़े आइटम और अन्य घरेलू सामान, छुआ / संभाला वस्तुओं और सतहों, त्वचा / त्वचा मिश्रण) से ही स्रोत एसटीआर प्रोफाइल को प्राप्त करने के लिए विकसित किया गया था। यह सफलतापूर्वक नकली शारीरिक हमला मिश्रण नमूनों में पुरुष दाता का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया है।
इस दृष्टिकोण के आगे इस तरह के हमलावर से केवल कुछ bioparticles शिकार से जैविक सामग्री की भारी राशि के बीच उपस्थित होना होगा, जिसमें उसकी / उसके हमलावर scratching शिकार, के रूप में अतिरिक्त शरीर के तरल पदार्थ / ऊतक मिश्रण परिदृश्यों में मूल्यांकन किया जा सकता है। वर्तमान अध्ययन में विकसित इस दृष्टिकोण एकल bioparticle स्तर पर विश्लेषण परमिट के बाद से ही, यह एक मध्यस्थ के एक surfa पर एक डीएनए प्रोफ़ाइल स्थानान्तरण जिसमें माध्यमिक हस्तांतरण 14-19 की प्रकृति और सीमा की बेहतर समझ हासिल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैएक और सतह वस्तु या व्यक्ति से 20 सीई, वस्तु या व्यक्ति। माध्यमिक हस्तांतरण के विश्लेषण के लिए एक अंधे-swabbing दृष्टिकोण माध्यमिक दाता से सामग्री की मात्रा का पता लगाने की पहचान करने में विफल हो सकता है। यहाँ विकसित दृष्टिकोण एकल या कुछ bioparticles का विश्लेषण परमिट और इसलिए परिणाम प्राथमिक दाता से जैविक सामग्री की भारी राशि की उपस्थिति से चकित नहीं हैं। ऐसे अपराधी से त्वचा कोशिकाओं की मात्रा का पता लगाने के सकारात्मक पहचान महत्वपूर्ण हो सकता है, जहां योनि के डिजिटल पैठ शामिल उन के रूप में भी यौन उत्पीड़न के मामलों में ट्रेस जैविक सामग्री के विश्लेषण के लिए निहितार्थ हो सकता है इस काम में विकसित तरीके कि यौन संपर्क स्थापित करने के लिए आई।
जेल फिल्म नमूना से bioparticles के संग्रह के लिए कठिन और जटिल जोड़तोड़ को शामिल नहीं करता है, सु सुनिश्चित करने के लिए महान देखभाल के साथ प्रदर्शन करने की जरूरत है कि इस प्रक्रिया में महत्वपूर्ण कदम उठाए हैंनीचे की ओर प्रतिक्रिया पोत के लिए bioparticles की ccessful हस्तांतरण। पानी में घुलनशील चिपकने के साथ bioparticles के संग्रह, इस्तेमाल किया चिपकने वाला "गेंद" के आकार पर निर्भर करता है। यानी, उच्च वृद्धि (~ 200-300X) में stereomicroscope के हित का केवल bioparticles एकत्र कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए (माइक्रोस्कोप में देखा जाना चाहिए दोनों जैविक और गैर जैविक सामग्री (जैसे, फाइबर, अन्य मलबे) शामिल हो सकते हैं जो अतिरिक्त आसपास के सामग्री इकट्ठा करने की क्षमता है। अनायास ही अतिरिक्त bioparticles का संग्रह admixed डीएनए प्रोफाइल की वसूली में परिणाम हो सकता है। गैर जैविक सामग्री का संग्रह कई bioparticles एक ही चिपकने वाला "गेंद" के साथ एकत्र कर रहे हैं, तो सूक्ष्म मात्रा सेल में अवरोधकों को पेश हो सकता है / एसटीआर प्रतिक्रियाओं।, पहले से एकत्र bioparticles चिपकने से स्वाधीन बनने के लिए एक संभावित है। इस बार नहीं मनाया जाता है, लेकिन हो सकता है जब bioparticl की बड़ी संख्यातों एकत्र कर रहे हैं (उदाहरण के लिए, 50 से अधिक) एक ही चिपकने वाला "गेंद" के साथ। Bioparticles की एक बड़ी संख्या को निशाना बनाया जाता है, तो यह कम bioparticles के कई संग्रहों बना रहे हैं लेकिन सभी एक ही 0.2 मिलीलीटर ट्यूब में हस्तांतरित की सिफारिश की है। Bioparticles एकत्र किया गया है एक बार, देखभाल खुर्दबीन मंच से जेल फिल्म स्लाइड और सुई की नोक परेशान नहीं है कि इतनी 0.2 मिलीलीटर ट्यूब की नियुक्ति को हटाने के दौरान लिया जाना चाहिए। 0.2 मिलीलीटर ट्यूब के नीचे प्रवर्धन मिश्रण में सुई की नोक के प्लेसमेंट के दौरान, सुई की नोक ट्यूब के पक्षों पर माल की हानि से बचने के क्रम में ट्यूब के पक्ष के साथ संपर्क बनाने नहीं होना चाहिए। चिपकने के solubilization आम तौर पर तेजी है जबकि (~ 30 सेकंड या उससे कम चिपकने वाला "गेंद" के आकार पर निर्भर करता है) कर सकते हैं और सूक्ष्म परीक्षण के दौरान निगरानी, सुई की नोक धीरे धीरे कि पूरा सुनिश्चित करने के लिए प्रवर्धन मिश्रण से हटा दिया जाना चाहिए solubilizationचिपकने के हासिल किया गया है। चिपकने वाला पूरी तरह से भंग नहीं किया है, तो सुई पूरा विघटन अनुमति देने के लिए तरल लौटा जा सकता है।
यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल फॉरेंसिक जैविक साक्ष्य से bioparticles और मानव कोशिकाओं के साथ प्रयोग के लिए अनुकूलित किया गया है। चयनित lysis बफर चयनित डीएनए एसटीआर प्रवर्धन किट के साथ संगत है। उपयुक्त विकल्प सेल बफ़र्स वहाँ हो सकता है, बहाव के विश्लेषण के साथ सेल और अनुकूलता के मामले में उनकी दक्षता उपयोगकर्ता द्वारा सत्यापित किया जाना चाहिए। साथ ही, इस प्रोटोकॉल में वर्णित एसटीआर प्रवर्धन किट और प्रवर्धन चक्र संख्या एक या कुछ bioparticles साथ प्रयोग के लिए अनुकूलित किया गया है। रिपोर्ट की वृद्धि की मजबूती और संवेदनशीलता के साथ एक अगली पीढ़ी एसटीआर प्रवर्धन किट का चयन किया गया और एक या कुछ bioparticles से उच्च गुणवत्ता वाले एसटीआर प्रोफाइल के वसूली में परिणाम के लिए प्रदर्शन किया गया है। जबकि अलग-अलग सिफारिश amplifi के साथ कई अन्य एसटीआर किट,कटियन चक्र नंबर, वे उपयुक्त संवेदनशीलता के अधिकारी नहीं हो सकता है और इसलिए ठीक से इन प्रोटोकॉल में उपयोग करने से पहले मूल्यांकन करने की आवश्यकता होगी, उपलब्ध हैं।
एकल या कुछ bioparticles से वसूली एसटीआर प्रोफाइल के लिए वर्णित विधि के सफल प्रयोग के बावजूद, प्रोफाइल वसूली की सफलता की दर 100% नहीं किया जाएगा। इसलिए, कुछ नमूने के लिए एक सीमित आंशिक डीएनए प्रोफ़ाइल या कोई प्रोफाइल देखा जा सकता है। इस वजह से निर्णायक नेत्रहीन सेलुलर सामग्री के रूप में सबसे bioparticles की पहचान करने में असमर्थता के लिए टाला नहीं जा सकता, प्रतिक्रिया पोत में स्थानांतरण से पहले एकत्र bioparticles या चिपकने से नमूना सामग्री के नुकसान में परमाणु सामग्री के संभावित अपमानित राज्य। इसलिए, प्रत्येक स्पर्श डीएनए आइटम के लिए एक एकल bioparticle नमूने के विश्लेषण की सिफारिश नहीं है। हम अक्सर एक व्यक्ति जेल फिल्म नमूना से 20 नमूना सेट इकट्ठा करने और एक उपयुक्त एसटीआर प्रोफाइल प्राप्त नहीं है, तो जरूरत के रूप में अतिरिक्त नमूना सेट एकत्रित करेगा। टीmicrovolume प्रतिक्रियाओं (एक मानक प्रतिक्रिया मात्रा के रूप में एक समान या कम लागत के लिए अतिरिक्त नमूने एकत्र करने का अवसर प्रदान करते हैं, हालांकि संग्रह के लिए वह केवल सीमा, जेल-फिल्म नमूना (और विश्लेषण की संभावना लागत पर मौजूद जैविक सामग्री की राशि है उदाहरण के लिए, 25 μl)।
विकसित डीएनए प्रोफाइलिंग विधियों यहाँ का वर्णन लक्षण वर्णन, विश्लेषण और स्पर्श डीएनए नमूनों से बरामद ट्रेस जैविक सामग्री की व्याख्या करने के लिए एक आणविक आधारित दृष्टिकोण प्रदान करते हैं। हालांकि, जैविक सामग्री का दाता के दाता (यानी, एसटीआर प्रोफाइल) का निर्धारण करने के लिए इसके अलावा में बरामद bioparticles से प्राप्त किया जा सकता है कि अतिरिक्त आनुवंशिक जानकारी है। मूल के ऊतक या शरीर के तरल पदार्थ के स्रोत (जैसे, लार बनाम त्वचा) एक आपराधिक जाँच के लिए महत्वपूर्ण प्रासंगिक जानकारी उपलब्ध करा सकता है। इस तरह के एक दृढ़ संकल्प के बिना, मूल के ऊतक स्रोत की अस्पष्टता विस्फोटक जा सकता हैअपराध के वैकल्पिक परिस्थितियों के रूप में ited (जैसे, शरीर के तरल पदार्थ जमा किया गया हो सकता है कि कैसे) का सुझाव दिया जा सकता है। यहाँ वर्णित bioparticle संग्रह और अलगाव प्रोटोकॉल (जैसे, मुख, योनि) एक ऊतक स्रोत की पहचान के लिए उपयोग में सूक्ष्म मात्रा प्रतिलेखन (आरटी) रिवर्स शामिल है कि रणनीति (mRNA के 21-30 रूपरेखा) bioparticles या अन्य कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और प्रवर्धन प्रतिक्रियाओं। आगे अनुकूलन के साथ यह भी स्पर्श डीएनए सबूत से bioparticles सहित एक ही नमूना, से सेल प्रकार पहचान (आरएनए) और एसटीआर प्रोफाइलिंग की अनुमति के लिए एक डीएनए / आरएनए सह अलगाव रणनीति विकसित करने के लिए संभव हो सकता है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SealRite 1.5 ml natural microcentrifuge tubes, sterile | USA Scientific | 1615-5510 | numerous alternative suppliers are available, but tubes should be sterile |
| 0.2 ml PCR tubes with flat cap, natural | Phenix Research | MPX-200F | or equivalent |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666 and/or 06-666-11C | |
| Alcohol prep pads | Fisher Scientific | 06-669-62 | alternative is 06-665-24 (Fisher Sci); canister of larger alcohol wipes rather than individual pads |
| Sterile water | 18.2 MΩ, autoclaved | ||
| Glass microscope slides, frosted, 3" x 1": 1 mm | Fisher Scientific | 12-544-3 | alternative brands or sizes are acceptable |
| Disposable transfer pipet | Fisher Scientific | 13-711-9D | alternatives are acceptable |
| Trypan blue solution | Sigma | T8154 | |
| Pipets: 0.2-2, 2-20, 10-100, 100-1,000 μl | various | ||
| Sterile, aerosol-resistant pipet tips | various | ||
| Mini-centrifuge | various | ||
| Stereomicroscope | Leica | M205C | others are suitable, but must be capable of magifications up to 350X |
| GeneAmp PCR system 9700 thermal cycle (silver or gold block) | Life Technologies | N8050200 or 4314878 | other models and manufacturers can be used, but performance with the STR amplification kit must be verified |
| 3130 Genetic Analyzer | Life Technologies | 3130-01 | alternatives: 310 or 3500 Genetic Aanlyzers (Life Technologies) |
| GeneMapper software | Life Technologies | various | various versions of the software are available and can be used |
| WF Gel-Film , x8 retention level | Gel-Pak | WF-40-x8-A | 4" x 4" wafer film; can be ordered in other size specifications |
| Double sided tape | various | ||
| Glass block, 3" x 1.5" x 3/8" | McCrone Microscopes and Accessories | 370-2 | or equivalent |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tungsten needle with holder | McCrone Microscopes and Accessories | 106 | |
| 3M water soluble wave solder tape, 5414 transparent | Allied Electronics | 70113977 | |
| Lysis buffer (forensicGEM Saliva, Zygem) | VWR | 95043-992 | Lysis buffer is prepared in 10 μl portions (prepare additional master mix portions as needed to accommodate the desired number of samples). 1.5 μl is used for each sample. To prepare 10 μl of lysis buffer (sufficient for ~6 samples): 6.9 μl sterile water, 2.1 μl 10x buffer - blue, 1 μl forensicGEM. |
| STR Amplification kit, AmpFlSTR Identifiler Plus PCR amplification kit | Life Technologies | 4427368 | Alternative STR amplification kits can be used, but performance would have to be verified by user. The amplification mix is prepared as follows (volumes per sample): 2.2 μl PCR reaction mix, 1.1 μl Primer set, 0.2 μl (1U) AmpliTaq Gold DNA polymerase. A master mix sufficient for the desired number of samples should be prepared. 3.5 μl of the prepared mix is added to the 0.2 ml tube for bioparticle collection. |
| AmpliTaq Gold DNA polymerase | Life Technologies | N808-0245 | |
| HiDi formamide | Life Technologies | 4311320 | |
| GeneScan 500 LIZ size standard | Life Technologies | 4322682 | |
| 96 well optical reaction plates | Life Technologies | N8010560 | |
| Plate septa, 96 well | Life Technologies | 4315933 | |
| Performance-optimized polymer, POP-7 | Life Technologies | 4363785 | Alternatives such as POP-4 are acceptable |
References
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